ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА MYCELIOPHTHORA FERGUSII-ПРОДУЦЕНТ НЕЙТРАЛЬНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/14 C12N9/42 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, в различных отраслях пищевой промышленности, в пивоварении, в спиртовой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве, для ферментативного гидролиза (осахаривания) целлюлозы и целлюлозосодержащего сырья, в целлюлозно-бумажной промышленности.

Ферментные препараты карбогидраз, содержащие целлюлазу, бета-глюканазу, ксиланазу и сопутствующие ферменты, могут применяться для обработки целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов и биодеградации клеточных стенок растений и микроорганизмов, в том числе для осахаривания и переработки отходов промышленности и сельского хозяйства, в целлюлозно-бумажной промышленности для интенсификации процесса размола и улучшения обезвоживания первичной целлюлозной массы, а также для увеличения степени помола и подготовки макулатуры для получения бумаги и картона, в пищевой, спиртовой и пивоваренной промышленности для гидролиза некрахмальных полисахаридов, в качестве кормовых добавок, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Известно много штаммов - продуцентов карбогидраз, главным образом целлюлазы, и способы их культивирования в аэробных условиях. Как правило, микроорганизмы, в частности мицелиальные грибы, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные субстраты. Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить высокие уровни активности карбогидраз в ферментационной среде, скоростью образования этих ферментов, выходом ферментов с единицы массы используемых для ферментации субстратов, а также свойствами ферментов (рН и температурный оптимум действия, субстратная специфичность и др.).

Наиболее активными продуцентами целлюлазы являются штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma. С целью повышения их способности к продукции ферментов и адаптации к более дешевым ферментационным средам были получены различные мутантные и рекомбинантные штаммы Tr. longibrachiatum (син. Tr. reesei). Мутант Tr. reesei MCG80 при глубинном культивировании на питательной среде с 8%-ной целлюлозой и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед/мл FPA (Патент США №4472504, кл. C12N 9/42, 1984 г.). FPA - активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC (T.K.Ghose, Pure and Appl. Chem., 1987, vol.59, №2, p.257-268).

Известен мутант Tr. reesei ВСМ 18.2/KK (ВГНКИ-28), полученный из исходной культуры Tr. reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет обеспечить высокий выход активности ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата (Патент РФ №2001949, C12N 9/42, 1993 г.). Штамм Tr. reesei ВСМ 18.2/KK имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома в качалочных колбах достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой - 18,2 ед/мл FPA (81 ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке - 12-14 ед/мл FPA (100-110 ч).

Известен мутант Tr. longibrachiatum TW-1 (BKM F-3634D), полученный с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr. reesei var longibrachiatum QM6a (BKM F-2047D) с применением ультрафиолетового облучения (Патент РФ №2195490, 7 C12N 1/14, 9/42, 2001 г.). Штамм Tr. longibrachiatum TW-1 имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании в качалочных колбах на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности целлюлазы (FPA), бета-глюканазы ксиланазы, составляющий 6,5, 25, 20 ед/мл, соответственно (время культивирования 120 ч). При культивировании в ферментере на среде с ферментативным гидролизатом крахмала, пшеничными отрубями и микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) и с непрерывным внесением лактозы (во второй фазе ферментации) уровень активности целлюлазы (FPA), бета-глюканазы, ксиланазы составляет 25, 510, 108 ед/мл, соответственно (время культивирования 120 ч).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Tr. longibrachiatum TW-307 (BKM F-3865D), полученный с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr. reesei var longibrachiatum QM6a (BKM F-2047D) с применением ультрафиолетового облучения (Патент РФ №2287571, C12N/14, 9/42, C12R 1/885, 2006 г.). Штамм Tr. longibrachiatum TW-307 имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании в качалочных колбах на жидкой питательной среде на основе свекловичного МКЦ, кукурузного экстракта и глюкозы уровень активности целлюлазы (FPA), бета-глюканазы, ксиланазы составляет 14, 80, 95 ед/мл, соответственно (время культивирования 120 ч). При культивировании в ферментере на среде с МКЦ, кукурузным экстрактом и глюкозой и непрерывным внесением лактозы (во второй фазе ферментации) и рН 4,2 ферментационной среды уровень активности целлюлазы (FPA), бета-глюканазы, ксиланазы составляет 32, 620, 580 ед/мл, соответственно (время культивирования 120 ч), а при поддержании рН в ферментационной среде 6,0 активности целлюлазы (FPA), бета-глюканазы, ксиланазы составляют 30, 810, 2500 ед/мл, соответственно.

Однако, как следует из имеющихся сведений, полученных в результате научных исследований, для грибов рода Trichoderma характерно то, что они, как правило, синтезируют ферменты (в частности, целлюлазы, ксиланазы и бета-глюканазы), проявляющие максимальную активность в кислой среде (рН 4,5-5,0), и при повышении значений рН и температуры активность ферментов существенно снижалась. Штамм Tr. longibrachiatum TW307 (ВКМ F-3865D) не является в данном случае исключением и имеет тот же недостаток, что и другие штаммы Trichodrema - а именно, он продуцирует ферменты целлюлазу, ксиланазу и бета-глюканазу, которые не проявляют высокую активность и не стабильны при слабо кислых и нейтральных значениях рН (рН 5,5-8,5). При этом следует отметить, что рН реакционной среды, близкий к нейтральному, характерен для таких областей применения ферментов целлюлазы, ксиланазы и бета-глюканазы, как спиртовая промышленность, пивоварение, целлюлозно-бумажная промышленность, осахаривание целлюлозосодержащего сырья.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов - продуцента ферментов, целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы, проявляющих высокую активность и стабильность при нейтральных значениях рН и пригодных для культивирования на дешевом сырье.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого способа, заключается в обеспечении высоких активностей грибных нейтральных целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы в культуральной среде.

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм мицелиального гриба Myceliophthora fergusii UV-64 - продуцент нейтральнных целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы.

Штамм Myceliophthora fergusii UV-64 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № BKM F-3932D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из дикого штамма Myceliophthora fergusii 11-70-16 (ВКМ F-3944D). Для этого суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 35°С в течение 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 2-4 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма. Воздушный мицелий белый, с возрастом - кремовый, пушистый, ватообразный, край ровный, ревер спалевый, в центре более яркий.

Морфологические признаки определяли на среде МА после культивирования в течение 7 дней при температуре 37°С и 40°С. Мицелий ветвящийся, гладкий, бесцветный. Гифы широкие, до 5 мм в диаметре.

Спороношение обильное, бластоконидии образуются латерально или терминально на воздушных гифах, на небольших ножках. Вторичные бластоконидии образуются на дистальных концах первичных конидий.

Бластоконидии 7,0-10,0×3,0-4,0 мкм, булавовидные, иногда овальные, грушевидные, слегка удлиненные, бесцветные, с небольшим базальным шрамчиком.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, ксилоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,25 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма. Термотолерантен. Оптимальная температура роста мицелия 42°С (37-42°С, см. Таблицу 1), оптимум для образования целлюлазы и ксиланазы 37°С (37-40°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлазы и ксиланазы 5,5-6,5. Рост мицелия наблюдается и при рН 3,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлазы и других карбогидраз.

Таблица 1 Зависимость роста колонии от температуры культивирования. Температура культивирования (°С) Диаметр колоний 15 Роста нет 20 20-25 мм 26 25-30 мм 30 43-48 мм 37 50-52 мм 40 50-55 мм 42 58-60 мм 48 48-50 мм 52 15 мм

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу.

Не ассимилирует: L-рамнозу, D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-О-глюкозу, 5-тио-О-глюкозу.

Использует аммонийный, нитратный и органический азот.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, пектине и хитине. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, дрожжевой экстракт (0,5 г/л), аморфную целлюлозу (10 г/л), а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита.

Полученный мутант Myceliophthora fergusii UV-64 (BKM F-3932D) по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Myceliophthora fergusii 11-70-16 (BKM F-3944D) сниженной интенсивностью спороношения и более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма Myceliophthora fergusii UV-64 (BKM F-3932D) проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - карбогидраз (целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Активность целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы в культуральной жидкости определяют по способности гидролизовать КМЦ, бета-глюкан и ксилан, соответственно. За единицу КМЦ-азной, бета-глюканазной и ксиланазной активностей принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 7,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учеб. пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Myceliophthora fergusii UV-64 (BKM F-3932D) выращивают на сусло-агаре или СМ-агаре при 37°С в течение 7 суток и далее - при комнатной температуре на свету в течение 5 суток.

Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина-80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой водной среды следующего состава, в г/л: глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 0,5, крахмал (картофельный) - 40,0, кукурузный экстракт (содержание сухих веществ 48-50%) - 50,0, (NH₄)₂SO₄ - 12, K₂HPO₄ - 1,0, KН₃РO₄ - 0,4, MgSO₄×7H₂O - 0,14, СаСl₂ - 0,12, FeSO₄ - 0,01, цитрат Na 12,0; pH (начальные значения) - 6,6. Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 200 об/мин в течение 144 ч.

Активности КМЦ-азная, ксиланазная и бета-глюканазная в культуральной жидкости на 144 ч культивирования, измеренные при pH 7,0, составили 18, 25 и 20 ед/мл соответственно.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, но с исходными значениями pH 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 200 об/мин в течение 144 ч.

Активности КМЦ-азная, ксиланазная и бета-глюканазная в культуральной жидкости на 144 ч культивирования, измеренные при pH 7,0, составили 35, 55 и 30 ед/мл соответственно.

Пример 3. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера, используя жидкую водную питательную среду следующего состава, в г/л: соевая шелуха - 30, солодовые ростки - 30, свекловичный жом - 10, (NH₄)₂SO₄ - 3, KH₂PO₄ - 4, NaNO₃ - 3, MgSO₄×7H₂O - 0,5; pH 6,6. Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 200 об/мин в течение 144 ч.

Активности КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 120-144 ч культивирования, измеренные при pH 7,0, составили 40, 35 и 40 ед/мл соответственно.

Пример 4. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера, как описано в примере 3, но с исходным значением pH 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 37°С и 200 об/мин в течение 144 ч.

Активности КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 144 ч культивирования, измеренные при pH 7,0, составили 55, 60 и 50 ед/мл соответственно.

Пример 5. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 7,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулирует 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 48-72 ч культивирования в качалочных колбах Эрленмейера, содержащих жидкую водную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 1,0, пептон - 10,0, лактоза - 10,0, глюкоза - 10,0, K₂НРO₄ - 0,3, MgSO₄×7H₂O - 0,15, KСl - 0,05, FeSO₄ - 0,007; рН среды доводится до 6,5 раствором NH₄OH. В среду добавляется пеногаситель (лапрол) в количестве 0,2 мл/л среды.

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24-36 ч при 37°С и рН 6,5 на жидкой питательной среде, состав которой приводится в примере 3. Через 24-36 ч начинают вторую фазу культивирования (фаза биосинтеза внеклеточных ферментов, на протяжении которой происходит увеличение активности ферментов в культуральной жидкости). На второй фазе ферментации в ферментер непрерывно добавляют 50%-ную глюкозу со скоростью, при которой ее концентрация в ферментационной среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 37°С, а рН - 6,5. Ферментация заканчивается через 144 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора глюкозы.

Активности КМЦ-азная, ксиланазная и бета-глюканазная в культуральной жидкости на 144 ч культивирования, измеренные при рН 7,0, составили 130, 120 и 110 ед/мл соответственно.

Пример 6. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М, как описано в примере 5, но рН среды в течение всей ферментации поддерживают при рН 4,5.

Активности КМЦ-азная, ксиланазная и бета-глюканазная в культуральной жидкости на 144 ч культивирования, измеренные при рН 7,0-250, 350 и 210 ед/мл соответственно.

С помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 KDa) и последующего лиофильного высушивания получают сухой ферментный препарат, КМЦ-азная, ксиланазная и бета-глюканазная активности которого, измеренные при рН 7,0, составили 2750, 3900 и 2320 ед/г соответственно.

рН-зависимость КМЦ-азной, ксиланазной и бета-глюканазной активности в культуральной жидкости Myceliophthora fergusii UV-64 BKM F-3932D, а также рН-зависимость аналогичных активностей ферментного препарата Tr. longibrachiatum (Целловиридин Г20х), приведены в Таблице 2; данные, характеризующие стабильность целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы - в Таблице 3.

Таблица 2 Зависимость целлюлазной, бета-глюканазной и ксиланазной активности от рН (50°С), %. рН Myceliophthora fergusii Trichoderma longibrachiatum   КМЦ-аза Бета-глюканаза Ксиланаза КМЦ-аза Бета-глюканаза Ксиланаза 3,5 30 39 29 50 63 40 4,0 85 88 78 85 75 75 4,5 90 90 95 95 90 90 5,0 95 92 98 100 95 100 5,5 95 96 100 85 100 95 6,0 100 100 100 65 88 85 6,5 95 100 95 43 78 55 7,0 65 60 65 10 40 38 7,5 58 55 52 6 30 15 8,0 42 45 45 4 20 5 8,5 38 32 30 - 5 -

Таблица 3 Стабильность целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы (остаточная активность после инкубирования в течение 3 час при рН 7,0 и 50°С), %. Myceliophthora fergusii Trichoderma longibrachiatum КМЦ-аза Бета-глюканаза Ксиланаза КМЦ-аза Бета-глюканаза Ксиланаза 90 92 85 25 26 5

Результаты, приведенные в Таблицах 2 и 3 и в Примерах 1-6, свидетельствуют о том, что предлагаемый штамм Myceliophthora fergusii UV-64 (BKM F-3932D) обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий целлюлазу, ксиланазу и бета-глюканазу, проявляющих высокую активность при слабо кислых и нейтральных значениях рН, что создает возможность получения активного и полного комплекса нейтральных карбогидраз, а также, при необходимости - отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Ферментные препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность их использования в различных областях биотехнологии.

Штамм Myceliophthora fergusii UV-64 BKM F-3932D обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий нейтральные целлюлазу, ксиланазу и бета-глюканазу. Это позволяет получить целый ряд ферментов для гидролиза некрахмальных полисахаридов растительного сырья, проявляющих высокую активность при слабокислых и нейтральных значениях рН, и тем самым расширить ассортимент ферментных препаратов. 3 табл.

Штамм мицелиального гриба Myceliophthora fergusii BKM F-3932D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) - продуцент нейтральных целлюлазы, бета-глюканазы и ксиланазы.