ИНГИБИТОРЫ МУТАНТНОЙ ФОРМЫ КИНАЗЫ KIT Российский патент 2009 года по МПК A61K31/506 A61K31/553 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к лечению заболеваний, зависимых от киназы KIT, которые характеризуются мутантной формой KIT, при этом идентифицируют мутант KIT и вводят соответствующий ингибитор указанного мутанта KIT.

Ген c-kit кодирует рецепторную тирозинпротеинкиназу, которая известна под названием киназы KIT, причем известно также название - рецептор фактора роста тучных/стволовых клеток. Аминокислотная последовательность KIT и нуклеотидная последовательность гена c-kit в настоящее время определены (см. Swiss Prot.: P 10721). После связывания с лигандом, фактором стволовых клеток, KIT образует димер, который автофосфорилируется и активирует сигнальный каскад, который приводит к росту клеток. Известны мутации, которые приводят к образованию активированной формы KIT, прежде всего формы, активируемой независимо от ее лиганда, при этом считается, что такие мутации играют роль в развитии некоторых пролиферативных заболеваний, таких как заболевания тучных клеток, например мастоцитоз, прежде всего системный мастоцитоз, острый миелогенный лейкоз, желудочно-кишечные стромальные опухоли, синусноназальная лимфома NK/T-клеток, семиномы и дисгерминомы.

Известно, что иматиниб, который выпускается в виде мезилата под торговым названием Glivec или Gleevec, ингибирует KIT дикого типа и некоторые мутации KIT, например мутации в экзонах, которые обычно наблюдаются при желудочно-кишечных стромальных опухолях (GIST). Однако этот препарат является не активным или проявляет значительно сниженную активность в отношении некоторых других мутантных форм KIT, например мутации D816V, которая обычно наблюдается при системном мастоцитозе. Настоящее изобретение основано на корреляции лечения заболевания, характеризующегося мутантной формой KIT, с использованием соответствующего альтернативного лекарственного средства, способного ингибировать мутант KIT.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения зависимого от KIT заболевания у пациента, включающему

(а) идентификацию мутантной формы KIT, ассоциированной с зависимым от KIT заболеванием, и

(б) введение пациенту эффективного ингибирующего мутант KIT количества ингибитора, выбранного из группы, включающей мидостаурин, ваталаниб и соединение А.

Зависимые от KIT заболевания в основном являются пролиферативными заболеваниями, характеризующимися избыточной активностью киназы KIT за счет активирующей мутации киназы KIT. Такие активирующие мутации известны в данной области техники и методы их идентификации также известны.

Зависимые от KIT заболевания включают заболевания, которые характеризуются следующими известными мутациями KIT: D816F, D816H, D816N, D816Y, D816V, К642Е, Y823D, Del 550-558, Del 557-561, N822K, V654A, N822H, Del 550-558 + V654A, Del 557-561 + V654A, Ins503AY, V560G, 558NP, Del 557-558, Del VV559-560, F522C, Del 579, R634W, К642Е, T801I, C809G, D820Y, N822K, N822H, Y823D, Y823C и Т670I.

В главном варианте осуществления настоящего изобретения зависимым от KIT заболеванием является заболевание, устойчивое к иматинибу. Зависимым от KIT заболеванием, устойчивым к иматинибу, обычно называется зависимое от KIT заболевание, как описано выше, при котором иматиниб, введенный в дозе 400-1000 мг/сут не обеспечивает достаточного ингибирования мутанта KIT и не проявляет заметного лечебного действия. В основном мутант KIT, устойчивый к иматинибу, характеризуется величиной IC₅₀ in vitro более приблизительно 3 мкМ. Устойчивые к иматинибу мутации KIT включают D816F, D816H, D816N, D816Y, D816V, T670I и мутантные формы, включающие V654A.

Выбор соединения, ингибирующего мутантную форму KIT, основан на идентификации соединения или ряда соединений, способных ингибировать мутант KIT. Методы определения ингибирующей активности известны в данной области техники и представляются очевидными для специалистов в данной области.

Ингибиторы KIT по настоящему изобретению включают мидостаурин, ваталаниб и соединение А. Мидостаурин (US 5093330) и ваталаниб (WO 98/35958) известны в данной области техники. Соединение А характеризуется формулой

Указанное соединение можно получить по методике, как описано в заявке WO 04/005281.

Соответствующие дозы мидостаурина, ватаналиба и соединения А определяют стандартными способами.

Соответствующую дозу мидостаурина вводят, например, один, два или три раза в сутки, общая доза составляет 25-300, предпочтительно 50-300, более предпочтительно 50-100, наиболее предпочтительно 100-300 мг/сут, например, два или три раза в сутки в общей дозе 150-250 мг, предпочтительно 225 мг в сутки.

Соответствующая суточная доза ватаналиба находится в диапазоне 300-4000 мг, например в диапазоне 300-2000 мг/сут или 300-1500 мг/сут, прежде всего 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500 или 2000 мг/сут, прежде всего 1250 мг/сут.

Суточная доза соединения А для субъекта массой 70 кг составляет приблизительно 0,05-5 г, предпочтительно приблизительно 0,25-1,5 г.

Примеры

Ген KIT человека, кодирующий аминокислотный фрагмент 544-976, клонировали в донорной плазмиде бакуловируса pFB-GST-01. Эту кодирующую последовательность вырезали с использованием рестрикционных эндонуклеаз Bam H1 и EcoR1, затем лигировали с донорным вектором Bac-to-Bac pFB-GEX-Р1, содержащим совместимые концевые фрагменты. Затем стандартными методами вводили требуемые мутации в ген KIT. За счет сдвига рамки считывания в исходной плазмиде, которую использовали для получения последовательностей, кодирующих мутанты, мутантные вставки в плазмиде вырезали и вставляли в донорный вектор Bac-to-Bac pFB-GST-01 с использованием ректрикционных ферментов BamH1-EcoR1 для каждого мутанта, как показано на чертеже. Правильность секвенции в каждой мутантной плазмиде подтверждали методом автоматического секвенирования.

ДНК из бакулоплазмиды получали из 10 колоний каждого типа клеток DH10Bac, трансформированных клонами мутантной плазмиды pFB-GO1-KIT, как описано в разделе «Материалы и методы», и полученными препаратами трансфектировали клетки Sf9. Трансфектированные клетки осаждали и полученный рекомбинантный бакуловирус, присутствующий в супернатанте, амплифицировали. Для подтверждения экспрессии гибридного белка GST-c-KIT вирусными клонами лизат из клеточного осадка анализировали методом вестерн-блоттинга и иммунодетектирования с использованием антител против KIT и GST.

Мутация KIT Ваталаниб средняя величина IC₅₀ (мкМ) Соединение А средняя величина IC₅₀ (мкМ) D816F >10 >10 D816H >10 >10 D816N >10 <10 D816Y >10 >10 D816V >10 >10 К642Е <1 <10 Y823D <1 <1 Del 550-558 <1 <2 Del 557-561 <1 <2 N822K <2 <10 V654A >10 >10 N822H <2 <10 Del 550-558+V654A <10 <10 Del 557-561+V654A >10 >10   Мидостаурин Препарат HIS средняя величина IC50 мкМ Станд. откл. Число измерений HT-KIT-TA23 wt 1.7 0.15 2 HT-KIT TA23 - D820G 0.084 0.05 2 HT-KIT TA23 - T670I 0.89 0.21 2 Препарат GST средняя величина IС50 мкМ Станд. откл. Число измерений GST-KIT wt 1,8 0,26 10 GST-KIT Del 557-561 0,32 0,042 3 GST-KIT Del 550-558 0,53 0,057 3 GST-KIT Del 550-558 + V654A 0,27 0,079 5 GST-KIT Del 557-561 + V654A 0,34 0,11 5 GST-KIT V654A 0,46 0,16 5 GST-KIT K642E 0,64 0,036 4 GST-KIT R634W 0,33 0,13 2 GST-KIT T670I + Del 550-558 0,11 0,05 2 GST-KIT D816F 0,41 0,055 5 GST-KIT D816H 0,35 0,078 5 GST-KIT D816N 0,74 0,25 5 GST-KIT D816Y 0,29 0,11 9 GST-KIT D816V 0,25 0,039 3 GST-KIT D816H + R634W 0,08 0,04 2 GST-KIT N822H 0,37 0,12 5 GST-KIT N822K 0,15 0,058 5 GST-KIT Y823D 0,13 0,0075 3

Условия анализа: 1 мкМ АТФ, 5 мгк/мл поли-EY, инкубация при комнатной температуре в течение 10 мин.

Среду, содержащую вирус, выделяли из трансфектированной культуры клеток и использовали для инфицирования с целью повышения титра вируса. Среду, содержащую вирус, получали после двух пассажей инфицирования и использовали для препаративной экспрессии белка. С этой целью в круглые планшеты для культуральных тканей размером 100 см² высеивали 5×10⁷ клеток на планшет и инфицировали при добавлении 1 мл вируссодержащей среды (приблизительно 5 КОЕ). Через 3 сут клетки отделяли от планшета и центрифугировали при 50 об/мин в течение 5 мин. Осадок клеток из 10-20 планшет размером 100 см² ресуспендировали в 50 мл охлажденного льдом буферного раствора для лизиса (25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ EDTA, 1% NP-40, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF). Клетки перемешивали на льду в течение 15 мин и затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Центрифугированный клеточный лизат наносили на колонку с глютатион-сефарозой объемом 2 мл (фирмы Pharmacia) и промывали 3 раза по 10 мл 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 200 мМ NaCl. Затем элюировали меченные GST белки 10 раз по 1 мл буферного раствора 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ восстановленный глютатион, 10 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 10% глицерин и хранили при -70°С.

Киназную активность в 200-500 нг различных мутантов KIT определяли в присутствии или отсутствие ингибиторов в буферном растворе (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 3 мМ MnCl₂, 3 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 10 мкМ Na₃VO₄, 3 мкг/мл поли(Glu, Tyr), 4:1, 1% ДМСО, 1,5 мкМ АТФ (γ-[³³Р]-АТФ, 1 мкКи)). Анализ (30 мкл) проводили в 96-луночных планшетах при комнатной температуре в течение 30 мин и реакцию останавливали добавлением 20 мкл 125 мМ EDTA. Затем 30 мкл реакционной смеси переносили на мембрану Immobilon-PVDF (фирмы Millipore, Bedford, MA, США), которую предварительно пропитывали метанолом в течение 5 мин, промывали водой, затем пропитывали 0,5% Н₃РO₄ в течение 5 мин и помещали в вакуумную ячейку с отключенным вакуумным насосом. После нанесения всех образцов включали вакуумный насос и каждую лунку промывали 200 мкл 0,5% Н₃РO₄. Мембраны извлекали и промывали на качалке 4 раза 1,0% Н₃РO₄ и 1 раз метанолом. После высушивания мембран при комнатной температуре и добавления в каждую лунку по 10 мкл сцинтилляционного раствора Microscint (Packard) определяли радиоактивность в 96-луночной ячейке в счетчике радиоактивности Packard TopCount. Величины IC₅₀ рассчитывали методом линейного регрессионного анализа в виде процента ингибирования для каждого соединения в двух повторах при 4 концентрациях (обычно 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ). Одна единица киназной активности означает 1 нмоль ³³Р, перенесенного из γ-[³³Р]-АТФ на белок-субстрат в минуту на мг белка при комнатной температуре.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для лечения зависимых от киназы KIT заболеваний, которые характеризуются мутантными формами киназы KIT. Способ осуществляют следующим образом. Идентифицируют мутант киназы KIT и вводят соединение А, ингибирующее мутантную форму киназы KIT. Использование изобретения позволяет лечить зависимые от киназы KIT заболевания за счет подавления сигнального каскада этого фермента, приводящего к избыточной пролиферации клеток. 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ лечения зависимого от киназы KIT заболевания у пациента, включающий идентификацию мутантной формы киназы KIT, ассоциированной с зависимым от киназы KIT заболеванием, и введение указанному пациенту эффективного ингибирующего мутант киназы KIT количества ингибитора - соединения А.
Соединение А

2. Способ по п.1, в котором мутантную форму киназы KIT выбирают из следующих мутантов: D816F, D816H, D816N, D816Y, D816V, К642Е, Y823D, Del 550-558, Del 557-561, N822K, V654A, N822H, Del 550-558+V654A, Del 557-561 + V654A, Ins503AY, V560G, 558NP, Del 557-558, Del VV559-560, F522C, Del 579, R634W, К642Е, T801I, C809G, D820Y, N822K, N822H, Y823D, Y823C и Т6701.

3. Способ по п.2, в котором мутантную форму киназы KIT выбирают из следующих мутантов: D816F, D816H, D816N, D816Y, D816V, К642Е, Y823D, Del 550-558, Del 557-561, N822K, V654A, N822H, Del 550-558+V654A, Del 557-561 + V654A.

4. Способ по п.1, в котором зависимое от киназы KIT заболевание является устойчивым к лечению иматинибом.

5. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является D816N, а ингибитором является соединение А.

6. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является K642Е, а ингибитором является соединение А.

7. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является Y823D, а ингибитором является соединение А.

8. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является Del 550-558, а ингибитором является соединение А.

9. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является Del 557-561, а ингибитором является соединение А.

10. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является N822K, а ингибитором является соединение А.

11. Способ по п.3, в котором мутантной формой киназы KIT является N822H, а ингибитором является соединение А.

12. Способ по п.2, в котором мутантную форму киназы KIT выбирают из группы, включающей D816H, D816N, К642Е, Y823D, Del 550-558, Del 557-561, N822K и N822H, а ингибитором является соединение А.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором зависимое от киназы KIT заболевание выбирают из следующих заболеваний: заболевания тучных клеток, острый миелогенный лейкоз, желудочно-кишечные стромальные опухоли, семиномы и дисгерминомы.