КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel IL, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2006 года по МПК C12N5/06 A61K35/12 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2287577C1

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2), и мутированные антигены (MUM-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для разработки вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентные вакцины), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт. [3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel P из опухолевого образца диссеминированной меланомы человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК (П) 688Д.

Родословная клеточной линии mel IL.

Линия клеток получена из опухолевого образца пациента И.А.И., с диагнозом диссеминированная меланома кожи живота; образец представляет метастаз в мягкие ткани грудной клетки. До забора материала больной проведено хирургическое, химиотерапевтическое лечение.

Получение клеточной линии mel IL.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем при удалении метастазов кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки mel IL.

mel IL характеризуется присутствием полиморфных меланомных клеток округлой и веретенообразной формы и множественных мультицентричнообразованных зон роста округлых клеток гиперхромными ядрами, содержащими 1-2 нуклеолы. Цитоплазма относительно обильная с окраской от базофильной до светло-голубой с заметным просветлением вокруг ядер. Отмечаются немногочисленные 2-х и гигантские многоядерные, многочисленные митозы.

Кариологическая характеристика mel IL.

Число хромосом в клетке от 41 до 59. Мода 56 хромосом. Постоянные маркеры: m1, m2, m3, m4, m5, m7, m8, m9.

Культуральные свойства mel IL

Клеточная линия mel P культивируется в питательной среде RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см2 в 5 мл среды засевают 1×106 клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня.

При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1.

При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, 10%ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см2. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии mel IL

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel IL.

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм3 в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см2 в 5 мл среды засевали 1×106 клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 15 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel IL.

Полученная клеточная линия mel IL, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР (полимеразно-цепной реакции) анализа была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости). Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы нами с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinaza, HMW. Раково-тестикулярный маркер-MAGE-3, который может быть экспрессирован на опухолях различного гистогенеза, исследован в реакции ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Полученные данные отражены в таблице 1.

Таблица 1
Экспрессия антигенов на клеточной линии mel IL.
Дифференцировочные АнтигеныРаково-тестикулярные АнтигеныАнтигены гистосовместимостиCD63положитMAGE-3положитHLA (I класс)положитНМВ45положитHLA-DR (II класс)отрMelanAположитTyrosinazaположитHMWположит

Как следует из табл. 1, данная клеточная линия характеризуется широкой экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров: CD63, НМВ45, HMW, MelanA, Tyrozinaza, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Положительная экспрессия раково-тестикулярного маркера MAGE-3 соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого класса (HLA).

Таким образом, данная клеточная линия меланомы человека mel IL имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличие дифференцировочных антигенов (CD63, НМВ45, HMW, MelanA, Tyrozinaza) и раково-тестикулярного - (MAGE-3), что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Список литературы

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25:1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma. J. Urol. 149:659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.

4. Sondak V.K., Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine / Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13(6):409-15.

Похожие патенты RU2287577C1

название год авторы номер документа
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Kor, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2005
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Морозова Лидия Федоровна
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Демидов Лев Вадимович
  • Козлов Алексей Михайлович
  • Ларин Сергей Сергеевич
  • Георгиев Георгий Павлович
  • Ворожцов Георгий Николаевич
  • Гнучев Николай Васильевич
RU2287578C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel P, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2005
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Морозова Лидия Федоровна
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Демидов Лев Вадимович
  • Палкина Татьяна Николаевна
  • Козлов Алексей Михайлович
  • Ларин Сергей Сергеевич
  • Георгиев Георгий Павлович
  • Ворожцов Георгий Николаевич
  • Гнучев Николай Васильевич
RU2287575C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel H, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2009
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
RU2402604C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Gus, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2008
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
RU2373280C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Ch, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2008
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
RU2373279C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Si, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2008
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
RU2363734C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Ibr, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2005
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Морозова Лидия Федоровна
  • Бережной Алексей Евгеньевич
  • Козлов Алексей Михайлович
  • Ларин Сергей Сергеевич
  • Георгиев Георгий Павлович
  • Ворожцов Георгий Николаевич
  • Гнучев Николай Васильевич
RU2287576C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Rac, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2009
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
RU2402602C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Bgf, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2008
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
  • Самойленко Игорь Вячеславович
RU2390557C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Mtp, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2008
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Демидов Лев Вадимович
  • Киселев Сергей Львович
  • Бурова Ольга Семеновна
  • Морозова Лидия Федоровна
RU2360963C1

Реферат патента 2006 года КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel IL, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению новых клеточных линий, и может быть использовано для создания противоопухолевых вакцин. Получена новая клеточная линия меланомы человека mel IL, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 686Д. Полученная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров - CD63, НМВ45 и HMW, MelanA, Tyrozinaza, а также раково-тестикулярного маркера MAGE-3. Изобретение позволяет повысить эффективность противоопухолевых (цельноклеточных, генноинженерных) вакцин, применяемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 287 577 C1

Клеточная линия меланомы человека mel IL, используемая для создания противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 686Д.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2287577C1

US 2003082136, 01.05.2003
VAN ELSAS A
et al., Transfection of IL-2 augments CTL response to human melanoma cells in vitro: immunological characterization of a melanoma vaccine, J
Immunother., 1997, v.20, n.5, p.343-353
ВАКЦИНА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА 2000
  • Селедцов В.И.
  • Самарин Д.М.
  • Селедцова Г.В.
  • Сенюков В.В.
  • Стрункин Д.Н.
  • Козлов В.А.
RU2192884C2
US 5635188, 03.06.1997
ПОНТОН ДЛЯ ВЕРТИКАЛЬНОГО ЦИЛИНДРИЧЕСКОГО РЕЗЕРВУАРА ДЛЯ ХРАНЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 1993
  • Семьин И.Ф.
RU2053176C1
JP 2002241314, 28.08.2002.

RU 2 287 577 C1

Авторы

Михайлова Ирина Николаевна

Барышников Анатолий Юрьевич

Морозова Лидия Федоровна

Бурова Ольга Семеновна

Демидов Лев Вадимович

Лукашина Марина Игоревна

Ларин Сергей Сергеевич

Георгиев Георгий Павлович

Ворожцов Георгий Николаевич

Гнучев Николай Васильевич

Даты

2006-11-20Публикация

2005-04-22Подача