СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (БАВ) НА ТКАНЬ МОЗГА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/82 G01N33/483 

Изобретение относится к физиологии, в частности к способу определения воздействия белка на ткань мозга в эксперименте in vitro.

Известен способ определения воздействия БАВ, белка на ткани мозга [1], принятый за прототип, включающий подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров, после инкубации в среде с исследуемым белком, и определению воздействия по сопоставлению параметров исходных и после воздействия.

Цель - определение воздействия на ткань мозга БАВ - альфа-Токоферол-ацетат (витамин Е) при моделировании геморрагического инсульта.

Сущность предложенного способа определения воздействия БАВ на ткань мозга, включающего подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации срезов в среде с исследуемым веществом и определение воздействия по сопоставлению параметров исходных с последующими, состоит в исходном взвешивании срезов, инкубации части срезов в среде с альфа-Токоферол-ацетатом десятипроцентного раствора объемом 0,7 мг/мл, нагретым до 37±0,2°С и растворенным в Tween-20 в инкубационной среде объемом 1 мл в течение 30 мин, последующей инкубации всех срезов в аутокрови в течение 360 мин, взвешивании срезов, инкубированных только в аутокрови, обсушивании остальных фильтровальной бумагой и взвешивании обсушенных срезов. При сопоставлении весов срезов, инкубированных только с аутокровью с исходными, определяют прибавку их веса. При сопоставлении обсушенных срезов с весами срезов, не подвергавшихся воздействию альфа-Токоферол-ацетатом, определяют способность альфа-Токоферол-ацетата защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте.

Установлено, что использование в клинических условиях альфа-Токоферол-ацетата в качестве нейропротективного вещества для лечения нервных клеток от последствий геморрагического и ишемического инсультов является неэффективным. Во всех случаях используется жирорастворимая форма альфа-Токоферол-ацетата, поскольку активность альфа-Токоферол-ацетата снижается в жирорастворимой форме за счет того, что плохо усваивается в организме и, соответственно, не проявляет нейропротективных качеств при развитии геморрагического инсульта.

Способ поясняется примером определения воздействия на ткань мозга альфа-Токоферол-ацетата.

10% раствор альфа-Токоферол-ацетата нагревали до 37±0,2°С и растворяли в Tween-20 (неионный детергент) для получения водорастворимой формы. Срезы выдерживали в инкубационной среде с подготовленным альфа-Токоферол-ацетатом в течение 30 мин, это время установлено эмпирически. Срезы выдерживали в аутокрови в течение 360 мин, указанное время соответствует «терапевтическому окну», после которого наступают необратимые нарушения функционирования нервных клеток.

Таблица 1 Воздействие альфа-Токоферол-ацетата на ткань мозга Вес среза при различных видах их инкубации Средний вес среза (мг) % изменения веса по отношению к исходному Вес среза исходный после их изготовления 20 100% (n=8) Вес среза после инкубации в физиологическом растворе (1 мл) 22 110% (n=8) Вес среза после инкубации в аутокрови (2 мл) 31 155% (n=12) Вес среза после инкубации с альфа-Токоферол-ацетатом (1 мл) и в аутокрови (2 мл) 21 105% (n=6)

Как видно из представленных данных в таблице, кровь вызывает значительное набухание нервных клеток, что свидетельствует о развитии процессов воспаления в них. Однако предварительное воздействие на нервные клетки водорастворимой формы альфа-Токоферол-ацетата до действия аутокрови защищает их от набухания и, следовательно, от развития воспалительных процессов. Это свидетельствует о выраженных антивоспалительных свойствах этого вещества при моделировании геморрагического инсульта.

Отметим, что действием альфа-Токоферол-ацетата процесс набухания и увеличения веса срезов ингибировали и он составлял не более 5% по сравнению с исходным весом. Статистически эти различия недостоверны: U=7, р≥0,05. Следовательно, альфа-Токоферол-ацетат, подготовленный предложенным способом, является эффективным нейропротективным, антивоспалительным препаратом.

Необходимо отметить, что альфа-Токоферол-ацетат имеет эндогенное происхождение, это качество придаст дополнительное преимущество этому веществу при его использовании в качестве антигеморрагического средства при моделировании геморрагического инсульта.

Изобретение позволяет рекомендовать использование альфа-Токоферол-ацетата в качестве активного компонента к антигеморрагическому препарату для проведения преклинических испытаний.

Литература

1. Мокрушин А.А., Павлинова Л.И., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Белок теплового шока (Hsp70) протектирует активность глутаматергической синаптической передачи в обонятельной коре мозга крыс in vitro от тяжелой аноксии // ДАН, 2004, т.394, №3, с.419-422. Прототип.

Изобретение относится к физиологии и фармацевтике и может быть использовано при изучении патофизиологических процессов в тканях мозга. Для осуществления способа подготавливают переживающие срезы мозга, регистрируют исходные и последующие параметры после инкубации срезов в среде с исследуемым веществом и определяют воздействие по сопоставлению параметров исходных и после воздействия тестируемого вещества. Для чего проводят исходное взвешивание срезов, инкубируют часть срезов в среде с десятипроцентным раствором альфа-Токоферол-ацетата объемом 0,7 мг/мл, нагретым до 37±0,2°С и растворенным в Tween-20 в инкубационной среде объемом 1 мл в течение 30 мин. Затем инкубируют все срезы в аутокрови в течение 360 мин. После чего взвешивают срезы, инкубировавшиеся только в аутокрови. Остальные срезы обсушивают фильтровальной бумагой и потом взвешивают. Определяют изменение веса срезов от воздействия только аутокровью и от воздействия альфа-Токоферол-ацетата, перед аутокровью. По изменениям веса определяют антивоспалительное воздействие альфа-Токоферол-ацетата при смоделированном геморрагическом инсульте. Использование изобретения позволяет определять нейропротективные, антивоспалительные свойства альфа-Токоферол-ацетата при моделировании геморрагического инсульта. 1 табл.

Способ определения воздействия биологически активного вещества (БАВ) на ткань мозга, включающий подготовку переживающих срезов мозга, регистрацию исходных и последующих параметров после инкубации срезов в инкубационной среде с тестируемым веществом, определение воздействия по сопоставлению параметров исходных и после воздействия веществом, отличающийся тем, что
исходно взвешивают срезы;
готовят десятипроцентный раствор альфа-Токоферол-ацетата объемом 0,7 мг/мл;
нагревают раствор до 37±0,2°С;
добавляют в раствор Tween-20 до полного растворения альфа-Токоферол-ацетата;
инкубируют часть срезов в инкубационной среде с альфа-Токоферол-ацетатом в течение 30 мин;
инкубируют все срезы в аутокрови в течение 360 мин;
обсушивают срезы фильтровальной бумагой и взвешивают инкубировавшиеся только в аутокрови;
остальные срезы обсушивают фильтровальной бумагой и после этого взвешивают;
определяют прибавки веса при сопоставлении веса срезов после инкубации с исходными;
определяют способность альфа-Токоферол-ацетата защищать клетки мозга от развития в них воспалительного процесса при смоделированном геморрагическом инсульте при сопоставлении прибавок веса обсушенных срезов с прибавками веса срезов, не подвергавшихся воздействию альфа-Токоферол-ацетата.