КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ НАПРАВЛЕННОГО УСТРАНЕНИЯ МУТАЦИОННОГО УСКОЛЬЗАНИЯ В НАПРАВЛЕННОЙ ТЕРАПИИ РАКА Российский патент 2014 года по МПК A61K39/00 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам их применения в комбинации с противоопухолевыми терапевтическими средствами для обеспечения направленного устранения мутационного ускользания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Новые открытия в биологии рака обеспечили возможность разработки специфичных противоопухолевых средств направленного действия и способствовали успешной разработке лекарственных средств. Указанные открытия позволяют создавать молекулы, обладающие высокой селективностью в отношении специфичных мишеней в опухолевых клетках. Segota & Bukowski, Cleveland Clinic J. Med., 71(7):551-560 (2004). Например, успех ингибитора Bcr-Abl тирозинкиназы, иматиниба (Гливека), при лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) вызвал большие ожидания относительно данного направленного метода. Capdeville et al., Nature Reviews, 1:493-502 (2002). Направленная терапия рака вместе с тем приводит к сложной проблеме: у мишеней появляются мутации ускользания, приводящие, в конечном счете, к развитию устойчивости к лекарственному средству. Например, сообщалось, что мутации, как было установлено, возникали у пациентов, которые первоначально реагировали на терапию с применением Гливека и которые в результате указанных мутаций стали невосприимчивы к дальнейшему лечению с применением Гливека. Gorre et al., Science, 293:876-880 (2001); Shah et al., Cancer Cell, 2:117-125 (2002); Branford et al., Blood, 99(9):3742-3745 (2002); Deininger et al., Blood, 105(7):2640-263 (2005); Walz et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 57:145-164 (2006); а также Burgess et al., TheScientificWorldJOURNAL, 6:918-930 (2006). Точно так же мутации в рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR) были обнаружены у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), которые, как сообщалось, делали их устойчивыми к действию терапевтических средств, таких как гефитиниб (Иресса) или эрлотиниб (Тарцева), которые специфично воздействуют на EGFR. Kobayashi et al., N. Engl. J. Med., 352(8):786-792 (2005). Поэтому эффективность указанных противоопухолевых препаратов существенно ограничена в результате возникновения мутаций, приводящих к ускользанию.

Таким образом, предпочтительно, по меньшей мере, минимизировать возникновение мутантов, которые появляются при введении терапевтических и/или профилактических средств.

Способы активации иммунного ответа описаны, например, в Thyphronitis et al., Anticancer Research, Vol. 24:2443-2454 (2004) and Plate et al., Journal of Cell Biology, Vol. 94:1069 (2005). Дрожжевые системы описаны, например, в патенте США 5830463, Stubbs et al., Nature Med. 5:625-629 (2001); Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004); а также Franzusoff, et al., Expert Opin. Bio. Ther. Vol.5:565-575 (2005).

Все ссылки, приведенные в настоящей заявке, включая патенты, заявки на патент и публикации, настоящим включены путем отсылки в полном объеме.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы направленного устранения мутационного ускользания, связанного с раком. В одном из аспектов, изобретение обеспечивает способы направления устранения мутационного ускользания у человека, нуждающегося в этом, посредством введения человеку эффективного количества терапевтического средства направленного действия, где терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора тирозинкиназы, ингибитора Src киназы, средства, влияющего на стабильность Bcr-Abl, и средства, которое действует в сигнальном пути, следующем после Bcr-Abl, а также композиции, включающей одно или несколько из следующего: i) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп; ii) дрожжевой носитель, включающий по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп; iii) дрожжевой носитель совместно с, по меньшей мере, одним мутантным полипептидом, ассоциированным с раком, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом; iv) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку; или v) дрожжевой носитель и, по меньшей мере, один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку, где мутантный полипептид, как известно, появляется, или появился, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия для лечения рака. В некоторых аспектах терапевтическое средство направленного действия представляет собой ингибитор тирозинкиназы. В одном из аспектов ингибитором тирозинкиназы является иматиниб. В других аспектах ингибитор тирозинкиназы выбран из группы, состоящей из иматиниба, нилотиниба, PD1866326, PD180970, AP23464, BMS-354825, ON012380, VX-680 и BIRB-796.

В другом аспекте терапевтическое средство направленного действия представляет собой ингибитор Src киназы. В некоторых примерах ингибитор Src киназы выбран из группы, состоящей из PD166326, PD180970, AP23464, BMS-354825, AZM475271, PP1, PP2, AP-23236, CGP76030 и PD173955. В другом аспекте терапевтическим средством направленного действия является PKC412 или SU11248. В других аспектах терапевтическое средство направленного действия влияет на стабильность Bcr-Abl. В некоторых примерах средство направлено на белки теплового шока или другие белки-шапероны, которые ассоциированы с Bcr-Abl. В других примерах средство представляет собой гелданамицин/17-AAG или NVP-LAQ824.

В другом аспекте терапевтическое средство направленного действия действует в сигнальном пути, следующим после Bcr-Abl. В некоторых примерах средство выбрано из группы, состоящей из SCH66336, BAY-439006, CI-1040, LY294002, вортманнин, OSU-03012, CCI-779, R115777, BMS-214662, U0126, PD184352, рапамицин, RAD001, CCI-779 и AP23573.

Изобретение также обеспечивает наборы для направленного устранения ассоциированного с раком мутационного ускользания у человека, у которого мутационное ускользание, как известно, появляется, или уже появилось, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия, и где набор включает композицию любого из вышеуказанных терапевтических средств.

Изобретение также обеспечивает наборы для направленного устранения ассоциированного с раком мутационного ускользания у человека, у которого мутационное ускользание, как известно, появляется, или уже появилось, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия, и где набор включает дрожжевой носитель и, по меньшей мере, один мутантный полипептид, его фрагменты, которые включают мутацию, или мимотопы. В одном из аспектов набор дополнительно включает терапевтическое и/или профилактическое средство направленного действия. В другом аспекте набор дополнительно включает инструкцию по применению набора.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг.1 показана кривая выживаемости при лейкемии дикого типа BCR-ABL для контрольных мышей по сравнению с вакцинированными.

На Фиг.2 показана кривая выживаемости при мутантной лейкемии для контрольных мышей по сравнению с вакцинированными.

На Фиг.3 показана кривая выживаемости для мышей, иммунизированных двумя различными конструкциями Tarmogen: GI-10,001 (Tarmogen, содержащий три мутации ускользания (E255K, T315I и M351T)) и GI-10,002 (Tarmogen, содержащий одну мутацию ускользания (T315I)).

На Фиг.4 показан подсчет количества лейкозных клеток у контрольных мышей по сравнению с вакцинированными. Мышей вакцинировали с применением Tarmogen, содержащего мутацию ускользания T315I. По оси Y указан процент GFP-положительных клеток. Два открытых круга вблизи 0 указывают вакцинированных мышей, которые демонстрируют весьма небольшое количество лейкозных клеток.

На Фиг.5 показан подсчет количества лейкозных клеток у мышей, которых либо не вакцинировали, либо вакцинировали с применением GI-10,001 (Tarmogen, содержащий три мутации ускользания (E255K, T315I и M351T)) или GI-10,002 (Tarmogen, содержащий одну мутацию ускользания (T315I)).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует потребность в профилактических и терапевтических средствах, которые специфично воздействуют на сигнальные пути, которые являются уникальными для опухолевых клеток, однако при этом существует проблема, что опухолевые клетки подвергаются мутации (мутациям), которые позволяют им "ускользать" от воздействия лекарственного средства (средств) и/или становиться устойчивыми. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы направленного устранения мутационного ускользания, связанного с профилактическими или терапевтическими средствами (также упомянутыми в настоящей заявке как мутантный полипептид). Указанные композиции и способы могут применяться для активации иммунного ответа против мутантного полипептида, который, как известно, появляется, или уже появился, в ответ на лекарственное средство направленного действия или на клетку, которая экспрессирует мутантный полипептид. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом, в некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным ответом, а в другом примере иммунный ответ является и клеточным, и гуморальным. В некоторых примерах клеточный иммунный ответ направлен на устранение клетки, такой как, например, опухолевая клетка или клетка, которая поддерживает рост опухоли, которая избежала устранения, и включает мутации в полипептиде, на который воздействует лекарственное средство, но устранение клетки при этом не требуется. В некоторых примерах клеточный и/или гуморальный иммунный ответ блокирует пролиферацию клеток или репликацию.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы активации иммунного ответа против мутантного полипептида, или клетку, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид, и/или экспрессирует мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства (средств). В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. В некоторых примерах мутантный полипептид кодируется онкогеном и/или экспрессируется опухолевой клеткой. В некоторых примерах мутантный полипептид ассоциирован с или экспрессируется опухолевой клеткой. В некоторых примерах средство направлено на опухолевую клетку. В некоторых примерах средство представляет собой небольшую молекулу или антитело.

Терапевтические средства направленного действия включают, помимо прочего, средства, которые ингибируют киназную активность белков, экспрессия (или сверхэкспрессия) которых связана с развитием и ростом опухоли. Примеры подобных киназ включают Bcr-Abl, Src, Src/Akt, EGFR, PDGFR, Raf, Mek, Erk, PI3K, PDK, PDK, AKT и mTOR. В других примерах средства действуют как общие ингибиторы указанных белков и другого белка при их выработке. В некоторых примерах средства действуют через прямое связывание с активным сайтом белка, а в других случаях средства вызывают аллостерические изменения в белке, влияя на его активность. Композиции, описанные в настоящей заявке, применяются в комбинации с указанными терапевтическими средствами направленного действия в целях контроля и/или устранения "ускользнувших" мутантов, которые появляются в результате применения указанных терапевтических средств направленного действия.

Общие методики

При осуществлении настоящего изобретения используются, если не указано иное, стандартные методы молекулярной биологии (включая методы генной инженерии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, химии нуклеиновых кислот и иммунологии, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, например, в Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics: a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989), а также Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russell, 2001), (в настоящем описании в целом упоминаются как "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, включая дополнения по 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (в настоящем описании в целом упоминаются как "Harlow and Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000) и Vaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999).

Определения

Используемый в настоящем описании термин "рак" включает, помимо прочего, меланомы, плоскоклеточную карциному, раковые опухоли молочной железы, карциномы головы и шеи, карциномы щитовидной железы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, раковые опухоли яичка, раковые опухоли простаты, раковые опухоли яичников, раковые опухоли мочевого пузыря, раковые опухоли кожи, раковые опухоли мозга, ангиосаркомы, гемангиосаркомы, тучноклеточные опухоли, первичные раковые опухоли печени, раковые опухоли легкого, раковые опухоли поджелудочной железы, желудочнокишечные раковые опухоли, почечноклеточные карциномы, неоплазии кроветворной системы, лейкозы, а также метастатические раковые опухоли.

Используемое в настоящем описании терапевтическое и/или профилактическое "средство" или "лекарственное средство", направленное на клетку, означает, что средство направлено на молекулу (молекулы), ассоциированную с или ответственную за трансформацию клетки, или поддерживающую рост опухоли в случае рака. Примеры терапевтических и/или профилактических средств, которые направлены на клетку, такую как раковая клетка, описаны в настоящей заявке и известны в уровне техники.

Используемый в настоящем описании термин "мутантный полипептид" охватывает полноразмерный полипептид, кодируемый геномом, а также его фрагмент, при условии, что фрагмент включает мутацию, которая, как известно, появляется или появилась в результате специфичной мутации в ответ на средство, такое как профилактическое и/или терапевтическое средство. Такие мутантные полипептиды, которые появляются со специфичной мутацией в ответ на средство, такое как профилактическое и/или терапевтическое средство, направленное на клетку, такую как раковая клетка, обычно упоминаются в уровне техники как "ускользнувшие мутанты". Мутантные полипептиды также упомянуты в настоящем описании как "мутационное ускользание", а также "ускользнувший мутант". Мутация может быть обнаружена в любой области полноразмерного полипептида и может включать аминокислотную замену, вставку или делецию, или их комбинацию, или слияние непоследовательных последовательностей, как при транслокации. В некоторых примерах мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на средство, является иммуногенным сам по себе, то есть, без присутствия адъюванта или другого вектора или носителя, такого как дрожжевой носитель, но это не обязательно. В других примерах мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился в ответ на средство, является иммуногенным совместно с адъювантом, который усиливает его антигенные свойства.

Используемый в настоящем описании термин "адъюванты" включает, например, лиганд-агонист Toll-подобного рецептора (TLR), который активирует ответы цитокинов врожденного иммунитета, и который, как сообщают, связан с созреванием и активацией антиген-презентирующих клеток (АПК); CpG нуклеотидные последовательности; одно- или двунитевые РНК (агонисты TLR7); липидные остатки, такие как липополисахарид (ЛПС); маннаны и глюканы, компоненты дрожжей (которые, как сообщают, функционируют через взаимодействие с TLR 2, 4 и 6); и дрожжевые носители, такие как описанные в настоящей заявке.

Введение мутантного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид (который может быть получен любым из способов, раскрытых в настоящем описании или известных в уровне техники) "совместно" со средством не означает, что мутантный полипептид и средство вводят одновременно, хотя это включено в способы, описанные в настоящей заявке. Мутантный полипептид может быть введен перед, одновременно с или после введения средства, или в комбинации вышеперечисленного. Мутантный полипептид или нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид, могут быть введены через несколько часов, дней или месяцев после введения средства. В некоторых примерах введение мутантного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид (который может быть получен любым из способов, раскрытых в настоящем описании или известных в уровне техники) проводят перед введением средства, а дополнительно могут проводить после введения средства, в особенности, если средство, как известно, прямо или опосредованно воздействует на пролиферацию клеток какого-либо типа.

Используемый в настоящем описании термин "мимотоп" относится к пептидному эпитопу, который имитирует способность пептида или полипептида вызывать иммунный ответ, а в некоторых примерах клеточный и/или гуморальный иммунный ответ, к целевому полипептиду или клетке, экспрессирующей целевой полипептид. Используемый в настоящем описании термин "мимотоп" включает, помимо прочего, пептид, который имитирует один или несколько эпитопов мутантного полипептида, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства. Такие мимотопы могут быть получены с использованием полученных при помощи компьютера структур MHC-пептидных комплексов и предполагаемые обязательные участки связывания с рецептором клетки T. Мимотопы могут быть также получены посредством генерации рандомизированных молекул, например олигонуклеотидов, пептидов или других органических молекул, и скрининга таких образцов на предмет их способности вызывать иммунный ответ, например, клеточный иммунный ответ, с помощью способов и анализов, описанных в настоящей заявке и известных из уровня техники.

Используемое в настоящем описании "улучшение симптомов болезни или инфекции" включает смягчение, стабилизацию, изменение, замедление или задержку какого-либо симптома и/или развития состояния заболевания, которые можно оценить в соответствии с клиническими и/или субклиническими критериями.

В некоторых примерах "эффективное количество" мутантного полипептида (или его мимотопа) или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид, соответствует количеству, способному вызывать иммунный ответ при введении млекопитающему. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ является гуморальным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным и гуморальным ответом.

Используемые в настоящем описании понятия "млекопитающее" или "млекопитающее-хозяин" включают человека и приматов, кроме человека, таких как шимпанзе, а также другие виды высших и низших приматов; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овца, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничьих (дичь), таких как куры, индюки и другие куриные, утки, гуси и т.п. Данное понятие не обозначает конкретный возраст. Таким образом, включены взрослые, незрелые и новорожденные особи, а также пренатальные млекопитающие.

"Антиген" относится к молекуле, содержащей один или несколько эпитопов (либо линейные, либо конформационные, или и те, и другие) или иммуногенные детерминанты, которые стимулируют иммунную систему организма-хозяина, например, иммунную систему млекопитающего, вызывая антиген-специфичный гуморальный и/или антиген-специфичный клеточный ответ. Антиген может быть "иммуногеном" самостоятельно или совместно со средством, которое усиливает его антигенные свойства. Термин "антиген" включает цельный белок, процессированный белок, фрагмент белка, пептида и пептидный мимотоп. Антигены могут иметь природное происхождение, или являться генно-инженерными вариантами белка. Антигены могут иметь природное происхождение, или являться генно-инженерными вариантами белка. Термин "антиген" включает субъединичные антигены (то есть, антигены, которые являются отдельными и дискретными от целого организма, с которым антиген связан в природе). Антитела, такие как антиидиотипические антитела или их фрагменты, а также синтетические пептидные мимотопы, которые являются синтетическими пептидами, способными имитировать антиген или антигенную детерминанту, также подпадают под определение антигена, используемое в настоящей заявке. В некоторых примерах антиген включает мутантный полипептид или может быть получен из мутантного полипептида, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на профилактическое и/или терапевтическое средство, и может быть природным или синтетическим. Антиген может являться всего лишь одним эпитопом, или может быть больше и включать несколько эпитопов. Таким образом, размер антигена может составлять всего лишь приблизительно 5-12 аминокислот (например, пептид), или же соответствовать размеру полноразмерного белка, включая мультимеры и слитые белки, химерные белки, цельные клетки, цельные микроорганизмы или их части (например, лизаты цельных клеток или экстракты микроорганизмов). Следует понимать, что в некоторых примерах (то есть, когда антиген экспрессируется вектором, таким как дрожжевой вектор или вирус, с молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты) антиген включает, помимо прочего, белок или его фрагмент, слитый белок, химерный белок, мультимеры, а не всю клетку или микроорганизм.

Используемый в настоящей заявке термин "эпитоп" определен в настоящем описании как отдельный антигенный сайт в пределах данного антигена, который является достаточным, чтобы вызвать иммунный ответ, который может быть клеточным и/или гуморальным иммунным ответом. Специалисты в данной области осведомлены, что эпитопы T-клеток имеют другой размер и состав по сравнению с эпитопами B-клеток, и что эпитопы, презентируемые посредством главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC), отличаются от эпитопов, презентируемых посредством MHC класса II. Обычно эпитоп B-клетки включает, по меньшей мере, приблизительно 5 аминокислот, но может включать всего лишь 3-4 аминокислоты. Эпитоп T-клетки, такой как эпитоп цитотоксического T-лимфоцита (CTL), включает, по меньшей мере, приблизительно 7-10 аминокислот, а эпитоп хелперной T-клетки, по меньшей мере, приблизительно 12-20 аминокислот. В данном контексте антиген может являться мимотопом, который более эффективен при активации и амплификации T-клеток, способных узнавать клетки, экспрессирующие мутированный полипептид. Обычно эпитоп, узнавание которого T-клетками приводит к устранению целевой клетки, включает приблизительно 7-15 аминокислот, например, 8, 9, 10, 12 или 15 аминокислот.

Используемые в настоящем описании понятия "иммунологический ответ" или "иммунный ответ" к мутантному полипептиду (или его мимотопу) или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид (или к нуклеиновой кислоте, способной связываться с мутантным полипептидом, такой как, например, миРНК или антисмысловая РНК), или композиции, включающей полипептид или нуклеиновую кислоту, включает развитие у млекопитающего клеточного иммунного ответа, который узнает полипептид. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В некоторых примерах клеточный иммунный ответ дополнительно включает гуморальный иммунный ответ. Иммунный ответ может быть специфичным к мутантному полипептиду, но это не обязательно. Иммунный ответ, активируемый в результате введения мутантного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, может быть любым детектируемым увеличением любого аспекта иммунного ответа (например, клеточным ответом, гуморальным ответом, выработкой цитокинов) по сравнению с иммунным ответом без введения полипептида или нуклеиновой кислоты. Иммунный ответ может являться специфичным ответом к мутантному полипептиду, но это не обязательно. Настоящее изобретение охватывает композиции совместно с мутантным полипептидом (или его мимотопом) или нуклеиновой кислотой, кодирующей мутантный полипептид, который вызывает иммунный ответ.

Используемый в настоящем описании "гуморальный иммунный ответ" относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител или иммуноглобулинами. Молекулы антител настоящего изобретения включают классы IgG (а также подтипы IgG1, IgG2a и IgG2b), IgM, IgA, IgD и IgE. Антитела функционально включают антитела первичного иммунного ответа, а также антитела вторичного иммунного ответа или сывороточные нейтрализующие антитела. Что касается инфекционной болезни, антитела настоящего изобретения могут служить, но не обязательно, в целях нейтрализации или уменьшения инфекционности вируса, кодирующего мутантный полипептид, и/или опосредуют комплементзависимую (CDC) или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении мутантного полипептида.

Используемый в настоящем описании "клеточный иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредованный T-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами, включая без ограничения натуральные киллерные (NK) клетки и макрофаги. T-лимфоциты настоящего изобретения включают T-клетки, экспрессирующие субъединицы альфа/бета рецептора T-клеток, или T-клетки, экспрессирующие гамма/дельта рецептор, и могут являться либо эффекторными, либо супрессорными T-клетками.

Используемые в настоящем описании термины "T-лимфоциты" или "T-клетки" являются непродуцирующими антитела лимфоцитами, которые составляют часть клеточно-опосредованной составляющей иммунной системы. T-клетки происходят от незрелых лимфоцитов, которые мигрируют из костного мозга в тимус, где они подвергаются процессу созревания под контролем гормонов тимуса. Созревающие T-клетки становятся иммунокомпетентными на основе своей способности узнавать и связывать специфичный антиген. Активация иммунокомпетентных T-клеток инициируется, когда антиген связывается с поверхностными рецепторами лимфоцита. Известно, что для генерации T-клеточных ответов антиген должен синтезироваться внутри или поступать в клетки, затем подвергаться процессингу под действием протеасомного комплекса с образованием небольших пептидов, и перемещаться в секреторный путь эндоплазматического ретикулума/комплекса Гольджи для последующего соединения с белками главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I. В альтернативе пептидные антигены могут поступать из внешней среды клеток, замещая пептиды, уже связанные с рецепторами MHC-I или MHC-II. Функционально клеточный иммунитет включает клетки антиген-специфичных цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ).

Используемые в настоящем описании понятия "антиген-специфичные киллерные Т-клетки", "ЦТЛ" или "цитотоксические T-клетки" относятся к клеткам, которые обладают специфичностью к пептидным антигенам, презентированным в комплексе с белками MHC или лейкоцитарными антигенами человека (HLA), когда указанные белки, представляют собой белки человека. ЦТЛ настоящего изобретения включают активированные ЦТЛ, инициированные специфичным антигеном в контексте MHC; и ЦТЛ памяти или вторичные ЦТЛ, которые относятся к T-клеткам, повторно активированным в результате повторного воздействия антигена, а также перекрестно-реактивные ЦТЛ или ЦТЛ, реактивные в отношении различных подтипов. ЦТЛ настоящего изобретения включают CD4+ и CD8+ T-клетки. Активированные антиген-специфичные ЦТЛ настоящего изобретения вызывают разрушение и/или лизис клеток индивида, инфицированного патогеном, в отношении которого специфичны ЦТЛ, блокируя проникновение патогена посредством секреции хемокинов и цитокинов, включая в частности воспалительный белок макрофагов 1α (MIP-1α), MIP-1β и RANTES; и секреции растворимых факторов, которые подавляют инфекции. Клеточный иммунитет настоящего изобретения также относится к антиген-специфичному ответу, вырабатываемому подгруппой T-клеток - T-хелперами. Хелперные T-клетки способствуют стимуляции функции, а также фокусируют активность неспецифичных эффекторных клеток в отношении клеток, презентирующих на своей поверхности пептид в комплексе с молекулами MHC. Клеточный иммунный ответ также относится к выработке цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными T-клетками и/или другими лейкоцитами, включая молекулы, вырабатываемые CD4 и CD8 T-клетками и NK-клетками. Композиция, которая вызывает клеточный иммунный ответ, может служить с целью сенсибилизации млекопитающего посредством презентирования полипептида в комплексе с молекулами MHC на поверхности клетки. Клеточно-опосредованный иммунный ответ направлен на, или вблизи, клетки, презентирующие антиген на своей поверхности. Кроме того, антиген-специфичные T-лимфоциты могут быть выработаны, чтобы обеспечить будущую защиту иммунизируемого организма-хозяина.

Способность определенного полипептида или антигена стимулировать клеточно-опосредованный иммунологический ответ может быть определена рядом анализов, известных в уровне техники, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), киллинг-анализы ЦТЛ, или посредством анализа на наличие T-лимфоцитов, специфичных к антигену, у сенсибилизированного индивида. Подобные анализы известны в уровне техники. См., например, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. Другие способы измерения клеточно-опосредованных иммунных ответов включают измерение уровней внутриклеточных цитокинов или цитокинов, секретируемых популяциями T-клеток, или измерение эпитоп-специфичных T-клеток (например, метод МНС-тетрамеров) (см. обзор McMichael, A. J., and O'Callaghan, C. A., J. Exp. Med. 187(9)1367-1371, 1998; Mcheyzer-Williams, M. G., et al, Immunol. Rev. 150:5-21, 1996; Lalvani, A., et al, J. Exp. Med. 186:859-865, 1997).

Используемый в настоящем описании "иммунологический ответ", или "иммунный ответ" охватывает иммунный ответ, который стимулирует продукцию ЦТЛ, и/или продукцию или активацию хелперных T-клеток, и/или антитело-опосредованный иммунный ответ. "T-лимфоциты" или "T-клетки" являются непродуцирующими антитела лимфоцитами, которые составляют часть клеточно-опосредованной составляющей иммунной системы. T-клетки происходят от незрелых лимфоцитов, которые мигрируют из костного мозга в тимус, где они подвергаются процессу созревания под контролем гормонов тимуса. Здесь зрелые лимфоциты быстро делятся до очень большого количества. Созревающие T-клетки становятся иммунокомпетентными на основе своей способности узнавать и связывать специфичный антиген. Активация иммунокомпетентных T-клеток индуцируется, когда антиген связывается с поверхностными рецепторами лимфоцита в контексте презентирования рецепторами MHC/HLA и корецепторами.

Используемая в настоящем описании "иммуногенная композиция" является композицией, которая включает мутантный полипептид (или включает соответствующий мимотоп мутированного эпитопа) или нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на терапевтическое и/или профилактическое средство, и может включать или не включать адъювант, который усиливает антигенные свойства мутантного полипептида, где введение композиции млекопитающему приводит к развитию клеточного иммунного ответа, гуморального иммунного ответа или клеточного и гуморального иммунного ответа. Иммуногенная композиция включает композицию, способную индуцировать защитный клеточный иммунный ответ, но это не обязательно.

Используемая в настоящем описании "профилактическая композиция" относится к композиции, которую вводят млекопитающему индивиду или хозяину, который является "иммунологически интактным" или не подвергался ранее воздействию антигена патогена или тому, кто не производит эффективный иммунный ответ против патогена с целью предотвращения болезни, такой как рак и инфекция или повторная инфекция (впрочем, настоящее изобретение не требует, чтобы инфекция или повторная инфекция были полностью предотвращены). Профилактические композиции настоящего изобретения не обязательно индуцируют абсолютный иммунитет у хозяина или индивида, которому они были введены.

Используемая в настоящем описании "терапевтическая композиция" относится к композиции, которую вводят индивиду или хозяину, подверженному раку, и, в некоторых примерах, перешедшему в стадию заболевания.

Используемые в настоящем описании термины "иммунизация", "иммунизировать" или "иммунизированный" относятся к способу введения иммуногенной композиции живому млекопитающему индивиду или хозяину в количестве, эффективно вызывающем иммунный ответ к композиции. В некоторых примерах иммунный ответ включает клеточный иммунный ответ, например, ответ цитотоксических Т-клеток. В некоторых примерах иммунный ответ включает гуморальный ответ, например выработку антител. В некоторых примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный ответ.

Композиции на основе дрожжей и способы

Настоящее изобретение обеспечивает дрожжевые векторы, дрожжевые носители и композиции на основе дрожжей, которые включают мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на средства. Используемые в настоящем описании термины "дрожжевой вектор" и "дрожжевой носитель" используются попеременно и включают, помимо прочего, цельную дрожжевую клетку, дрожжевой сферопласт, дрожжевой цитопласт, дрожжевую клеточную тень, а также субклеточный экстракт дрожжевой мембраны или его фракцию. В некоторых примерах дрожжевая клетка или дрожжевой сферопласт используют для получения дрожжевого носителя, который в некоторых примерах включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид, причем полипептид экспрессируется дрожжевой клеткой или дрожжевым сферопластом. В некоторых примерах дрожжевой носитель может быть получен из непатогенных дрожжей. В других примерах дрожжевой носитель может быть получен из дрожжей, выбранных из группы, состоящей из: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hansenula, Candida и Pichia. В некоторых примерах Saccharomyces представляет собой S. cerevisiae.

В целом дрожжевой носитель и мутантный полипептид могут быть объединены любым способом, описанным в настоящей заявке. В некоторых примерах мутантный полипептид вводят в дрожжевой носитель внутриклеточно. В других примерах мутантный полипептид ковалентно или нековалентно присоединяют к дрожжевому носителю. В дополнительных примерах дрожжевой носитель и мутантный полипептид объединяют посредством смешивания. В других примерах мутантный полипептид экспрессируется рекомбинантно дрожжевым носителем, либо дрожжевой клеткой или дрожжевым сферопластом, из которых был получен дрожжевой носитель.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает дрожжевые носители, которые охватывают любую дрожжевую клетку (например, цельную или интактную клетку) или ее производное, которые могут применяться совместно с мутантным полипептидом в композиции, или в качестве адъюванта. При этом дрожжевой носитель может включать, помимо прочего, живой интактный дрожжевой микроорганизм (то есть, дрожжевую клетку, содержащую все ее компоненты, включая клеточную стенку), убитый (мертвый) интактный дрожжевой микроорганизм или их производные, включающие: дрожжевой сферопласт (то есть, дрожжевую клетку, лишенную клеточной стенки), дрожжевой цитопласт (то есть, дрожжевую клетку, лишенную клеточной стенки и ядра), дрожжевую клеточную тень (то есть, дрожжевую клетку, лишенную клеточной стенки, ядра и цитоплазмы) или субклеточный экстракт дрожжевой мембраны или его фракции (также указанные выше, как субклеточная дрожжевая частица).

Дрожжевые сферопласты обычно получают ферментативным расщеплением клеточной стенки дрожжей. Такой способ описан, например, в Franzusoff et al., Meth. Enzymol. 194: 662-674, (1991). Дрожжевые цитопласты обычно получают путем энуклеации клеток дрожжей. Такой способ описан, например, в Coon, Natl. Cancer Inst. Monogr. 48: 45-55 (1978). Тени дрожжевых клеток обычно получают путем повторного герметизирования пермеабилизованной или лизированной клетки и могут, но не обязательно, содержать, по меньшей мере, некоторые из органелл данной клетки. Такой способ описан, например, в Franzusoff et al., J. Biol. Chem. 258: 3608-3614 (1983) и Bussey et al., Biochim. Biophys. Acta 553: 185-196 (1979). Субклеточный экстракт дрожжевой мембраны или его фракция относятся к дрожжевой мембране, лишенной собственного ядра или цитоплазмы. Частица может иметь любой размер, включая размеры, варьирующие в пределах от размера нормальной дрожжевой мембраны до микрочастиц, полученных при разрушении ультразвуком или другими способами разрушения мембраны, известными специалистам в данной области, с последующей повторной герметизацией. Способ получения субклеточных экстрактов дрожжевых мембран описан, например, в Franzusoff et al., Meth. Enzymol. 194: 662-674 (1991). Можно также использовать фракции экстрактов дрожжевых мембран, которые содержат части дрожжевых мембран, при этом когда антиген рекомбинантно экспрессируется дрожжами перед получением экстракта дрожжевых мембран, целевой антиген является частью экстракта. Дрожжи могут быть также подвергнуты электропорации или в них другим способом могут быть введены целевые антигены, такие как пептиды.

Для получения дрожжевого носителя настоящего изобретения может применяться любой дрожжевой штамм. Дрожжи представляют собой одноклеточные микроорганизмы, которые принадлежат одному из трех классов: аскомицеты, базидиомицеты и дейтеромицеты. Хотя могут использоваться патогенные дрожжевые штаммы или их непатогенные мутанты, в некоторых примерах используются непатогенные штаммы дрожжей. Рода дрожжевых штаммов, используемые в композициях и способах, описанных в настоящей заявке, включают Saccharomyces, Candida (которые могут быть патогенными), Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces и Yarrowia. В некоторых примерах, штаммы дрожжей включают Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia и Schizosaccharomyces. В некоторых примерах штаммы дрожжей относятся к Saccharomyces. Виды дрожжевых штаммов включают Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Следует понимать, что ряд указанных видов включает различные подвиды, типы, подтипы и т.д., которые включены в вышеуказанные виды. В некоторых примерах виды дрожжей включают S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris и S. pombe. В некоторых примерах S. cerevisiae используются, поскольку с ними относительно легко работать, и они "признаны безопасными" или "GRAS" для применения в качестве пищевой добавки (GRAS, FDA proposed Rule 62FR18938, April 17, 1997). В некоторых примерах используется штамм дрожжей, который поддерживает репликацию особо высокого числа копий плазмид, например штамм S. cerevisiae cir°. Другие подходящие штаммы известны в уровне техники.

В некоторых примерах дрожжевой носитель настоящего изобретения способен к слиянию с типом клетки, в которую доставляется дрожжевой носитель и мутантный полипептид, например, дендритную клетку или макрофаг, обеспечивая, таким образом, наиболее эффективную доставку дрожжевого носителя, а во многих примерах антигена, в тип клетки. Используемое в настоящем описании слияние дрожжевого носителя с целевым типом клетки относится к способности мембраны дрожжевой клетки или ее частицы соединяться с мембраной целевого типа клетки (например, дендритной клетки или макрофага), что приводит к формированию синцития. Используемый в настоящем описании синцитий представляет собой многоядерную массу протоплазмы, полученную при слиянии клеток. Однако нужно отметить, что включение направляющей или сливающей молекулы в дрожжевой носитель, хотя это и может потребоваться при некоторых обстоятельствах, не является обязательным. Было показано, что дрожжевые носители легко поглощаются дендритными клетками (а также другими клетками, например макрофагами).

Дрожжевые носители могут быть введены в состав композиции на основе дрожжей, включая композиции, предназначенные для прямого введения людям, подверженным или находящимся под угрозой возникновения рака или инфекции, непосредственно или вначале ex vivo вводимые в носитель, такой как дендритная клетка, с использованием ряда способов, известных специалистам, квалифицированным в данной области, перед введением.

Настоящее изобретение обеспечивает дрожжевые носители и композиции, включающие их, которые включают, по меньшей мере, один мутантный полипептид, предназначенные для введения млекопитающему. Также обеспечиваются дрожжевые носители и композиции, включающие их, которые включают два или три мутантных полипептида, предназначенные для введения животному. Это обычно включает вакцины на основе дрожжей, которые содержат мутантные полипептиды с одним, двумя, тремя или более ускользнувшими мутантами к известному или потенциальному направленному или профилактическому средству. В одном аспекте дрожжевые носители содержат одну мутацию ускользания. В других аспектах дрожжевые носители содержат две мутации ускользания. В других аспектах дрожжевые носители содержат три мутации ускользания.

В некоторых примерах композиция включает одно или несколько из следующего:

i) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп;

ii) дрожжевой носитель, включающий по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп;

iii) дрожжевой носитель совместно с по меньшей мере одним мутантным полипептидом, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом;

iv) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введеный внутриклеточно в дендритную клетку; или

v) дрожжевой носитель и по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку, где мутантный полипептид, как известно, появляется или появился по меньшей мере с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия.

Такие композиции могут включать один, два, немного, несколько или множество мутантных полипептидов, включающих одну или несколько иммуногенных доменов одного или нескольких мутантных полипептидов при необходимости. Используемый в настоящем описании полипептид включает "антиген". Используемый в настоящем описании антиген включает любую часть белка (пептид, фрагмент белка, полноразмерный белок), где белок имеет природное происхождение или получен искусственно, клеточную композицию (цельную клетку, клеточный лизат или разрушенные клетки), организм (целый организм, лизат или разрушенные клетки), углевод, липид или другую молекулу, или их часть, где антиген вызывает антиген-специфичный иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный иммунный ответ).

Дрожжи демонстрируют многие из определенных свойств иммуностимулирующих комплексов, обладая при этом дополнительным преимуществом, которое состоит в том, что они по природе обладают адъювант-подобными свойствами, и с помощью генной инженерии могут быть перестроены для экспрессии различных полипептидов, включая антигены. Lu et al., Cancer Research 64, 5084-5088 (2004) продемонстрировал, что иммунотерапия на основе дрожжей обеспечивала индукцию клеточно-опосредованных иммунных ответов против опухолей, экспрессирующих онкобелки Ras, содержащие одиночные аминокислотные мутации. Результаты продемонстрировали способность дрожжевых носителей и систем на основе дрожжей направлять иммунотерапию против полипептидов, имеющих одиночные аминокислотные мутации. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает дрожжевые носители и композиции на основе дрожжей, включающие мутантный полипептид(ы), который, как известно, появляется или который появился в ответ на средства, а также способы их применения для активации иммунного ответа против мутантного полипептида. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным ответом. В других примерах иммунный ответ является и клеточным, и гуморальным. В некоторых дополнительных примерах дрожжевой носитель сконструирован так, чтобы селективно доставлять антиген в целевые типы клеток. Также обеспечивается дрожжевой носитель, включающий штамм дрожжей, способный продуцировать гетерологичный белок-предшественник, имеющий сайт процессинга с двухосновной аминокислотой. Такой штамм дрожжей способен к правильному процессингу белка-предшественника с образованием, по меньшей мере, одного белка-продукта расщепления.

В некоторых примерах мутантный полипептид кодируется онкогеном, таким как, например, Ras. В некоторых примерах мутантный полипептид - представляет собой опухолеспецифический антиген или белок, экспрессируемый раковыми клетками.

Получение векторов

Настоящее изобретение обеспечивает композиции, включающие вектор, такой как дрожжевой носитель, совместно с мутантным полипептидом. Такой комплекс включает в себя экспрессию полипептида вектором, таким как, например, рекомбинантные дрожжи, введение мутантного полипептида в вектор, физическое присоединение мутантного полипептида к вектору и смешивание вектора и мутантного полипептида, например, в буфере или другом растворе для приготовления композиции. Такие способы считаются обычными для квалифицированного специалиста.

Посредством фигуры дрожжевой вектор описан ниже. В некоторых примерах дрожжевую клетку, используемую для получения дрожжевого носителя, трансформируют молекулой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид, в результате чего полипептид экспрессируется дрожжевой клеткой. Такие дрожжи также указаны в настоящем описании как рекомбинантные дрожжи или рекомбинантный дрожжевой носитель. Затем дрожжевая клетка может быть введена в дендритную клетку в качестве интактной клетки, дрожжевая клетка может являться убитой или она может являться производной, например, полученной путем формирования дрожжевых сферопластов, цитопластов, клеточных теней или субклеточных частиц, после чего любую из них вводят в дендритную клетку. Дрожжевые сферопласты могут быть также непосредственно трансфицированы рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты (например, сферопласт получают от цельных дрожжевых клеток, а затем трансфицируют) с получением рекомбинантныого сферопласта, который экспрессирует антиген.

Согласно настоящему изобретению выделенная молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты, является молекулой нуклеиновой кислоты или последовательностью, которая была удалена, по меньшей мере, от одного компонента, с которым она естественно связана. При этом "выделенный" не обязательно отражает степень очистки молекулы нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, применимая для трансфекции вектора, такого как дрожжевой носитель, включает ДНК, РНК или производные либо ДНК, либо РНК. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может являться двунитевой или однонитевой. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, применимая в настоящем изобретении, включает молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют белок или его фрагмент при условии, что фрагмент содержит, по меньшей мере, одну антигенную детерминанту, применимую в композиции настоящего изобретения.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть трансформированы в вектор, такой как дрожжевой носитель, любым способом, известным в уровне техники, включая, помимо прочих, диффузию, активный транспорт, слияние липосом, электропорацию, обработку в ультразвуковой ванне и генную инженерию.

Молекулы нуклеиновой кислоты, трансформированные в дрожжевые носители, могут включать последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие один или несколько мутантных полипептидов. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут включать частичные или полноразмерные кодирующие области, регуляторные области или их комбинации. Одним из преимуществ дрожжевых штаммов является их способность нести несколько молекул нуклеиновых кислот и возможность продукции нескольких гетерологичных белков. В некоторых примерах ряд антигенов, продуцируемых дрожжевым носителем, является любым количеством антигенов, которое может быть нормально произведено дрожжевым носителем, и обычно находится в пределах от, по меньшей мере, одного до, по меньшей мере, приблизительно 5 или более. В одном примере дрожжевой носитель продуцирует приблизительно от 2 до приблизительно 5 антигенов.

Мутантный полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты в дрожжевом носителе, может являться полноразмерным белком, или может являться функционально эквивалентным белком, в котором аминокислоты были делетированы (например, укороченный вариант белка), вставлены, инвертированы, заменены и/или модифицированы (например, ацетилированы, гликозилированы, фосфорилированы, присоединены глицерофосфатидилинозитольным (GPI) якорем), причем модифицированный белок обладает биологической функцией, по существу аналогичной функции природного белка (или обладает усиленной или ингибированной функцией по сравнению с природным белком, если необходимо). Модификации могут быть выполнены способами, известными в уровне техники, включая, помимо прочих, прямые модификации белка или модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, с использованием, например, классических или генно-инженерных ДНК методов в целях проведения случайного или направленного мутагенеза.

Экспрессия мутантных полипептидов в векторах обеспечивается с использованием способов, известных специалистам, квалифицированным в данной области. Вкратце, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую, по меньшей мере, один целевой мутантный полипептид, встраивают в экспрессионный вектор таким способом, чтобы молекула нуклеиновой кислоты была функционально связана с последовательностью регуляции транскрипции, что дает возможность осуществления конститутивной или регулируемой экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты при трансформации дрожжевой клетки-хозяина. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие один или несколько мутантных полипептидов, могут представлять собой один или несколько векторов экспрессии, функционально связанных с одним или несколькими последовательностями регуляции транскрипции.

В рекомбинантной молекуле настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты функционально связаны с векторами экспрессии, содержащими регуляторные последовательности, такие как последовательности регуляции транскрипции, последовательности регуляции трансляции, ориджины репликации и другие регуляторные последовательности, совместимые с вектором и регулирующие экспрессию молекул нуклеиновой кислоты. В частности рекомбинантные молекулы настоящего изобретения включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются функционально связанными с одной или несколькими последовательностями регуляции транскрипции. Фраза "функционально связанный" относится к соединению молекулы нуклеиновой кислоты к последовательности регуляции транскрипции таким способом, что молекула способна экспрессироваться при трансфекции (то есть, трансформации, трансдукции или трансфекции) в клетку-хозяина.

Последовательности регуляции транскрипции, которые могут регулировать количество продуцируемого белка, включают последовательности, которые регулируют инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Наиболее важными последовательностями регуляции транскрипции являются последовательности, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как промотер и 3'-5' активирующие последовательности. Ряд активирующих последовательностей (UAS), также называемых энхансерами, известны и могут применяться в векторах.

Трансфекция молекулы нуклеиновой кислоты в вектор может быть выполнена любым способом, с помощью которого молекулу нуклеиновой кислоты вводят в клетку, и включает, помимо прочего, диффузию, активный транспорт, обработку в ультразвуковой ванне, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию и слияние протопластов. Трансфицированные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть интегрированы в хромосому или поддерживаться на внехромосомных векторах с использованием способов, известных специалистам в данной области. В случае дрожжей, дрожжевые цитопласты, дрожжевые клеточные тени, а также субклеточные экстракты дрожжевых мембран или их фракции могут быть также получены генно-инженерными методами посредством трансфекции интактных дрожжевых микроорганизмов или дрожжевых сферопластов целевыми молекулами нуклеиновой кислоты, с продукцией в них антигена, а затем дополнительно обрабатывая микроорганизмы или сферопласты с использованием способов, известных специалистам в данной области, с целью получения цитопластов, клеточных теней или субклеточных экстрактов дрожжевых мембран или их фракции, содержащих целевые антигены.

Эффективные условия для получения рекомбинантных векторов и экспрессии мутантного полипептида вектором включают эффективную среду, в которой вектор можно культивировать. Эффективная среда обычно представляет собой водную среду, включающую усвояемые источники углеводов, азота и фосфатов, а также подходящие соли, минеральные вещества, металлы и другие питательные вещества, такие как факторы роста и витамины. Среда может включать сложные питательные вещества или может являться определенной минимальной средой. Векторы настоящего изобретения могут культивироваться в различных емкостях, включая, помимо прочих, биореакторы, колбы Эрленмейера, пробирки, микротитровальные планшеты и чашки Петри. Культивирование проводят при температуре, pH и содержании кислорода, подходящих определенному штамму дрожжей. Такие условия культивирования хорошо известны средним специалистам в данной области (см., например, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).

В одном из примеров настоящего изобретения в качестве альтернативы экспрессии мутантного полипептида в векторе, в вектор, такой как дрожжевой носитель, внутриклеточно вводят мутантный полипептид или пептиды, или мимотопы, которые действуют как эпитопы, активируя T-клеточный иммунный ответ против клеток, несущих мутированный полипептид. Затем вектор, внутриклеточно содержащий эпитопы, специфичные к мутантному полипептиду, можно вводить пациенту или вводить в носитель, например, дендритную клетку (как описано ниже). Что касается дрожжевых носителей, мутантные полипептиды могут быть введены непосредственно в дрожжевые носители настоящего изобретения способами, известными квалифицированным специалистам, например, посредством диффузии, активного транспорта, слияния липосом, электропорации, фагоцитоза, циклов замораживания-оттаивания и обработки в ультразвуковой ванне.

Дрожжевые носители, в которые может быть непосредственно введен мутантный полипептид или пептиды, направленные против мутированных эпитопов, включают интактные дрожжи, а также сферопласты, клеточные тени или цитопласты, в которые антигены могут быть введены после получения, но перед введением в дендритные клетки. В альтернативе, антиген может быть введен в интактные дрожжи, а затем из них могут быть получены сферопласты, клеточные тени, цитопласты или субклеточные частицы. В дрожжевой носитель может быть введено любое количество антигенов, начиная от по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или любого целого числа, до сотни или тысячи антигенов, что обеспечивается, например, при введении микроорганизма, введении опухолевой клетки млекопитающего, или их частей.

В другом примере мутантный антиген физически присоединен к вектору, такому как дрожжевой носитель. Физическое присоединение мутантного полипептида к вектору может быть выполнено любым подходящим способом, известным из уровня техники, включая способы ковалентного и нековалентного присоединения, которые включают, помимо прочих, химическое пришивание мутантного полипептида к внешней поверхности вектора или биологическое связывание мутантного полипептида с внешней поверхностью вектора, например, при помощи антитела или другого связывающего агента. Химическое пришивание может быть выполнено, например, способами, включающими глутаральдегидное связывание, фотоаффинное мечение, обработку карбодиимидами, обработку реагентами, образующими дисульфидные связи, а также обработки другими стандартными сшивающими реагентами. Альтернативно, в случае дрожжей, реагент может контактировать с дрожжевым носителем, изменяя заряд липида бислоя дрожжевой мембраны или состав клеточной стенки, в результате чего к внешней поверхности дрожжей легче присоединялись или связывались антигены, имеющие определенные зарядные характеристики. Направляющие агенты, такие как антитела, связывающие пептиды, растворимые рецепторы и другие лиганды могут быть также включены в мутантный антиген в форме слитого белка или другим способом связаны с антигеном для связывания антигена с вектором.

В еще одном примере вектор и мутантный полипептид связаны друг с другом более пассивным, неспецифичным или нековалентным способом связывания, например, путем мягкого смешивания вектора и антигена в буфере или другой подходящей композиции.

В некоторых примерах изобретения вектор и мутантный антиген вместе вводят внутриклеточно в носитель, такой как дендритная клетка или макрофаг с получением иммуногенной композиции. Дендритная клетка может являться любой дендритной клеткой, известной в уровне техники. Дендритные клетки представляют собой клетки моноцитарных и лимфоцитарных линий, и, как известно, являются наиболее эффективными антигенпрезентирующими клетками (APC) и стимулируют антиген-специфичные T-клеточные ответы. Зрелые дендритные клетки обычно идентифицируют по фенотипу, как имеющие следующие поверхностные маркеры: MAC3^-, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, CD401°w, CD54⁺, MHC класса I и MHC класса II, а также способные к поглощению ФИТЦ-декстрана. Дендритная клетка, используемая в композиции настоящего изобретения, в некоторых примерах взята у пациента, которому предстоит вводить композицию (то есть, является аутологической клеткой). Дендритные клетки могут быть выделены из костного мозга или периферической крови. Такие клетки могут быть получены, например, из моноцитов периферической крови путем культивирования в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, IL-4 и TNF-α, например. Другие способы выделения и получения дендритных клеток известны в уровне техники. (См., например, Wilson et al., 1999, Immunol 162:3070-8; Romani et al., 1994, J. Exp Med 180:83-93; Cauxetal., 1996, J. Exp Med 184:695-706; и Kiertscher et al., 1996, J. Leukoc. Biol. 59:208-18).

Чтобы дендритные клетки могли эффективно презентировать антигены нативным Т-клеткам, незрелые дендритные клетки должны быть активированы, чтобы созреть, что определяет апрегуляция MHC и ко-стимулирующих молекул. Дрожжи обеспечивают мощный активирующий стимул для дендритных клеток через Toll-подобные рецепторы (TLR) и фагоцитарные рецепторы (см. например, D. M. Underhill and B. Gantner, 2004, Microbes and Infection vol. 6: pages 1368-1373; Takeda K. and Akira S., 2005, International Immunology, vol. 17: стр. 1-14), маннановые, глюкановые и дектиновые рецепторы, что приводит к апрегуляции ко-стимулирующих иммунных рецепторов, молекул MHC и секреции иммуномодулирующих цитокинов. Кроме того, когда в дрожжи предварительно вводят антиген перед введением в дендритные клетки, это обеспечивает поступление антигена в дендритные клетки в дискретной, сконцентрированной упаковке, которая быстро поглощается, эффективно увеличивая, таким образом, количество антигена, доступного для процессинга. Квалифицированные специалисты должны быть осведомлены, что для введения в дендритные клетки могут использоваться дополнительные векторы.

Различные формы, в которых может выполняться введение обоих компонентов, более подробно описаны ниже. Используемый в настоящем описании термин "вводимый" и его производные относится к вставке, введению или поступлению компонента (например, дрожжевого носителя и/или антигена) в клетку (например, дендритную клетку). "Вводить компонент внутриклеточно" относится к вставке или поступлению компонента во внутриклеточный компартмент клетки (например, через плазматическую мембрану и, как минимум, в цитоплазму, фагосому, лизосому или некоторое внутриклеточное пространство клетки). "Вводить компонент в клетку" относится к любому методу, с помощью которого компонент либо заставляют поступать в клетку (например, электропорация), либо помещают в окружающую среду (например, в контакте с клеткой или вблизи нее), где компонент с большой долей вероятности проникнет в клетку некоторым способом (например, фагоцитозом). Способы введения включают, помимо прочего, диффузию, активный транспорт, слияние липосом, электропорацию, фагоцитоз и обработку в ультразвуковой ванне. В некоторых примерах используются пассивные способы введения в дендритную клетку дрожжевого носителя и/или антигена, при этом подобные пассивные способы включают фагоцитоз дрожжевого носителя и/или антигена дендритной клеткой.

В случае дрожжей, дрожжевой носитель и мутантный полипептид могут быть введены в дендритную клетку приблизительно в одно и то же время или одновременно, хотя также можно сначала вводить один компонент в клетку, а затем другой, через некоторый промежуток времени. В некоторых примерах дрожжевой носитель и мутантный полипептид объединяют друг с другом перед введением в дендритную клетку. Например, в дендритную клетку может быть введен рекомбинантный дрожжевой носитель, экспрессирующий мутантный полипептид, или любой другой комплекс или смесь дрожжевого носителя и мутантного полипептида. В дендритную клетку может быть дополнительно введен свободный мутантный полипептид, то есть, полипептид, который непосредственно не связан с дрожжевым носителем при его поступлении (введении) в дендритную клетку. Дополнение свободного полипептида комплексом дрожжевого носителя-антигена может обеспечить дополнительное усиление иммунного ответа против полипептида. Свободный полипептид(ы), вводимый в дендритную клетку, не должен быть таким же, как полипептид, экспрессируемый дрожжевым носителем, введенный в дрожжевой носитель или иным способом объединенный с дрожжевым носителем. Таким способом, иммунный ответ против целевой клетки может быть усилен.

В некоторых примерах, композиция, включающая мутантный полипептид или нуклеиновую кислоту, кодирующую его, включает один или несколько адъювантов, включая адъюванты, описанные в настоящей заявке, и/или носители, хотя это и не обязательно. Адъюванты обычно представляют собой вещества, которые в целом усиливают иммунный ответ животного против специфического антигена. Подходящие адъюванты включают, помимо прочих, агонисты TLR, описанные в настоящей заявке, CpG последовательности (см. например, Krieg et al. WO 96/02555), однонитевую РНК, двунитевую РНК, адъювант Фрейнда, другие компоненты бактериальных клеточных стенок (включая ЛПС, флагеллин), соли алюминия, соли кальция, диоксид кремния, полинуклеотиды, анатоксины, сывороточные белки, белки вирусных оболочек, другие бактериальные препараты, гамма-интерферон, блоксополимерные адъюванты, такие как адъювант Hunter's Titermax (CytRx. ТМ., Inc. Norcross, Ga.), адъювант Ribi (поставляемый Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), а также сапонины и их производные, такие как Quil А (поставляемый Superfos Biosector A/S, Дания).

Носители обычно представляют собой соединения, которые увеличивают период полувыведения терапевтической композиции у обработанного животного. Подходящие носители включают, помимо прочих, полимерные композиции регулируемого высвобождения, биоразлагаемые импланты, липосомы, масла, сложные эфиры и гликоли.

Иммуногенные композиции настоящего изобретения могут также включать один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей. Используемый в настоящем описании "фармацевтически приемлемый наполнитель" относится к любому веществу, подходящему для доставки композиции, применяемой в способах настоящего изобретения, в подходящий in vivo или ex vivo участок. В некоторых примерах фармацевтически приемлемые наполнители способны поддерживать вектор (или дендритную клетку, включающую вектор) в такой форме, что при поступлении вектора или клетки в целевую клетку, ткань или участок в организме, вектор (объединенный с мутантным полипептидом) или дендритная клетка (в которую введен вектор и мутантный антиген) способны вызывать иммунный ответ, включая клеточный иммунный ответ, гуморальный иммунный ответ, или и тот, и другой, в целевом участке (при этом нужно отметить, что целевой участок может быть системным). Подходящие наполнители настоящего изобретения включают наполнители или носители, которые переносят, но при этом не направляют композицию или вакцину в участок специфически (также указаны в настоящей заявке как ненаправляющие носители). Примеры фармацевтически приемлемых наполнителей включают, помимо прочих, воду, раствор хлорида натрия, фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, содержащий сыворотку раствор, раствор Ханка, другие водные физиологически сбалансированные растворы, масла, сложные эфиры и гликоли. Водные носители могут содержать подходящие вспомогательные вещества, необходимые для достижения соответствия физиологическим условиям реципиента, например, посредством повышения химической стабильности и изотоничности. Подходящие вспомогательные вещества включают, например, ацетат натрия, хлорид натрия, лактат натрия, хлорид калия, хлорид кальция и другие вещества, используемые для приготовления фосфатного буфера, Трис-буфера и гидрокарбонатного буфера. Вспомогательные вещества могут также включать консерванты, такие как тимеросал, м- или o-крезол, формалин и бензиловый спирт.

Рак

Используемый в настоящем описании рак включает любой тип опухоли или неоплазии, включая, помимо прочих, колоректальный рак, меланомы, плоскоклеточную карциному, раковые опухоли молочной железы, карциномы головы и шеи, карциномы щитовидной железы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, раковые опухоли яичка, раковые опухоли простаты, раковые опухоли яичников, раковые опухоли мочевого пузыря, раковые опухоли кожи, раковые опухоли мозга, ангиосаркомы, гемангиосаркомы, тучноклеточные опухоли, первичные раковые опухоли печени, раковые опухоли легкого, раковые опухоли поджелудочной железы, желудочнокишечные раковые опухоли, почечноклеточные карциномы, неоплазии кроветворной системы, а также метастатические раковые опухоли. Настоящее изобретение рассматривает лейкозы в пределах определения "рак". Хронический миелогенный лейкоз является одним из типов рака, в лечении и профилактике которого рассмотрено применение настоящего изобретения.

Примеры специфичных раковых антигенов включают, помимо прочих, MAGE (включая, помимо прочих, MAGE3, MAGEA6, MAGEA10), NY-ESO-1, gp100, тирозиназу, EGFR, PSA, PSMA, VEG-F, PDGFR, KIT, PMSA, CEA, HER2/neu, Muc-1, hTERT, MART1, TRP-1, TRP-2, Bcr-Abl, а также мутантные онкогенные формы p53 (TP53), p73, Ras, Raf, PTENSrc, p38, BRAF, APC (аденоматозный полипоз толстой кишки), myc, VHL (белок Гиппеля-Линдау), Rb-1 (ретинобластома), Rb-2, BRCA1, BRCA2, AR (рецептор андрогена), Smad4, MDR1 и FLT3.

В некоторых примерах раковый антиген представляет собой или может быть получен из молекулы (такой как белок, пептид, гликопротеин или углевод), которая является подходящей мишенью для терапевтического и/или профилактического средства. Молекулярные мишени для терапевтических и/или профилактических противоопухолевых средств известны в уровне техники и включают, помимо прочих, поверхностные клеточные рецепторы (такие как рецептор тирозинфосфатаз, рецептор серин/треонинкиназ и рецептор тирозинкиназ), молекулы передачи внутриклеточных сигналов (такие как внутриклеточные тирозинкиназы и другие молекулы передачи вторичных сигналов), а также факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла, протеасомные компоненты, белки, участвующие в ангиогенезе, белки, участвующие в регуляции апоптоза, и белки-шапероны.

Направление терапевтических и/или профилактических средств на рак, как наблюдали, приводило к появлению ускользнувших мутантов, то есть, мутантных полипептидов. Например, мутации были обнаружены в Bcr-Abl и, как сообщалось, делали людей, ранее положительно реагирующих на терапию с применением ингибитора тирозинкиназы Bcr-Abl иматиниба (Гливек), резистентными к терапии. Gorre et al., Science, 293:876-880 (2001); Shah et al., Cancer Cell, 2:117-125 (2002); Branford et al., Blood, 99(9):3742-3745 (2002); Deininger et al., Blood, 105(7):2640-263 (2005). Аналогично, у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) также были обнаружены мутации в EGFR, которые делали их резистентными к терапии с применением гефитиниба (Иресса) или эрлотиниба (Тарцева). Kobayashi et al., N. Engl. J. Med., 352(8):786-792 (2005). В результате эффективность указанных противоопухолевых средств значительно ограничена появлением мутантных полипептидов.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает иммуногенные композиции, включающие мутантные полипептиды, кодируемые онкогенами и/или экспрессируемые раковыми клетками, или нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантные полипептиды, которые, как известно, появляются или которые появились со специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства, а также как способы индуцирования иммунного ответа против мутантного полипептида или клетки, экспрессирующей мутантный полипептид. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный ответы.

Полипептидные мутанты раковых антигенов могут существовать у млекопитающего заранее, то есть, присутствовать во время диагностики и селективно появляться в результате введения терапевтического и/или профилактического средства (средств). В альтернативе полипептидные мутанты могут появиться в результате пресса, создаваемого средством. Мутация может быть расположена в любой аминокислотной позиции ракового антигена. Хотя мутации полипептидов описаны в контексте одиночной мутации, следует понимать, что мутантный полипептид может включать больше одной (например, две, три, четыре, пять или более) аминокислотной мутации.

В некоторых примерах полипептидный мутант включает мутацию не только в соединительный области Bcr-Abl. Bcr-Abl является конститутивно активной тирозинкиназой, которая появляется в результате ДНК транслокации между хромосомами 9 и 22 и, таким образом, слияния генов Bcr и Abl в филадельфийской хромосоме. Bcr-Abl, как сообщают, служит причиной патогенеза хронического миелолейкоза (ХМЛ), а ее конститутивная киназная активность важна в ее способности трансформировать гематопоэтические клетки in vivo. Иматиниб (Гливек, 2-фениламинопиримидин), ингибитор тирозинкиназы, является терапевтическим средством для лечения ХМЛ. Различные мутации ускользания в Bcr-Abl, которые приводят к возникновению белка, устойчивого к терапии лекарственными средствами (например, к терапии Гливеком), были идентифицированы in vivo и in vitro. Deininger et al., Blood, 105(7):2640-2653 (2005); Azam et al., Cell, 112:831-43 (2003). Указанные мутации расположены в различных областях Bcr-Abl, включая, помимо прочих, киназный домен (например, P-петлю, A-петлю, T315, C-спираль, SH3 контактные области или SH2 контактные области), кэп-домен, домен SH3, домен SH2, а также другие линкерные области. В одном варианте осуществления мутантный полипептид включает E255K, T315I и M351T. В других вариантах осуществления мутантный полипептид включает T315I. В других вариантах осуществления мутантный полипептид включает E255K. В других вариантах осуществления мутантный полипептид включает M351T. В других вариантах осуществления мутантный полипептид включает комбинацию двух из следующего: E255K, T315I и M351T (например, E255K/T315I или T315I/M351T, или E255K/M351T). В другом варианте осуществления ускользнувшим мутантом является V299L. В другом варианте осуществления ускользнувшим мутантом является T315A. В другом варианте осуществления ускользнувшим мутантом является F317V. В другом варианте осуществления ускользнувшим мутантом является F311I. Для получения дополнительной информации касательно направленного действия иматиниба (Гливек) на ускользнувшие мутанты, см. обзоры, например, Walz et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 57:145-164 (2006) и Burgess et al., The Scientific World Journal, 6:918-930 (2006).

Раковый антиген может содержать одну или несколько мутаций в различных аминокислотных позициях. Касательно Bcr-Abl и его ответа на терапию иматинибом (Гливек) в уровне техники были описаны различные мутации ускользания. В одном аспекте мутацией является мутация ускользания T315I. В другом аспекте мутацией является мутация E255K. В еще одном аспекте мутацией является мутация M351T. В других аспектах мутациями является комбинация всех трех мутаций: E255K, T315I и M351T. В других аспектах мутациями является комбинация двух из трех мутаций, описанных выше (например, E255K/T315I или T315I/M351T, или E255K/M351T). Раковый антиген может дополнительно содержать другие мутации, такие как мутации, связанные с актами трансформации.

В некоторых примерах полипептидный мутант может являться слитым полипептидом, который содержит множественные иммуногенные домены из одного или нескольких мутантных полипептидов раковых антигенов. Например, известно, что существует несколько различных мутаций в белке Bcr-Abl, которые проявляются как мутации ускользания непосредственно при введении Гливека (например, E255K, T315I, M351T, V299L, T315A, F317V или F311I). Мутантный полипептид может включать одну или несколько мутаций Bcr-Abl в одном и том же положении и/или в различных положениях, и/или комбинации мутаций более чем в одном положении.

Таким образом, в одном аспекте изобретение обеспечивает способ направленного устранения мутационного ускользания у человека, нуждающегося в этом, посредством введения человеку эффективного количества терапевтического средства направленного действия и композиции, включающей одно или несколько из следующего: i) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп; ii) дрожжевой носитель, включающий, по меньшей мере, один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп; iii) дрожжевой носитель совместно с, по меньшей мере, одним мутантным полипептидом, ассоциированным с раком, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом; iv) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, связанный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку; или v) дрожжевой носитель и, по меньшей мере, один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку, где мутантный полипептид, как известно, появляется или появился, по меньшей мере, с одной специфичной мутации в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия для лечения рака.

Направленное терапевтическое средство может являться любым типом рака, который используется для профилактики или лечения рака. Неограничивающие примеры средства включают: ингибитор тирозинкиназы, ингибитор Src киназы, двойные ингибиторы Src/Abl, средство, действующее в Ras/Raf/Mek пути, средство, действующее в пути PI3K; средство, действующее на белки-шапероны, которые участвуют в онкогенных путях передачи сгналов. Комбинация терапевтического средства и методики направленного устранения эффективны для устранения клеток, которые содержат мутацию ускользания. Многие из существующих терапевтических средств не устраняют клетки с мутациями ускользания, хотя они и могут устранять фенотип дикого типа. При этом средство само по себе или методика направленного устранения сама по себе не столь эффективны в применении, когда используются раздельно, как тогда, когда их применяют в комбинации друг с другом.

Неограничивающие примеры терапевтических средств направленного действия, которые действуют как ингибиторы тирозинкиназы, включают: иматиниб, нилотиниб, PD1866326, PD180970, AP23464, BMS-354825, ON012380, VX-680 и BIRB-796.

Неограничивающие примеры терапевтических средств направленного действия, которые действуют как ингибиторы Src киназы, включают PD166326, PD180970, AP23464, BMS-354825, AZM475271, PP1, PP2, AP-23236, CGP76030 и PD173955.

Неограничивающие примеры терапевтических средств направленного действия, которые влияют на стабильность белков, которые вовлечены в рак (например, Bcr-Abl), включают белки теплового шока или другие белки-шапероны, которые ассоциируются с белком, который вовлечен в рак. В некоторых аспектах, средством является гелданамицин/17-AAG или NVP-LAQ824.

Направленное терапевтическое средство может также действовать в сигнальном пути, идущем после Bcr-Abl. Примеры сигнальных путей, рассматриваемых в рамках настоящего изобретения, включают, помимо прочих, Ras, Raf, Mek, Erk, Src, PI3K, PDK, ASK, mTOR. Неограничивающие примеры средств, направленных на вышеуказанные пути передачи сигналов, включают: SCH66336, BAY-439006, CI-1040, LY294002, вортманин, OSU-03012, CCI-779, R115777, BMS-214662, U0126, PD184352, рапамицин, RAD001, CCI-779 и AP23573. Кроме того, средства, направленные на белок, ассоциированный с активацией указанных путей, также включены в объем изобретения. Например, ингибиторы фарнезилтрансферазы, такие как SCH66336, R115777 и BMS-214662, могут применяться в комбинации с методикой направленного устранения, описанной в настоящей заявке.

В дополнение к направленному действию на белки, такие как Bcr-Abl, другие противоопухолевые средства направлены на другие мишени, такие как FLT3, PDGFR, VEGR, PKC и c-Kit, как более подробно описано ниже. В некоторых вариантах осуществления D816V и V560G являются мутациями ускользания в c-Kit, который может являться мишенью в соответствии с методиками, описанными в настоящей заявке. Применение устранения, направленного на мутационное ускользание, может также применяться в комбинации со средствами, направленными на вышеуказанные мишени и любой другой раковый антиген и/или белки, ассоциированные с раком. Например, PKC412 и сунитиниб (SU11248) могут применяться для направленного воздействия на FLT3, PDGFR, VEGR, PKC и c-Kit. Устранение, направленное на мутационное ускользание, может также применяться в комбинации со средствами с целью лечения других раковых опухолей, например, иматиниб-резистентного гиперэозинофильного синдрома (HES) или стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST).

В некоторых примерах мутантный полипептид включает мутацию в EGFR. EGFR представляет собой рецептор тирозинкиназы, играющий ключевую роль в инициации деления как нормальных, так и раковых клеток. В раковых опухолях многих типов, включая немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и глиобластому (рак мозга), как сообщается, EGFR либо сверхэкспрессируется, либо мутирован, при этом данные изменения, как предполагают, связаны с формированием и ростом опухолей. Два пероральных анилинхиназолиновых ингибиторов тирозинкиназы EGFR, гефитиниб (Иресса) и эрлотиниб (Тарцева), были одобрены в США для лечения НМРЛ. Мутация ускользания T790M была обнаружена в EGFR и, как сообщают, вызывает у индивида-млекопитающего резистентность к терапии с применением Ирессы или Тарцевы. Фактически применение устранения, направленного на мутационное ускользание, может также применяться в комбинации с Иресса или, в альтернативе, с Тарцева, для лечения лиц, у которых выработались мутации ускользания к указанным средствам.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композиции, включающие мутантный полипептид EGFR (или его мимотоп) или нуклеиновую кислоту, кодирующую EGFR, а также способы их применения для индукции иммунного ответа. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунным ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. В некоторых примерах мутантный полипептид включает мутацию в киназном домене EGFR.

В некоторых примерах, мутантный полипептид включает мутацию в рецепторе тромбоцитарного фактора роста (PDGFR). PDGFR является рецептором тирозинкиназы. Активация PDGFR, как сообщают, является критической для развития различных типов раковых опухолей, таких как глиобластома, дерматофибросаркома и ХМЛ. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композиции, включающие мутантный полипептид PDGFR (или его мимотоп) или нуклеиновую кислоту, кодирующую PDGFR, а также способы их применения для индукции иммунного ответа. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. В некоторых примерах мутантный полипептид включает мутацию в киназном домене PDGFR.

В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид включает мутацию KIT. KIT является тирозинкиназным рецептором фактора стволовых клеток (SCF). Активация KIT в результате мутаций в киназном домене, как сообщают, связана со стромальной опухолью желудочнокишечного тракта (GIST) и другими типами опухолей. Частые мутации ускользания, такие как D816V или V560G, в c-kit были описаны у пациентов, получавших Гливек. См., например, Walz et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology, 57:145-164 (2006). Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композиции, включающие мутантный полипептид KIT (или его мимотоп) или нуклеиновую кислоту, кодирующую KIT, а также способы их применения для индукции иммунного ответа. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. В некоторых примерах мутантный полипептид включает мутацию в киназном домене KIT. В некоторых примерах мутантный полипептид включает мутацию T670I по сравнению с полипептидом KIT дикого типа.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композиции, включающие такие мутантные полипептиды (или их мимотопы), или нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантные полипептиды, а также способы их применения для индукции иммунного ответа. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. В некоторых примерах мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на средства, является иммуногенным сам по себе, то есть, без адъюванта, но это не обязательно. В других примерах мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился в ответ на средства, является иммуногенным совместно с адъювантом, таким как лиганд или агонист Toll-подобного рецептора, или CpG нуклеотидная последовательность, или другой вектор, или носитель, такой как дрожжевой носитель, который усиливает его антигенные свойства.

Таким образом, композиции, описанные в настоящей заявке, применяются для индукции иммунного ответа на мутантный полипептид у млекопитающего, включая введение млекопитающему эффективного количества композиции совместно с терапевтическим и/или профилактическим средством направленного действия. В некоторых примерах композиция включает одно или несколько из следующего:

i) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп;

ii) дрожжевой носитель, включающий по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп;

iii) дрожжевой носитель совместно с по меньшей мере одним мутантным полипептидом, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом;

iv) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку; или

v) дрожжевой носитель и по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку, где мутантный полипептид, как известно, появляется или появился по меньшей мере с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия.

Также композиции могут применяться при получении или изготовлении лекарственных средств для индукции иммунного ответа на мутантный полипептид у млекопитающего совместно с терапевтическим и/или профилактическим средством направленного действия. В некоторых примерах мутантный полипептид является онкогеном, опухолеспецифичным антигеном или полипептидом, экспрессируемым раковой клеткой. В некоторых примерах раковая клетка выбрана из группы, состоящей из колоректального рака, меланом, плоскоклеточной карциномы, раковых опухолей молочной железы, карцином головы и шеи, карцином щитовидной железы, сарком мягких тканей, сарком кости, раковых опухолей яичка, раковых опухолей простаты, раковых опухолей яичников, раковых опухолей мочевого пузыря, раковых опухолей кожи, раковых опухолей мозга, ангиосарком, гемангиосарком, тучноклеточных опухолей, первичных раковых опухолей печени, раковых опухолей легкого, раковых опухолей поджелудочной железы, раковых опухолей желудочнокишечного тракта, почечноклеточных карцином, неоплазий кроветворной системы, а также метастатических раковых опухолей.

В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ.

Кроме того, композиции, описанные в настоящей заявке, применяются для лечения заболевания у млекопитающего, включая введение млекопитающему эффективного количества композиции, где заболевание ассоциировано с мутантным полипептидом, который, как известно, появляется или появился, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия. В некоторых примерах композиции применяются совместно с терапевтическим и/или профилактическим средством направленного действия. Также композиции могут применяться при получении или изготовлении лекарственных средств для лечения заболевания у млекопитающего совместно с терапевтическим и/или профилактическим средством направленного действия. В некоторых примерах мутантный полипептид является онкогеном, опухолеспецифичным антигеном или полипептидом, экспрессируемым раковой клеткой. В некоторых примерах раковая клетка выбрана из группы, состоящей из колоректального рака, меланом, плоскоклеточной карциномы, раковых опухолей молочной железы, карцином головы и шеи, карцином щитовидной железы, сарком мягких тканей, сарком кости, раковых опухолей яичка, раковых опухолей простаты, раковых опухолей яичников, раковых опухолей мочевого пузыря, раковых опухолей кожи, раковых опухолей мозга, ангиосарком, гемангиосарком, тучноклеточных опухолей, первичных раковых опухолей печени, раковых опухолей легкого, раковых опухолей поджелудочной железы, раковых опухолей желудочнокишечного тракта, почечноклеточных карцином, неоплазий кроветворной системы, а также метастатических раковых опухолей. В некоторых примерах заболеванием является рак.

Способы идентификации новых мутантных полипептидов в раковом антигене, которые появляются в результате введения средств, известны из уровня техники. Мутации ускользания, идентифицированные in vitro способами, показали высокую степень корреляции с мутациями, которые развиваются in vivo. См., например, Azam et al, Cell, 112:831-843 (2003); Cools et al., Cancer Research, 64:6385-6389 (2004); Blencke et al., Chem. Biol, 11:691-701 (2004). Например, Azam et al. обеспечили способ скрининга для идентификации мутантных полипептидов, резистентных к мишень-специфичным противоопухолевым средствам, которые обычно применяют к любой паре средство-мутантный полипептид (Azam et al., Biol.Proced.Online, 5(1):204-210 (2003)). Вкратце, кДНК, кодирующую целевой мутантный полипептид, клонировали в клонирующий вектор и подвергали случайному мутагенезу с получением библиотеки мутаций в целевом раковом полипептиде. Затем библиотеку вводили в клетки, восприимчивые к терапии средством. Затем в присутствии терапевтического средства отбирали колонии, устойчивые к обработке средством, выделяли и секвенировали, определяя предполагаемые мутации. Чтобы подтвердить резистентный фенотип каждой кандидатной мутации, мутации могут быть также введены в нативную кДНК de novo с помощью сайт-направленного мутагенеза. Мутантные кДНК вводили в чувствительные к лекарственному средству клетки, чтобы подтвердить их резистентные фенотипы. Устойчивость к лекарственному средству может быть также подтверждена с помощью анализа на пролиферацию клеток. Мутации могут быть также проанализированы на предмет их влияния на структуру путем картирования в модели кристаллической структуры белка.

Композиции и фармацевтические составы, и их введение

Настоящее изобретение обеспечивает композиции, включающие векторы совместно с мутантным полипептидом, включая композиции, вводимые пациенту непосредственно или первоначально вводимые в носитель, такой как дендритная клетка, с использованием ряда способов, известных специалистам, квалифицированным в данной области. Например, векторы могут быть высушены путем лиофилизации или заморожены обработкой в жидком азоте или на сухом льду. Композиции, включающие дрожжевые носители, могут быть также приготовлены посредством формования дрожжей в брикет или таблетку, как это делают с дрожжами, используемыми в пекарных или пивоваренных процессах. Кроме того, перед введением в дендритную клетку или другим типом введения, векторы могут быть также смешаны с фармацевтически приемлемым наполнителем, таким как изотонический буфер, присутствие которого переносит клетка-хозяин. Примеры таких наполнителей включают воду, раствор хлорида натрия, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Ханка, а также другие водные физиологически сбалансированные соляные растворы. Неводные носители, такие как нелетучие масла, кунжутное масло, этилолеат или триглицериды, также могут использоваться. Другие подходящие составы включают суспензии, содержащие повышающие вязкость добавки, такие как натриевую соль полиэтиленгликоль (PEG) карбоксиметилцеллюлозы, сорбитол, глицерин или декстран. Наполнители могут также содержать незначительные количества добавок, таких как вещества, повышающие изотоничность и химическую стабильность. Примеры буферных растворов включают фосфатный буфер, гидрокарбонатный буфер и Трис-буфер, а примеры консервантов включают тимеросал, м- или o-крезол, формалин и бензиловый спирт. Стандартные композиции могут являться либо жидкими препаратами для инъекций, либо твердыми веществами, которые могут быть введены в подходящую жидкость в виде суспензии или раствора для инъекции. Таким образом, в нежидкостной композиции наполнитель может включать, например, декстрозу, сывороточный альбумин человека и/или консерванты, к которым перед введением могут быть добавлены стерильная вода или раствор хлорида натрия.

Настоящее изобретение обеспечивает способы, включающие введение композиции (такой как иммуногенная композиция), которая включает вектор совместно с мутантным антигеном, млекопитающему, находящемуся под угрозой рака или инфекции, либо подверженному раку или инфекции. Способы в целом могут применяться для индукции иммунного ответа, который в некоторых примерах является клеточным иммунным ответом, у млекопитающего. Такие способы, как полагают, могут применяться для индукции клеточного иммунного ответа к мутантному полипептиду, который появился в ответ на средство (средства) или, возможно, появится в ответ на средства, минимизируя, таким образом, или полностью устраняя устойчивость к средству и/или повышая эффективность средства, и/или минимизируя, снижая или полностью устраняя некоторые симптомы заболевания или инфекции.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы минимизации резистентности к профилактическому и/или терапевтическому средству у млекопитающего, включающие введение млекопитающему эффективного количества композиции, включающей вектор, такой как, например, дрожжевой носитель, совместно с мутантным полипептидом, который появился в ответ на средства. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы снижения резистентности к средству, вводимому млекопитающему, находящемуся под угрозой заболевания или инфекции, либо подверженному заболеванию или инфекции, независимо от того, вводят ли средство профилактически и/или терапевтически, включающие введение млекопитающему эффективного количества композиции совместно со средством, где указанная композиция включает:

a. клетку, вектор или вирус, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует мутантный полипептид;

b. клетку, вектор или вирус совместно с мутантным полипептидом;

c. мутантный полипептид, или пептид (мимотоп), который вызывает иммунный ответ против мутантного полипептида; или

d. нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид, или нуклеиновую кислоту, такую как миРНК или антисмысловая РНК, которая связывает нуклеиновую кислоту, где эффективное количество композиции вводят совместно со средством.

В некоторых примерах композиция включает одно или несколько из следующего:

i) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп;

ii) дрожжевой носитель, включающий по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп;

iii) дрожжевой носитель совместно с по меньшей мере одним мутантным полипептидом, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом;

iv) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку; или

v) дрожжевой носитель и по меньшей мере один мутантный полипептид, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку, где мутантный полипептид, как известно, появляется или появился по меньшей мере с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия.

В некоторых примерах композиция обеспечивает индукцию клеточного иммунного ответа. В других примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ.

В некоторых примерах способов композиция включает адъювант. В других примерах композиция дополнительно включает агонист или лиганд Toll-подобного рецептора или фагоцитарного рецептора, или и того, и другого. В других примерах композиция включает дрожжевой носитель. В других примерах композиция включает CpG последовательность. В других примерах клетка является дендритной клеткой. В некоторых примерах млекопитающим является человек.

Также настоящее изобретение обеспечивает векторы, включая например, дрожжевые носители, вирусы и композиции, такие как, например, композиции на основе дрожжей, включающие дрожжевые носители, включая иммуногенные композиции, предназначенные для применения в способах индукции специфичного против мутантного полипептида иммунного ответа у млекопитающего, которому вводили, будут вводить, или вводят средство (средства). В некоторых примерах млекопитающее подвержено риску заболевания, а вектор совместно с мутантным полипептидом, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом, и/или композиции, включающие такой вектор, вводят профилактически, до, одновременно и/или после введения средства. В других примерах млекопитающее подвержено риску заболевания, а вектор совместно с мутантным полипептидом, и/или композиции, включающие такие векторы, вводят терапевтически, до, одновременно и/или после введения средства. Введение таких дрожжевых носителей совместно с мутантным полипептидом может применяться, например, с целью повышения восприимчивости млекопитающего к терапевтическому и/или профилактическому средству; и/или для повышения терапевтической эффективности таких средств; и/или для увеличения эффективной продолжительности действия таких средств. В некоторых примерах мутантный полипептид идентифицируют до введения вектора или композиции, как описано в настоящей заявке, а в других примерах теоретически прогнозируют возникновение мутантного полипептида в ответ на средства.

Композиции, описанные в настоящей заявке, которые включают векторы, такие как дрожжевые носители, совместно с мутантным полипептидом, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом, и терапевтическое или профилактическое средство, можно вводить либо одновременно, либо последовательно, до или после введения средства (средств). Одновременное введение охватывает совместное введение в одной композиции или, в альтернативе, в раздельных композициях. В некоторых примерах средство и мутантный полипептид или нуклеиновая кислота, кодирующая его, находятся в различных композициях и вводятся одновременно и раздельно. Следует понимать, что в некоторых примерах, где средство и мутантный полипептид или нуклеиновую кислоту, кодирующую его, вводят последовательно, введение может выполняться ежедневно, еженедельно или ежемесячно, как сочтет нужным для млекопитающего практикующий специалист. Понятие "одновременное введение", используемое в настоящем описании, означает, что композицию, включающую дрожжевой носитель и терапевтическое средство, вводят в один и тот же день. Сначала может быть введена либо композиция, включающая мутантный полипептид, либо терапевтическое средство. При одновременном введении композиция, включающая дрожжевой носитель, и терапевтическое средство могут содержаться в одной и той же дозе (то есть, в стандартной дозе, включающей и композицию, включающую дрожжевой носитель, и терапевтическое средство), или в отдельных дозах (например, композиция, включающая дрожжевой носитель, содержится в одной дозированной форме, а терапевтическое средство содержится в другой дозированной форме).

В некоторых примерах композицию, включающую мутантный полипептид, вводят в качестве "последующей терапии", то есть, после начала терапии средством или после регистрации повышения интенсивности проявления симптомов заболевания. Впрочем, композицию, включающую вектор, такой как дрожжевой носитель, можно также вводить перед началом терапии терапевтическим или профилактическим средством.

Способы, описанные в настоящей заявке, могут также включать введение вектора и мутантного полипептида млекопитающему, где вектор и полипептид не объединены друг с другом, то есть, полипептид рекомбинантно не экспрессируется вектором, не введен в вектор или физически объединен с вектором. Вектор и мутантный полипептид могут быть смешаны в композиции до введения индивиду, или введены раздельно. Способ введения может быть осуществлен ex vivo, например, путем введения посредством дендритных клеток, в которые введен дрожжевой носитель, или in vivo. Введение ex vivo относится к осуществлению части регулирующей стадии вне млекопитающего, например, введению композиции настоящего изобретения в популяцию клеток (дендритных клеток), взятых у млекопитающего, в таких условиях, что вектор и мутантный полипептид поступают в клетку, с последующим возвратом клеток млекопитающему. Затем композиция, включающая вектор, может быть возвращена млекопитающему, или введена млекопитающему, любым подходящим способом введения.

Введение композиции, включающей композицию, включающую дендритную клетку, в которую введен вектор и мутантный полипептид, может выполняться, например, системно или на слизистую. Пути введения известны специалистам в данной области и зависят от типа состояния, используемого мутантного полипептида и/или целевой популяции клеток или ткани. Способы введения включают, помимо прочих, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, интранодальное введение, внутрикоронарное введение, внутриартериальное введение (например, в сонную артерию), подкожное введение, трансдермальную доставку, внутритрахеальное введение, подкожное введение, внутрисуставное введение, интравентрикулярное введение, ингаляцию (например, аэрозоль), внутричерепное, интраспинальное, внутриглазное, ушное, интраназальное, пероральное, легочное введение, введение через катетер и прямую инъекцию в ткань. Пути введения включают: внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, внутрикожный, интранодальный, внутримышечный, трансдермальный, ингаляционный, интраназальный, пероральный, внутриглазной, внутрисуставной, внутричерепной и интраспинальный. Парентеральная доставка может включать внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутриплевральный, внутрилегочный, внутривенный и подкожный пути, а также атриальный катетер и венозный катетер. Ушная доставка может включать ушные капли, интраназальная доставка может включать капли в нос или интраназальную инъекцию, и внутриглазная доставка может включать глазные капли. Аэрозольная (ингаляционная) доставка также может быть выполнена с использованием стандартных способов из уровня техники (см., например, Stribling et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189:11277-11281 (1992)). Например, в одном примере композиция, включающая дрожжевой носитель, может быть включена в состав композиции, подходящей для ингаляционной доставки с использованием подходящего ингаляционного устройства или распылителя. Пероральная доставка может включать твердые частицы и жидкости, которые могут приниматься через рот, и подходит для развития иммунитета слизистых, и, кроме того, композиции, включающие дрожжевые носители, могут быть легко приготовлены для пероральной доставки, например, в форме таблеток или капсул, а также введены в пищевые продукты и напитки. При лечении рака или инфекционного заболевания могут использоваться другие пути введения, которые модулируют иммунитет слизистых. Такие пути включают бронхиальный, внутрикожный, внутримышечный, интраназальный, другие ингаляционные, ректальный, подкожный, местный, трансдермальный, вагинальный и уретральный пути. Путь доставки представляет собой любой путь доставки композиции, включающей дрожжевой носитель, в дыхательную систему, включая, помимо прочего, ингаляционный, интраназальный, внутритрахеальный и т.п.

Эффективное введение клетки, вектора, такого как дрожжевой носитель, или вируса, или композиции, включающей клетку, где вектор, вирус или дрожжевой носитель описаны в настоящей заявке, млекопитающему, находящемуся под угрозой или подверженному заболеванию, не требует, чтобы млекопитающее было защищено от заболевания. Параметры эффективной дозы могут быть определены с использованием стандартных способов из уровня техники, которые подходят для минимизации или снижения интенсивности проявления симптомов заболевания, или минимизации развития заболевания. Такие способы включают, например, определение уровней выживаемости, побочных эффектов (то есть, токсичности) и развития или ремиссии заболевания.

Для применения с дрожжевым носителем подходящий размер разовой дозы соответствует дозе, которая обеспечивает индукцию иммунного ответа у млекопитающего, в некоторых примерах - клеточного иммунного ответа, который может являться антиген-специфичным иммунным ответом, при введении один или более раз в течение подходящего периода времени. Квалифицированный специалист сможет оценить, что доза композиции, требуемая для индукции иммунного ответа, зависит от множества факторов. Специалист в данной области может легко определить соответствующие размеры разовой дозы для введения, исходя из размера млекопитающего и пути введения.

Подходящая разовая доза композиции, включающей вектор совместно с мутантным полипептидом, соответствует дозе, которая обеспечивает эффективное поступление вектора и/или мутантного полипептида в данный тип клетки, ткани или области организма пациента в количестве, эффективно индуцирующем иммунный ответ, при введении один или более раз в течение подходящего периода времени. В случае дрожжей разовая доза дрожжевого носителя настоящего изобретения составляет приблизительно от 0,004 YU (4×10³ клеток) до приблизительно 100 YU (1×10⁹ клеток), например, от 0,1 YU (1×10⁶ клеток) до приблизительно 100 YU (1×10⁹ клеток) на дозу (то есть, на организм), включая любую промежуточную дозу с шагом 0,1×10⁶ клеток (то есть, 1,1×10⁶, 1,2×10⁶, 1,3×10⁶ и т.д.). В одном варианте осуществления используют 2 YU (2×10⁷ дрожжевых клеток). Указанный диапазон доз может эффективно использоваться в любом организме любого размера, включая мышей, обезьян, людей и т.д. Когда композицию вводят посредством введения дрожжевого носителя и мутантного антигена в дендритные клетки, разовая доза композиции, описанной здесь, составляет приблизительно от 0,5×10⁶ до приблизительно 40×10⁶ дендритных клеток на млекопитающее, на введение. В других примерах разовая доза составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ дендритных клеток на отдельный индивид, а в еще одних примерах от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ дендритных клеток на млекопитающее. "Повышенную" дозу композиции, включающей дрожжевой носитель, как описано в настоящей заявке, можно вводить, когда иммунный ответ против мутантного антигена уменьшился, или при необходимости в обеспечении иммунного ответа или активации ответа памяти против специфического мутантного полипептида. Повышенные дозы можно вводить приблизительно от 1 недели до нескольких лет после исходного введения. В одном примере схема введения является схемой, согласно которой приблизительно от 1×10⁵ до приблизительно 1×10⁹ эквивалентов дрожжевых клеток композиции вводят еженедельно в течение 3 месяцев, затем еженедельно в течение 1 месяца (5 доз) с последующим ежемесячным ведением.

В некоторых примерах композиция на основе дендритных клеток, включающая дрожжевой носитель, описанный в настоящей заявке, содержит приблизительно от 0,5×10⁶ до приблизительно 40×10⁶ дендритных клеток на разовую дозу, на пациента, а в другом примере - приблизительно от 1×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ дендритных клеток на разовую дозу, на пациента. Указанные дозы вводят обычному человеку или другому примату. Дозы, подходящие для других животных, могут быть определены специалистами, квалифицированными в данной области. Например, для мыши подходящая доза составляет приблизительно от 1×10⁶ до приблизительно 3×10⁶ на разовую дозу, на мышь. Другие дозы могут быть определены квалифицированным специалистом и находятся в компетенции специалистов в данной области. Композиция, эффективная при введении млекопитающему, содержит приблизительно от 0,5×10⁶ до приблизительно 40×10⁶ дендритных клеток на разовую дозу, на индивидуальное млекопитающее.

Квалифицированному специалисту будет очевидно, что количество доз, которое вводят млекопитающему, зависит от природы дрожжевого носителя и ответа млекопитающего на введение. Таким образом, в объем настоящего изобретения включено то, что подходящее число доз включают любое число, требуемое в соответствии с заданной целью. Например, повторное введение доз может увеличить число T-клеток, доступных при атаке целевых клеток. Дозировка и частота введения могут быть скорректированы в течение курса введения, о чем осведомлен квалифицированный специалист.

Специалист в данной области может также контролировать эффекты от введения доз при использовании животных моделей, таких как мышиные модели лейкоза. Такие мышиные модели хорошо известны специалисту в данной области. Один из способов контроля эффекта от введения доз заключается в контроле уровня выживаемости мышей (вакцинированных и невакцинированных) после контрольного заражения или стимуляции. Другой способ контроля эффекта от введения доз состоит в определении процента лейкозных клеток с течением времени. Существуют некоторые мышиные модели, в которых лейкозные клетки метят маркером, таким как зеленый флуоресцентный белок (GFP). GFP-положительные клетки соответствуют лейкозным клеткам и могут наблюдаться в различных отделах организма, например в костном мозге.

Наборы

Настоящее изобретение обеспечивает наборы для осуществления любого из способов, описанных в настоящей заявке. Наборы изобретения могут включать, по меньшей мере, один дрожжевой носитель и, по меньшей мере, один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического лекарственного средства (средств) направленного действия. Набор может дополнительно включать терапевтическое и/или профилактическое лекарственное средство. В некоторых примерах лекарственное средство направлено на раковые клетки. Примеры средств включают, помимо прочих, иматиниб, нилотиниб, PD166326, PD180970, AP23464, BMS-354825, ON012380, VX-680, BIRB-796, AZM475271, PP1, PP2, AP23236, CGP76030, PD173955, Гелданамицин/17-AAG, NVP-LAQ824, SCH66336, BAY-439006, CI-1040, LY294002, вортманнин, OSU-03012, CCI-779, R115777, BMS-214662, U0126, PD184352, рапамицин, RAD001, CCI-779, AP23573, PKC412 или SU11248. Набор может дополнительно включать инструкции по осуществлению способа, описанного в настоящей заявке.

В наборах, включающих один компонент, указанный компонент помещен в емкость (например, флакон, ампулу или другую подходящую емкость для хранения). Аналогичным образом в наборах, включающих более одного компонента, реагенты также находятся в емкостях (раздельно или в смеси).

Инструкции, касающиеся применения набора в целях осуществления изобретения, обычно описывают, как применять содержимое набора, чтобы осуществить способы изобретения. Инструкции, поставляемые в наборах изобретения, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковке (например, на листе бумаги, включенном в набор), но при этом также допускаются машиночитаемые инструкции (например, инструкции на магнитном или оптическом диске для хранения данных).

Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно посредством фигур и примеров в целях ясности понимания, специалистам, квалифицированным в данной области, будет очевидно, что могут быть осуществлены конкретные изменения и модификации. Таким образом, описания и примеры не следует рассматривать как ограничение объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 Конструирование дрожжевых носителей, включающих мутации ускользания

Цель данного примера состоит в описании конструкции дрожжей, которые содержат мутантов ускользания, как известно, возникающих при введении Гливек.

Создавали векторы на основе дрожжей, экспрессирующие приблизительно 400 аминокислот фрагмента Abl из p210 Bcr-Abl. Полученные векторы находились под контролем конститутивного промотора TEF2 (Фактор Элонгации Трансляции 2). Дрожжи, содержащие следующие конструкции, культивировали, собирали, промывали PBS, убивали нагреванием при температуре 56°C в течение 1 часа, снова промывали PBS, а затем ресуспендировали в PBS для введения мышам.

Для получения различных дрожжевых конструкций использовали следующие последовательности:

Конструкция #1 VK13 - BA5M - VAX E1.E2.E3

Данная конструкция содержит три мутанта ускользания: E255K, T315I и M351T. Данная последовательность была изменена в положениях V227I и N336S, что соответствует изменению человеческих аминокислотных остатков на остатки, которые соответствуют мышиным аминокислотным остаткам. Последовательность MADEAP в начале добавляли к последовательности Bcr-Abl для стабильности дрожжевой экспрессии. Выделенный жирным шрифтом, подчеркнутый текст указывает мутации, соответствующие мутантам ускользания (E255K, T315I и M351T). Последние 6 остатков соответствуют гексагистидиновому тагу. 328 аминокислот между последовательностью MADEAP и гексагистидиновым тагом происходят из киназного домена Abl человека. Последняя аминокислота является стоп-кодоном (*).

Конструкция #2 VK14-VAX E2 ONLY

Данная конструкция содержит только один мутант ускользания: T315I. Данная последовательность была изменена в положениях V227I и N336S, что соответствует изменению человеческих аминокислотных остатков на остатки, которые соответствуют мышиным аминокислотным остаткам. Последовательность MADEAP в начале добавляли к последовательности Bcr-Abl для стабильности дрожжевой экспрессии. Выделенный жирным шрифтом, подчеркнутый текст указывает мутации, соответствующие мутанту ускользания (T315I). Последние 6 остатков соответствуют гексагистидиновому тагу. Последовательность между последовательностью MADEAP и гексагистидиновым тагом происходит из киназного домена Abl человека. Последняя аминокислота является стоп-кодоном (*).

Конструкция #3 VK15-JCN-BAM-VAX b3a2

Данная конструкция представляет собой Bcr-Abl дикого типа с мышиными аминокислотными остатками в области соединения между Bcr и Abl. Данная последовательность была изменена в положениях V227I и N336S и по двум аминокислотным остаткам перед областью соединения Bcr-Abl человека, которые были заменены соответствующими аминокислотами мыши, что соответствует изменению человеческих аминокислотных остатков на остатки, которые соответствуют мышиным аминокислотным остаткам (указанные изменения выделены выше жирным шрифтом и двойным подчеркиванием). Последовательность MADEAP в начале добавляли к последовательности Bcr-Abl для стабильности дрожжевой экспрессии. Последние 6 остатков соответствуют гексагистидиновому тагу. Последовательность между последовательностью MADEAP и гексагистидиновым тагом происходит из последовательности киназы Bcr-Abl человека, содержащей 97 остатков перед областью соединения Bcr-Abl. Последняя аминокислота является стоп-кодоном (*).

Конструкция #4 Полностью человеческая E2 ONLY

Данная конструкция содержит аминокислотные остатки полностью человеческого Bcr-Abl с одной мутацией ускользания, T315I. Последовательность MADEAP в начале добавляли к последовательности Bcr-Abl для стабильности дрожжевой экспрессии. Выделенный жирным шрифтом, подчеркнутый текст указывает мутации, соответствующие мутанту ускользания (T315I). Последние 6 остатков соответствуют гексагистидиновому тагу. Последовательность между последовательностью MADEAP и гексагистидиновым тагом происходит из киназного домена Abl человека. Последняя аминокислота является стоп-кодоном (*).

Конструкция #5 Полностью человеческая Bcr-Abl WT seq содержащая область соединения

Данная конструкция представляет собой последовательность Bcr-Abl человека дикого типа, содержащую область соединения Bcr-Abl. Последовательность MADEAP в начале добавляли к последовательности Bcr-Abl для стабильности дрожжевой экспрессии. Последние 6 остатков соответствуют гексагистидиновому тагу. Последовательность между последовательностью MADEAP и гексагистидиновым тагом происходит из последовательности киназы Bcr-Abl человека, содержащей 97 остатков перед областью соединения Bcr-Abl. Последняя аминокислота является стоп-кодоном (*).

Конструкция #6 Полностью человеческая E1.E2.E3

Данная конструкция содержит три мутанта ускользания: E255K, T315I и M351T. Последовательность MADEAP в начале добавляли к последовательности Bcr-Abl для стабильности дрожжевой экспрессии. Выделенный жирным шрифтом, подчеркнутый текст указывает мутации, соответствующие мутантам ускользания (E255K, T315I и M351T). Последние 6 остатков соответствуют гексагистидиновому тагу. 328 аминокислот между последовательностью MADEAP и гексагистидиновым тагом происходят из киназного домена Abl человека. Последняя аминокислота является стоп-кодоном (*).

Пример 2 Мышиные модели лейкоза

Использовали мышиные модели лейкоза, в которых мышам делали инъекцию ретровируса, содержащего различные формы Bcr-Abl. Данные лейкозные клетки сконструировали для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), служащего в качестве контрольного маркера.

Мышей иммунизировали 3 раза с интервалами в две недели 2 YU дрожжей (20 миллионов клеток дрожжей). Заражение выполняли 500000 лейкозных клеток на 7 день после последней вакцинации. Исследования на мышах делили на две части:

В эксперименте #1 использовали 2 группы мышей:

(1) Первую группу не иммунизировали, а заражали GFP-меченным ХМЛ дикого типа (Bcr-Abl, но без мутаций ускользания) (5 животных). (2) Вторую группу мышей иммунизировали вакциной на основе дрожжей, содержащей белок Abl, несущий три мутации ускользания, обнаруженные при лечении Гливеком (Bcr-Abl с 3 эпитопами TAME - E255K, T315I, M351T, также известные как GI-10,001), а затем заражали GFP-меченным ХМЛ дикого типа (Bcr-Abl, но без TAME мутаций) (5 животных).

Получили следующие результаты:

На Фиг.1 показаны кривые Каплана-Мейера, которые были идентичны для указанных групп - все мыши умерли в течение одного 24-часового периода в 10 день. В селезенке вакцинированных мышей регистрировали повышенное количество T- и B-клеток, что также подтверждает введение вакцины на основе дрожжей и указывает общую врожденную иммунную активацию в отношении введенной вакцины.

Во 2-ой части исследований на мышах использовали 3 группы мышей:

(1) Первую группу не иммунизировали, а заражали GFP-меченным ХМЛ T315I (Bcr-Abl с 1 мутацией TAME - T315I) (5 животных).

(2) Вторую группу мышей иммунизировали вакциной на основе дрожжей, содержащей белок Abl, несущий три мутации ускользания (Bcr-Abl с 3 эпитопами TAME - E255K, T315I, M351T), а затем заражали GFP-меченным T315I ХМЛ (Bcr-Abl с 1 мутацией TAME - T315I) (3 животных).

(3) Третью группу мышей иммунизировали вакциной на основе дрожжей, содержащей белок Abl с одной мутацией ускользания (Bcr-Abl с 1 эпитопом TAME - T315I), а затем заражали GFP-меченным T315I ХМЛ (Bcr-Abl с 1 мутацией TAME - T315I) (4 животных).

Получили следующие результаты:

На Фиг.2 изображены кривые Каплана-Мейера, которые показывают очевидное преимущество в выживаемости у вакцинированных мышей. В контрольных группах (группа #1) все мыши погибли в течение 24-часового периода в дни 10-11 (мертвы 5/5). Напротив, в группе вакцинированных мышей все выжили после 11 дня. В группе вакцинированных мышей в общей сложности из 7 мышей на 13 день не было погибших особей, а две мыши выжили, по меньшей мере, после 35 дня.

На Фиг.3 изображены кривые Каплана-Мейера для одной и той же группы мышей с вакцинированными мышами, дополнительно разграниченными на особи, которые получали вакцину с тремя мутациями ускользания (GI-10,001), и особи, которые получали вакцину с мутацией T315I.

Из Фиг.1-2 совершенно четко видно, что методика направленного устранения направлена на клетки с мутацией (мутациями) ускользания и не на Bcr-Abl дикого типа. Фактически это обеспечивает весьма ценный инструмент для иммунного узнавания лейкозных клеток, которые ускользнули от воздействия существующих противоопухолевых терапевтических средств. Фиг.2 и 3 показывают, что любой тип вакцины эффективно направляет разрушение клеток, которые экспрессируют мутацию ускользания. Применение любой вакцины может использоваться для увеличения продолжительности выживания мышей, зараженных лейкозными клетками. Применение мультимутационной кассеты или кассеты с одиночной мутацией может использоваться для направления экспрессии клетками мутации (мутаций) ускользания.

При определении процента лейкозных клеток во второй части эксперимента, у вакцинированных мышей регистрировали статистически существенное уменьшение процента лейкозных клеток в крови в 10 день по сравнению с невакцинированными мышами. Полученные результаты приведены на Фиг.4. Две незакрашенных точки вблизи 0-ой отметки указывают мышей с очень низким или даже недетектируемым уровнем лейкозных клеток.

На Фиг.5 показаны уровни лейкозных клеток в группах, получавших различные вакцины. Как GI-10,001 (тройная мутация), так и GI-10,002 (мутация T315I) эффективно направляли иммунные клетки, экспрессирующие мутацию ускользания.

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для направленного устранения мутационного ускользания от воздействия противоопухолевых терапевтических средств; набора для вызывания иммунного ответа, где набор содержит указанную композицию. Композиции, включающие носители на основе дрожжей, применяются в комбинации с другими противоопухолевыми терапевтическими средствами. Группа изобретений обеспечивает минимизацию или полное устранение устойчивости к средству и/или повышение эффективности средства, и/или минимизацию, снижение или полное устранение некоторых симптомов заболевания. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 пр., 5 ил.

1. Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент и один или более следующих компонентов:
i) дрожжевой носитель, трансформированный молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный полипептид, содержащий последовательность области соединения Bcr-Abl;
ii) дрожжевой носитель и мутантный полипептид, содержащий последовательность области соединения Bcr-Abl;
iii) дрожжевой носитель, трансформированный молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный полипептид, содержащий Bcr-Abl или его иммуногенный домен, содержащие одну или несколько следующих мутаций ускользания: T3151, E255K и M351T; и
iv) дрожжевой носитель и мутантный полипептид, содержащий Bcr-Abl или его иммуногенный домен, содержащие одну или несколько следующих мутаций ускользания: T3151, E255K и M351T;
для применения в способе лечения рака в комбинации с направленным противораковым терапевтическим средством, где направленное противораковое терапевтическое средство выбрано из: ингибитора тирозинкиназы, ингибитора Src киназы, средства, влияющего на стабильность Bcr-Abl, и средства, которое действует в сигнальном пути, следующим после Bcr-Abl.

2. Композиция по п.1, где композиция и направленное терапевтическое средство не вводятся одновременно.

3. Композиция по п.1, где ингибитор тирозинкиназы выбирают из иматиниба, нилотиниба, PD1866326, PD180970, АР23464, BMS-354825, ON012380, VX-680 и BIRB-796.

4. Композиция по п.1, где ингибитор Src киназы выбирают из PD166326, PD180970, АР23464, BMS-354825, AZM475271, РР1, РР2, АР-23236, CGP76030 и PD173955.

5. Композиция по п.1, где средство, влияющее на стабильность Bcr-Abr, выбирают из гелданамицина/17-AAG и NVP-LAQ824.

6. Композиция по п.1, где средство, которое действует в сигнальном пути, следующем после Bcr-Abl, выбирают из SCH66336, BAY-439006, CI-1040, LY294002, вортманинна, OSU-03012, CCI-779, R115777, BMS-214662, U0126, PD184352, рапамицина, RAD001, CCI-779 и AP23573.

7. Композиция по п.1, где последовательность области соединения Bcr-Abl имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

8. Композиция по п.1, где последовательность области соединения Bcr-Abl имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

9. Композиция по п.1, где мутантный полипептид, содержащий Bcr-Abl или его иммуногенный домен, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

10. Композиция по п.1, где дрожжевым носителем является цельная дрожжевая клетка, дрожжевой сферопласт, дрожжевой цитопласт, дрожжевая клеточная тень или субклеточный экстракт дрожжевой мембраны или его фракция.

11. Композиция по п.1, где дрожжевым носителем является цельная дрожжевая клетка.

12. Композиция по п.1, где дрожжевой носитель получен из дрожжей, выбранных из группы, состоящей из Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hansenula, Candida и Pichia.

13. Композиция по п.1, где дрожжевой носитель выбран из Saccharomyces cerevisiae.

14. Композиция по любому из пп.1-13, используемая для облегчения симптомов рака у млекопитающих.

15. Композиция по любому из пп.1-13, применяемая для снижения устойчивости к противораковому лекарственному средству.

16. Применение композиции по любому из пп.1-13, для получения лекарственного средства для применения для вызывания иммунного ответа на мутантный полипептид, содержащий последовательность области соединения Bcr-Abl.

17. Применение композиции по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для применения при лечении рака.

18. Набор для вызывания иммунного ответа на мутантный полипептид, содержащий последовательность области соединения Bcr-Abl, связанный с раком, где набор содержит композицию по любому из пп.1-13.

19. Набор по п.18, дополнительно содержащий противораковое терапевтическое средство.

20. Набор по п.18, дополнительно содержащий инструкцию по применению набора.