ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM - ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗ И КСИЛАНАЗ Российский патент 2007 года по МПК C12N9/42 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для переработки отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений и микроорганизмов, в микробиологической промышленности, в целлюлозно-бумажной промышленности в различных отраслях спиртовой и пищевой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве при проведении ферментативного гидролиза (осахаривания) целлюлозы и целлюлозосодержащего сырья.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является селекционированный штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы (RU патент 2195490, 2002).

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под ВКМ F-3634D.

Штамм Tr.longibrachiatum TW-1 имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином.

Однако, как следует из имеющихся в нашем распоряжении сведений, полученных в результате научных исследований, для известных штаммов грибов рода Trichoderma характерно следующее. Они, как правило, обладают высокой продуктивностью либо преимущественно в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени - в отношении других карбогидраз (бета-глюканаз, ксиланаз и других, необходимых для гидролиза различных растительных полисахаридов, входящих помимо целлюлозы в состав растительного сырья), либо грибы Trichoderma обладают высокой продуктивностью в отношении ксиланаз, однако в этом случае продуктивность по целлюлазам уменьшается. Штамм Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D) не является в данном случае исключением и имеет тот же недостаток, что и другие штаммы Trichodrema, а именно, он не обеспечивает без изменения условий ферментации одинаково высокую продуктивность по целлюлазам и ксиланазам.

Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов - продуцента целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз, пригодного для культивирования на дешевом сырье в присутствии высоких концентраций сахаров.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокой скорости обработки целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе для осахаривания и переработки отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений и микроорганизмов, для гидролиза некрахмальных полисахаридов кормов сельскохозяйственных животных.

Сущность объекта изобретения - новый штамм мицелиального гриба Tr.longibrachiatum TW-420 - продуцент целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз.

Штамм Tr.longibrachiatum TW-420 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3880D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из мутанта Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D). Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом (облучение световым потоком мощностью 3 м Вт/см²) в течение 3-х мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28°С в течение 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма.

При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 80-90 мм на 7 сутки при росте при 25°С. Мицелий развит преимущественно субстратный, гиалиновый; воздушный скудный, белый.

Конидиальная зона сформирована многочисленными компактными подушечками диаметром до 2-2,5 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Обратная сторона - светло-зеленовато-желтая. Конидиеносцы неокрашенные, гладкостенные, формируются преимущественно на субстратном мицелии, главные ветви длинные и прямые, иногда извитые, до 4-5 мм шириной у основания, постепенно сужающиеся к вершине до 2 мкм ширины; боковые ветви образуются через не равные интервалы, обычно короткие, формируются под углом к вершине конидиеиосцев. Фиалиды одиночные, булавовидные или широко бутыловидные, часто искривленные, размер - 5-10×2-3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидальные, 4-7×2,5-4 мкм, собраны в небольшие головки на вершинах фиалид.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,3 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С), оптимум для образования ксиланаз - 32-34°С. Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Оптимальные значения рН для секреции ксиланаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу, трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу.

Не ассимилирует L-рамнозу, D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу.

Использует аммонийный и органический азот, очень плохо ассимилирует нитратную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, пектине и хитине. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, дрожжевой экстракт (0,5 г/л), аморфную целлюлозу (10 г/л), а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).

Полученный мутант Tr.longibrachiatum BKM TW-420 (F-3880 D) по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D) сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента и более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма Tr.longibrachiatum BKM TW-420 (F-3880) проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - карбогидраз (целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Активность целлюлаз по нерастворимой целлюлозе определяют по FPA (согласно рекомендации IUPAC, T.K.Ghose, Pure and Applied Chemistry, 1987, vol.59, № 2, pp.257-268), активность целлюлаз по растворимой карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), активность бета-глюканаз и ксиланаз в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять КМЦ, бета-глюкан и ксилан соответственно. За единицу КМЦ-азной, бета-глюканазной и ксиланазной активностей принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Tr.longibrachiatum TW-420 (F-3880 D) выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29°С в течение 7 суток и далее - при комнатной температуре на свету с течение 5 суток.

Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина-80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом - 40, солодовые ростки - 14, (NH₄)₂SO₄ - 6, KH₂PO₄ - 2, MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости оставляют 9, 48, 45 и 50 ед/мл соответственно.

При культивировании исходного штамма Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865 D) в качалочных колбах в указанных выше условиях активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная составляют 8, 30, 28 и 25 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Пример 2. Культивирование штамма Tr.longibrachiatum TW-420 (F-3880 D) осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 4, лактоза - 20, (NH₄)₂SO₄ - 6, КН₂PO₄ - 2, MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 120 ч культивирования оставляют 10, 60, 65 и 70 ед/мл соответственно.

При культивировании исходного штамма Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D) в качалочных колбах в указанных выше условиях активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная составляют 8, 40, 35 и 30 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Пример 3. Культивирование штамма Tr.longibrachiatum TW-420 (F-3880D) осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера на среде как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 20, глюкоза - 20, кукурузный экстракт - 60, (NH₄)₂SO₄ - 6, КН₂PO₄ - 2, MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 120 ч культивирования оставляют 16, 105, 100 и 120 ед/мл соответственно.

При культивировании исходного штамма Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D) в качалочных колбах в указанных выше условиях активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная составляют 14, 80, 75 и 95 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Пример 4. Культивирование штамма Tr.longibrachiatum TW-420 (F-3880D) осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера на среде состава, приведенного в примере 3, но с исходными значениями рН 6,0.

Активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 120 ч культивирования оставляют 15, 120, 110 и 400 ед/мл соответственно.

При культивировании исходного штамма Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D) в качалочных колбах в указанных выше условиях активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланаз составляют 8, 110, 105, и 250 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Пример 5. Проводят процесс культивирования штамма Tr.longibrachiatum TW-420 (F-3880D) в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 3).

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24-36 ч при рН 4,2 и 28°С на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: МКЦ - 5, глюкоза - 50, кукурузный экстракт - 60, (NH₄)₂SO₄ - 6, КН₂PO₄ - 3, MgSO₄×7H₂O - 0,6. Через 24-36 ч начинают вторую фазу культивирования (фаза биосинтеза внеклеточных ферментов, на протяжении которой происходит увеличение активности ферментов в культуральной жидкости). На второй фазе ферментации в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. На второй фазе поддерживают температуру 28°С, рН - 4,2. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л.

Активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 120 ч культивирования составляют 35, 720, 650 и 670 ед/мл соответственно.

При культивировании исходного штамма Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D) в ферментере в указанных выше условиях активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная составляют 32, 650, 620 и 580 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Пример 6. Проводят процесс культивирования штамма Tr.longibrachiatum TW-420 (F-3880D) в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 3).

Первую фазу культивирования (накопление биомассы гриба) осуществляют в течение 24-36 ч при 28°С при рН 4,2 на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: глюкоза - 20, кукурузный экстракт - 120, ферментативный гидролизат крахмала амилосубтилином (600 мл на 6 л среды, начальная концентрация восстанавливающих сахаров в среде 4,9-5,5%) (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6. На второй фазе в ферментер непрерывно добавляют смесь лактоза: глюкоза: ксилоза в соотношении 1:1:1 так, чтобы общая концентрация восстанавливающих сахаров концентрация в ферментационной среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 28°С, а рН - 6,0. В процессе ферментации через 60 ч после ее начала в среду вносят минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале процесса культивирования. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора сахаров на 50% и составляет 9-9,5 л.

Активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости на 120 ч культивирования оставляют 32, 960, 900 и 2700 ед/мл соответственно.

При культивировании исходного штамма Tr.longibrachidtum TW-307 (F-3865D) в ферментере в указанных выше условиях активности FPA, КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная составляют 30, 850, 810 и 2500 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Таким образом, предлагаемый штамм Tr.longibrachialum BKM F-3880 обладает способностью продуцировать одновременно высокую целлюлазную, бета-глюканазную и ксиланазную активности, что создает возможность получения сбалансированного комплекса ферментов для гидролиза полисахаридов растительного сырья.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Ферментные препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность их использования в различных областях биотехнологии и особенно в качестве кормовых добавок.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для осахаривания и переработки отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений и микроорганизмов, в микробиологической промышленности, в целлюлозно-бумажной промышленности в различных отраслях спиртовой и пищевой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве при проведении ферментативного гидролиза (осахаривания) целлюлозы и целлюлозосодержащего сырья. Штамм Tr.longibrachiatum TW-420 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3880D. Штамм получен с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из мутанта Tr.longibrachiatum TW-307 (F-3865D). По своим морфологическим признакам при росте на глюкозокартофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента и более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз бета-глюканаз и ксиланаз. Активности FPA, (целлюлазная), КМЦ-азная, бета-глюканазная и ксиланазная в культуральной жидкости оставляют 9, 48, 45 и 50 ед/мл соответственно.

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum BKM F-3880D - продуцент целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз.