КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Mtp, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2009 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan- A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) и мутированные антигены (MUM-1, CDK4, (β-катенин gpl00-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов, иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентные вакцины), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт.[3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин. Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Mtp из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 705Д.

Родословная клеточной линии mel Mtp

Линия клеток получена из опухолевого образца пациентки М.Т.Б., и/б 01/19253, находившейся на лечении в 2002 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи левого бедра. Материал получен при удалении подкожного метастатического узла правой подмышечной области. Предыдущее лечение: хирургическое, химиотерапия, иммунотерапия.

Получение клеточной линии mel Mtp

Опухолевая ткань получена хирургическим путем при удалении метастазов кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки mel Mtp

Клеточная линия mel Mtp характеризуется преимущественно клетками веретенообразной, вытянутой удлиненной и отросчатой округлой формы. Цитоплазма клеток окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности, ядра овальные, вытянутой, округлой и неправильной формы с грубозернистым строением хроматина, содержат одно или несколько ядрышек. Имеются двух ядерные и гигантские многоядерные клетки, содержащие до четырех ядер. Встречаются митозы.

Кариологическая характеристика mel Mtp

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски. Хроматиновые нити и утолщения в большинстве клеток являются характерными для интерфазных ядер. Небольшая часть клеток находится в профазе и метафазе. Проанализирована 41 метафаза. Число хромосом колеблется от 61 до 71, т.е. модальное число хромосом соответствует триплоидному набору (3n). Кариотип не соответствует стандартному набору не только по числу хромосом, но и по их структуре. Во всех клетках обнаружен дополнительный хромосомный материал на коротких плечах двух хромосом 1 различной длины, на длинном плече хромосомы из группы В (4 или 5 хромосомы), а также на коротком плече 14 хромосомы. Следовательно, речь идет о стабильном измененном хромосомном наборе во всей культуре. Происхождение дополнительного хромосомного материала можно установить только с помощью молекулярно-цитогенетических методов.

Культуральные свойства mel Mtp

Клеточная линия mel Mtp культивируется в питательной среде RPMI (80%), эмбриональной телячьей сыворотке 20%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс/мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс/мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3,6-4,6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии mel Mtp

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel Mtp. Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мм L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 15 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Mtp

Полученная клеточная линия mel Mtp, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР(полимеразно-цепной реакции) анализа, была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости).

Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinaza, HMW. Раково-тестикулярный маркер-MAGE-3, который может быть экспрессирован на опухолях различного гистогенеза, исследован в реакции ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Полученные данные отражены в таблице.

Экспрессия антигенов на клеточной линии mel Mtp Дифференцировочные Антигены Раково-тестикулярные антигены Антигены гистосовместимости CD63 положит. MAGE-3 положит. HLA(I класс) положит. НМВ45 отр.     HLA-DR(II класс) положит. MelanA отр.         Tyros отр.         HMW положит.        

Как следует из таблицы, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров: CD63 и HMW, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Положительная экспрессия раково-тестикулярного маркера MAGE-3 соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Уникальной особенностью данной линии является наличие антигенов гистосовместимости первого и второго класса, что обуславливает повышение иммуногенности за счет представления опухолевых антигенов непосредственно CD4 и CD8 клеткам.

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека mel Mtp имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов (CD63, HMW) и раково-тестикулярного - (MAGE-3), а также молекул гистосовместимости первого и второго класса, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований.

Список литературы

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25:1-54.]

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149: 659-663, 1993.

3. Morton D.L. et. al. Ann N Y Acad Sci. 1993; 690:120.

4. Sondak V.K. Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/ Semin cancer Biol. 2003. Dec. l3(6): 409-15.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Получена клеточная линия меланомы человека mel Mtp, которая хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РКККК(П) 705Д. Изобретение может быть использовано для создания противоопухолевых вакцин. 1 табл.

Клеточная линия меланомы человека mel Mtp, используемая для создания противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РКККК(П) 705 Д.