ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ, ПЕКТИНАЗЫ И МАННАНАЗЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/14 C12N9/42 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности и в сельском хозяйстве. Мультиферментные комплексы карбогидраз, содержащие бета-глюканолитические, целлюлозо-, гемицеллюлозолитические и пектолитические ферменты, лизирующие клеточную стенку, как и отдельные карбогидразы, могут применяться для биодеградации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений, а также в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Известно достаточно много штаммов - продуцентов отдельных карбогидраз, главным образом целлюлаз, и способы их культивирования в аэробных условиях.

Как правило, микроорганизмы, в частности мицелиальные грибы, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные субстраты. Обычно комплекс включает преимущественно целлюлазы, а также другие карбогидразы, среди которых чаще всего встречаются ксиланазы и пектиназы.

Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить достаточно высокие уровни активности карбогидраз в ферментационной среде, скоростью образования ферментов, выходом ферментов с единицы массы используемого субстрата, а также стоимостью самих субстратов.

Известны штаммы Aspergillus niger, при культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, бета-глюканазу и ламинариназу (Патент РФ 2057179, кл. C 12 N 9/42, 1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют соответственно: целлюлаза - 5,0 Е/мл; ксиланаза - 125,0 Е/мл; бета-глюкозидаза - 20,0 Е/мл; бета-ксилозидаза - 36,0 Е/мл; бета-глюканаза - 0,95 Е/мл и ламинариназа - 1,25 Е/мл.

Хотя грибы рода Aspergillus образуют комплексы с широким спектром карбогидраз, однако активность большинства отдельных компонентов комплекса недостаточно высокая, что часто делает нецелесообразным их практическое применение.

Как известно, наиболее активными продуцентами целлюлаз являются штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma. С целью повышения их способности к продукции и адаптации к более дешевым средам были получены различные мутантные и рекомбинантные штаммы Trichoderma longibrachiatum (syn. Trichoderma reesei). Мутант Trichoderma.reesei MCG 80 при непрерывном культивировании на питательной среде с 8% целлюлозы и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед/мл FPA (Патент США 4472504, кл. C 12 N 9/42, 1984 г.). FPA - активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC (Т.К.Chose., Pure and Appl. Chem., vol.59, 2, pp.257-268).

Известен мутант Trichoderma.reesei IMET 43803, который вследствие частичного уменьшения катаболитной репрессии биосинтеза обеспечивает высокую продуктивность целлюлаз и высокий (до 10 ед/мл FPA) уровень активности целлюлазы при культивировании на среде с лактозой (патент ГДР 291673, кл. C 12 N 9/42, 1991 г.).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Trichoderma.reesei ВСМ 18.2/КК (ВГНКИ-28), полученный с помощью парасексуальных процессов из исходной культуры Trichoderma reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет при одностадийной ферментации обеспечить высокую активность ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата (Патент РФ 2001949, C 12 N 9/42, 1993 г. ). Штамм 18.2/КК имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой - 18.2 ед/мл (81ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке -12-14 ед/мл (100-110 ч).

Однако, как следует из имеющихся в нашем распоряжении сведений, полученных в результате научных исследований, грибы рода Trichoderma, как правило, обладают высокой продуктивностью, преимущественно в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени - в отношении других карбогидраз (бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ), необходимых для гидролиза различных полисахаридов, входящих (помимо целлюлозы) в состав растительного сырья. Штамм Trichoderma reesei BCM 18.2/КК (ВГНКИ-28) не является в данном случае исключением и имеет тот же недостаток, что и другие штаммы Trichodrema, а именно он имеет низкую продуктивность по карбогидразам, не являющимися целлюлазами (бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы, маннаназы).

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов - продуцента мультиферментного комплекса, содержащего широкий спектр карбогидраз и пригодного для культивирования на дешевом сырье в присутствии высоких концентраций сахаров.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности как целлюлаз, так и других компонентов комплекса - бета-глюканаз, ксиланаз и пектиназ в ферментационной среде, а также в повышении способности к продукции маннаназы.

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под ВКМ F-3634 D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Trichoderma reesei QM 6a (ВКМ F-2047). Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28^oС в течение 2 сут и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4^oС с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма
При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 80-90 мм на 7 сутки при росте при 25^oС. Мицелий развит преимущественно субстратный, гиалиновый; воздушный скудный, белый. Конидиальная зона сформирована многочисленными компактными подушечками диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Обратная сторона - светло-зеленовато-желтая. Конидиеносцы неокрашенные, гладкостенные, формируются преимущественно на субстратном мицелии, главные ветви длинные и прямые, иногда извитые, до 5 мм шириной у основания, постепенно сужающиеся к вершине до 2 мкм ширины; боковые ветви образуются через неравные интервалы, обычно короткие, формируются под углом к вершине конидиеносцев. Фиалиды одиночные, булавовидные или широко бутыловидные, часто искривленные, размер - 5-10 ч 2-3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидальные, 4-7 ч 2,5-4 мкм, собраны в небольшие головки на вершинах фиалид.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,3 ч^-1, в конце культивирования - 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма
Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32^oС (29-34^oС), оптимум для образования целлюлаз 28^oС (26-29^oС). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу. Не ассимилирует: L-рамнозу, D-глюкозамии, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу.

Использует аммонийный и органический азот, очень плохо ассимилирует нитратную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, пектине, галактоманнане и хитине. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 сут при 30^oС и затем 20 ч при 45^oС. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).

Полученный мутант Trichoderma longibrachiatum BKM F-3634D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Trichoderma reesei QM 6а существенно сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (светло-зеленовато-желтые) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз и других, кроме целлюлазы, карбогидраз - бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Культивирование штамма Trichoderma longibrachiatum BKM F-3634D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - карбогидраз (целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Активность целлюлаз определяют по FPA (согласно рекомендации UРАС), активность бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять бета-глюкан, ксилан, полигалактуроновую кислоту и галактоманнан соответственно. За единицу активности принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50^oС и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В. Гусаков, И. М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде концентрированных препаратов, получаемых с помощью улътрафильтрации или в виде сухих препаратов.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Trichoderma longibrachiatum BKM F-3634D выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29^oС в течение 7 сут и далее при комнатной температуре на свету в течение 5 сут. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом - 40,0; солодовые ростки - 14,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; КН₂РО₄ - 2,0; MgSО₄•7H₂О - 0,6; рН 5,4. Колбы инкубируют на качалке при 30^oС и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 6,5; 25,0; 20,0; 7,0 и 0,5 ед/мл соответственно.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) - 4,0; лактоза - 20,0; (NH₄)₂SО₄ - 6,0; KН₂PО₄ - 2.0; MgSО₄•7H₂О - 0,6; рН 5,4.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 6,0; 30,2; 22,0; 7,5 и 1,2 ед/мл, соответственно.

Пример 3. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (как описано в примере 1).

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24 ч при 32^oС на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: МКЦ - 4,0; лактоза - 20,0; (NH₄)₂SО₄ - 6,0; КН₂РО₄ - 2,0; MgSО₄•7H₂О - 0,6. Через 24 ч начинают вторую фазу культивирования (на протяжении которой происходит накопление ферментов в среде роста). На второй фазе в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 28^oС, а рН - 4,2. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л.

Активности целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляют на 110-120 ч культивирования 20,0; 380,0; 65,0; 23,0 и 24,0 ед/мл соответственно.

Пример 4. Процесс проводят в ферментере типа АНКУМ 2М. Режим ферментации тот же, что в примере 3. Культивирование осуществляют на среде состава, приведенного в примере 3, но вместо лактозы на первой фазе культивирования в составе жидкой питательной среды используют ферментативный гидролизат крахмала (600 мл на 6,5 л ферментере, начальная концентрация глюкозы в среде 2,9-3,3%), а вместо МКЦ - пшеничные отруби в концентрации 40 г/л. На второй фазе культивирования добавляют лактозу так же, как в примере 3. В процессе ферментации через 60 ч после ее начала в среду вносят минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале процесса культивирования.

Через 120 ч ферментации активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 21,0; 470,0; 90,0; 35,0 и 30,0 ед/мл соответственно.

Пример 5. Процесс проводят в ферментере типа АНКУМ 2М. Режим ферментации тот же, что в примере 3. Культивирование осуществляют на среде состава, приведенного в примере 4, но кроме пшеничных отрубей и гидролизата крахмала в составе жидкой питательно среды на первой фазе культивирования используют также МКЦ в концентрации 5 г/л. На второй фазе культивирования добавляют лактозу так же, как в примере 3. В процессе ферментации через 40 и 84 ч после ее начала в среду вносят МКЦ в количестве, чтобы ее концентрация была 2 г/л ферментационной среды, а через 60 ч - минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале первой фазы процесса культивирования.

Через 120 ч ферментации активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 25,0; 510,0; 108,0; 40,0 и 35,0 ед/мл соответственно.

Таким образом, предлагаемый штамм Trichoderma longibrachiatum ВКМ F-3634D обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, бета-глюканазы и маннаназы, что создает возможность получения полного комплекса ферментов, а также при необходимости отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов. Препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и особенно в качестве кормовых добавок.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 ВКМ F-3634D получен с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Trichoderma reesei QM 6а с применением ультрафиолетового облучения. Штамм обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, что создает возможность получения полного комплекса ферментов, а также при необходимости индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для получения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования используют питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов. Изобретение позволяет существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и особенно в качестве кормовых добавок.

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum ВКМ F-3634 D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН) - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.