КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Gus, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2009 года по МПК C12N5/08 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, FRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) и мутированные антигены (MUM-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов, иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для разработки вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентные вакцины), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт. [3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин. Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Gus из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК (П) 707Д.

Родословная клеточной линии mel Gus

Линия клеток получена из опухолевого образца пациентки Г.М.К., и/б 98/14374, находившейся на лечении в 2004 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи правой пяточной области. Материал получен при удалении метастатического узла из мягких тканей правого бедра. Предыдущее лечение: хирургическое, химиотерапия, иммунотерапия.

Получение клеточной линии mel Gus

Опухолевая ткань получена хирургическим путем при удалении метастазов кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки mel Gus

Клеточная линия mel Gus представлена однообразными по форме округлыми клетками среднего и крупного размеров с фестончатыми или четкими границами цитоплазмы. Цитоплазма клеток относительно обильная, негомогенная, окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности. Ядра клеток полиморфные, округлой, овальной или неправильной формы с утолщенными неровными контурами, расположены эксцентрично или центрально, имеют грубодольчатое строение хроматина окрашенного нормо- или гиперхромно. В части ядер определяются центральные, не увеличенные одиночные ядрышки. Редко встречаются двухядерные, гигантские одноядерные и многоядерные клетки, митозы. Выявляются единичные клетки вытянутой, удлиненной и веретенообразной формы.

Кариологическая характеристика mel Gus

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски и состоянию хроматина.

Проанализировано 18 метафаз. Число хромосом колеблется от 48 до 52. Модальное число хромосом соответствует диплоидному набору (2n).

Хромосомный набор во всех культурах измененный, но стабильный, соответствует женскому полу (XX). Наблюдается трисомия по хромосомам 1, 2, 3, 7, 22 и хромосоме из группы F (19 или 20), а также маркерная хромасома (mar). Во всех клетках обнаружена дупликация участка длинного плеча хромосомы 4, делеция участка длинного плеча хромосомы 11, транслокация короткого плеча хромосомы 6 с участком неидентифицируемого хромосомного материала, транслокация короткого плеча хромосомы 7 и длинного плеча хромосомы 9, а также дополнительный материал на длинном плече хромосомы 17, скорее всего дупликация участка q22q24.

Кариотип - 48~52<2n>,XX,+1,+2,+3,dup(4)(q31.2q35),der(6)t(6;?)(p;?),+7,t(7;9)(p10;q10),del(11)(q22),dup(17)(q22q24),+F,+22+mar.

Культуральные свойства mel Gus

Клеточная линия mel Gus культивируется в питательной среде RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см³. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии mel Gus

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel Gus

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 15 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Gus

Полученная клеточная линия mel Gus, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР (полимеразно-цепной реакции) анализа была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости).

Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinaza, HMW. Раково-тестикулярный маркер MAGE-3, который может быть экспрессирован на опухолях различного гистогенеза, исследован в реакции ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Полученные данные отражены в таблице.

Таблица Экспрессия антигенов на клеточной линии mel Gus Дифференцировочные антигены Раково-тестикулярные антигены Антигены гистосовместимости CD63 положит MAGE-3 положит HLA (I класс) положит НМВ45 положит     HLA-DR (II класс) положит MelanA положит         Tyros отр         HMW положит        

Как следует из таблицы, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров: CD63 и HMW, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Положительная экспрессия раково-тестикулярного маркера MAGE-3 соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Уникальной особенностью данной линии является наличие антигенов гистосовместимости первого и второго класса, что обуславливает повышение иммуногенности за счет представления опухолевых антигенов непосредственно CD4 и CD8 клеткам.

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека mel Gus имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов (CD63, BMW) и раково-тестикулярного - (MAGE-3), а также молекул гистосовместимости первого и второго класса, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований.

Литература

1. Barker C.F. et al.. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25: 1-54.]

2. Tomita Y. et al.. Immunohistochemical detection ofintracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149: 659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.

4. Sondak V.K... Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/Semin cancer Biol. 2003. Dec.13 (6): 409-15.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению новых клеточных линий, и может быть использовано для создания противоопухолевых вакцин. Получена новая клеточная линия меланомы человека mel Gus, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции клеточных культур института Цитологии РАН под номером РККК (П) 707Д. Полученная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров - CD63, HMW, MelanA, НМВ45, а также раково-тестикулярного маркера MAGE-3, наличием антигенов гистосовместимости первого и второго класса. Изобретение позволяет повысить эффективность противоопухолевых (цельноклеточных, генно-инженерных) вакцин, применяемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. 1 табл.

Клеточная линия меланомы человека mel Gus, используемая для создания противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 707Д.