КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel H, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2010 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, FRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2), и мутированные антигены (MUC-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и FRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентная вакцина), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт. [3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа, на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Н из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 715Д.

Родословная клеточной линии mel H

Линия клеток получена из опухолевого образца пациента Х.Н.С., и/б 00/9865, находившегося на лечении в 2001 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи левой стопы. Опухолевый материал получен при удалении метастатического пахового л/узла. Предыдущее лечение пациента: хирургическое, иммуно- и химиотерапевтическое. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 31 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии mel H

Клеточная линия mel H состоит из относительно мономорфных клеток мелкого и среднего размеров, округлой, овальной и удлиненной формы без четких цитоплазматических контуров. Цитоплазма обильная негомогенная, окрашена в базофильные тона с розоватым оттенком. Ядра клеток гипо- и нормохромные с зернистым строением хроматина, иногда содержат ядрышки. Редко встречаются 2-х ядерные и гигантские одноядерные и многоядерные клетки. Встречаются митозы.

Кариологическая характеристика клеточной линии mеl Н

Культура характеризуется различающимися диаметрами ядер при одной и той же плотности окраски и состоянии хроматина, характерного для интерфазных ядер. Проанализировано 88 метафаз. Число хромосом в 69 клетках колеблется от 54 до 65 хромосом, что отражает триплоидный набор (3n). В 19 клетках обнаружен гексаплоидный (6n) набор (около 120 хромосом). Это клетки с реплицированными хромосомными наборами, в которых не произошло разделения цитоплазмы, т.е. наличие повышенной полиплоидизации. Обнаружен дополнительный хромосомный материал неизвестного происхождения на длинных плечах двух хромосом 19 и на длинных плечах хромосомы из группы D, инверсия участка хромосомы 16, транслокация хромосом 13 и 15. В 32 клетках отмечаются хромосомные аберрации, представленные дицентрическими (47), трицентрическими (1) и кольцевыми (3) хромосомами. Следовательно, данная культура характеризуется высокой хромосомной изменчивостью. Кариотип - 54~65<3n>,der(13;15)(q10;q10),add(Dq),inv(16)(p11q12),add(19)(q13.4).

Иммуногенетическое исследование (определение HLA фенотипов (I класс))

А3, А30(19); В13, В7.

Культуральные свойства клеточной линии mеl Н

Клеточная линия mel H культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы площадью 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, 10%ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии mеl Н

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel H. Опухолевую ткань, полученную при хирургическом удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы площадью 25 см в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 31 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mеl Н. Полученная клеточная линия mel H, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР (полимеразно-цепной реакции) анализа была исследована на экспрессируемые гены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости). Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinaza, HMW. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции.

Данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров: HMW и CD63, антигенов гистосовместимости первого класса, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Отмечена отрицательная эксперссия дифференцировочных маркеров НМВ45, MelanA, Tyrosinaza. Положительная экспрессия раково-тестикулярных генов MAGE соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Полученные данные отражены в таблице 1.

Таблица 1 Экспрессия антигенов на клеточной линии mel Н Дифференцировочные антигены Раково-тестикулярные антигены Антигены гистосовместимости CD63 положит. MAGE положит. HLA (I класс) положит. НМВ45 отр.     HLA-DR(II класс) отр. MelanA отр.         Tyrosinaza отр.         HMW положит        

Как следует из табл. 1, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных маркеров: HMW и CD63, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Положительная экспрессия раково-тестикулярных маркеров семейства MAGE соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого класса (HLA).

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека mel Н имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов - HMW, CD63, раково-тестикулярных генов класса MAGE, а также молекулы гистосовместимости первого класса и отсутствии таких дифференцировочных маркеров, как MelanA, HMB45, Tyrosinaza. Данный фенотип позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Список литературы

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25: 1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149: 659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690: 120.

4. Sondak V.K., Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/ Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13(6): 409-15.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин. Клеточная линия меланомы человека mel H обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 715Д. Изобретение позволяет расширить арсенал клеточных линий меланомы человека, используемых для создания противоопухолевых вакцин, применяемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. 1 табл.

Клеточная линия меланомы человека mel H, используемая для получения противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 715Д.