СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ЭПОТИЛОНА B И РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ ЭПОТИЛОНА В Российский патент 2009 года по МПК C12P17/02 C07D493/00 C12N1/20 

Текст описания представлен в факсимильном виде.

Изобретение относится к усовершенствованным способам получения, выделения и очистки эпотилона В. Эти способы включают процесс ферментации штамма микроорганизма Sorangium cellulosum и, в частности, штамма АТСС №РТА 3880 или АТСС №РТА 3881, сбор смолы с адсорбированным эпотилоном В, экстракцию растворителем для выделения эпотилона В и кристаллизацию целевого продукта. Способ предусматривает получение производных эпотилона В. Изобретение относится также к штаммам, продуцирующим эпотилон В, и способу их культивирования для продукции эпотилона В. Раскрыты способы очистки эпотилона В методом жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной или нормальной фазой. Заявленное изобретение позволяет увеличить отношение эпотилона В к эпотилону А за счет введения добавки при осуществлении ферментации, выбранной из пропионата, пропионовой кислоты или другого предшественника пропионата, а разработанные способы очистки обеспечивают получение практически чистого эпотилона В. 6 н. и 39 з.п. ф-лы, 16 ил., 8 табл.

1. Способ выделения эпотилона В из микроорганизма, продуцирующего эпотилоны, включающий:
(а) ферментацию штамма микроорганизма, продуцирующего эпотилоны, в присутствии смолы, которая адсорбирует эпотилон В при гидрофобном взаимодействии;
(б) сбор смолы в среде на основе воды;
(в) экстракцию смолы растворителем для экстракции эпотилона В и для отделения его от среды на основе воды и
(г) кристаллизацию эпотилона В из экстракционной фазы до стадии хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кристаллический эпотилон В со стадии (г) является практически чистым.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что смолу экстрагируют полярным растворителем.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия ферментации дополнительно включает подачу добавки, способной повышать количество образовавшегося эпотилона В по сравнению с количеством образовавшегося эпотилона А.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что добавка представляет собой TASTONE™, Maltrin или глицерин.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия ферментации включает непрерывную подачу добавки, способной увеличивать отношение эпотилона В к эпотилону А.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что добавка представляет собой соль пропионовой кислоты.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что добавка представляет собой пропионат натрия, метиловый эфир пропионовой кислоты или этиловый эфир пропионовой кислоты.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что кристаллизацию проводят до уменьшения количества эпотилона А до 55% или менее от количества эпотилона А, содержащегося после стадии экстракции (в).

10. Способ по п.9, дополнительно включающий:
(е) по меньшей мере, еще одну стадию кристаллизации, приводящую к уменьшению количества эпотилона А до 55% или менее от количества эпотилона А, содержащегося после стадии экстракции (г),

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизмом, продуцирующим эпотилоны, является Sorangium cellulosum.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой штамм АТСС №РТА 3880 Sorangium cellulosum.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой штамм АТСС №РТА 3881 Sorangium cellulosum.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что смола является полимером на основе стирола/дивинилбензола.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что смола представляет собой XAD-16.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия (г) включает:
(i) добавление второго растворителя, в котором эпотилон В нерастворим или слегка растворим;
(ii) удаление, по меньшей мере, части растворителя для экстракции и
(iii) перевод растворителя или смеси растворителей в такие температурные условия, при которых эпотилон В кристаллизуется.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворитель для экстракции является этилацетатом или МТВЕ, а второй растворитель является толуолом.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает:
(д) перед осуществлением стадии (в) промывку смолы водным ацетонитрилом, или водным метанолом, или водной средой, содержащей детергент и амин, добавляемый в форме основания, причем водная среда выбирается такой, чтобы не вымывать эпотилон В.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия (в) дополнительно включает фильтрование растворителя, содержащего эпотилон В.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает превращение эпотилона В или его сольвата в производное 2 или его сольват формулы

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает превращение эпотилона В или его сольвата в производное 1 или его сольват формулы

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает превращение эпотилона В или его сольвата в производное 3 или его сольват формулы

23. Способ культивирования микроорганизма, который продуцирует эпотилон А и эпотилон В, включающий подпитку культуры культивируемого микроорганизма при условиях, которые выбираются для промотирования продуцирования эпотилонов в присутствии пропионовой кислоты, ее предшественника или их солей, причем продолжительность подпитки и количество пропионовой кислоты, ее предшественника или их солей выбирают таким образом, чтобы обеспечить, по меньшей мере, двухкратное увеличение отношения эпотилона В к эпотилону А по сравнению с отношением эпотилона В к эпотилону А, продуцируемых культурой микроорганизма в отсутствие подпитки пропионовой кислоты, ее предшественника или их солей и выделение эпотилона В из культуры.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что продолжительность контактирования и количество пропионовой кислоты, ее предшественника или их солей выбирают таким образом, чтобы обеспечить, по меньшей мере, трехкратное увеличение отношения эпотилона В к эпотилону А.

25. Способ по п.23, отличающийся тем, что продолжительность контактирования и количество пропионовой кислоты, ее предшественника или их солей выбирают таким образом, чтобы обеспечить увеличение отношения эпотилона В к эпотилону А до, по меньшей мере, 1,5.

26. Способ по п.23, отличающийся тем, что микроорганизм представляет собой Sorangium cellulosum.

27. Способ по п.23, отличающийся тем, что пропионовую кислоту, ее предшественник или их соли добавляют во время или после фазы роста культуры.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что он дополнительно включает подпитку культуры витамином, минералом, источником углеводородов или источником аминокислоты в количестве, которое приводит к увеличению количества полученного эпотилона В по сравнению с количеством эпотилона В, полученного без потпитки.

29. Способ по п.27, отличающийся тем, что он дополнительно включает подпитку культуры смесью одноосновного и двухосновного фосфатов.

30. Способ по п.23, отличающийся тем, что он дополнительно включает превращение эпотилона В или его сольвата в производное 1, или его соль, или его сольват формулы

31. Способ по п.23, отличающийся тем, что он дополнительно включает превращение эпотилона В или его сольвата в производное 2 или его сольват формулы

32. Способ по п.23, отличающийся тем, что он дополнительно включает превращение эпотилона В или его сольвата в производное 2 или его сольват формулы

33. Штамм Sorangium cellulosum, продуцент эпотилона В, депонированный как АТСС №РТА 3880.

34. Штамм Sorangium cellulosum, продуцент эпотилона В, депонированный как АТСС №РТА 3881.

35. Способ очистки эпотилона В, выделенного способом по п.1, при помощи жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной фазой, включающий:
(а) уравновешивание колонки ЖХВР с обращенной фазой, содержащей смолы для выделения, водным органическим растворителем или водной смесью органических растворителей;
(б) приготовление образца, растворенного подходящим органическим растворителем или смесью органических растворителей;
(в) введение в колонку образца и следов подходящего органического растворителя или смеси органических растворителей, которые эффективны для уменьшения осаждения эпотилона в загружаемом объеме; и
(г) элюирование через колонку водного органического растворителя или смеси органических растворителей, начиная с низкого содержания органической составляющей и затем увеличивая это количество, пока оно не превысит содержание органического растворителя в смеси, использованной на стадии уравновешивания, с получением эпотилона.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что жидкостную хроматографию высокого разрешения осуществляют с использованием устройства, в котором между отверстием для ввода и разделительной колонкой содержится промежуточный объем.

37. Способ по п.35, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии (б) является диметилсульфоксидом.

38. Способ по п.35, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии (в) является диметилсульфоксидом.

39. Способ по п.35, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии (г) является водным ацетонитрилом или водным метанолом.

40. Способ по п.35, отличающийся тем, что стадия введения включает использование промежуточного объема диметилсульфоксида, эффективное для уменьшения осаждения эпотилона в загружаемом объеме.

41. Способ по п.35, отличающийся тем, что он дополнительно включает
(д) кристаллизацию эпотилона для получения очищенного эпотилона В.

42. Способ очистки эпотилона, выделенного способом по п.1, методом нормально-фазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР), включающий:
(а) уравновешивание колонки ЖХВР с нормальной фазой, включающей разделительный гель или смолу с органическим растворителем или смесью органических растворителей;
(б) получение образца, растворенного в органическом растворителе или смеси органических растворителей;
(в) введение образца в колонку и
(г) элюирование из колонки органическим растворителем или смесью органических растворителей, которые начинают при меньшем содержании полярного растворителя и увеличивают содержание более полярного растворителя по сравнению с используемым его количеством на стадии уравновешивания для получения эпотилона.

43. Способ по п.42, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии (б) является дихлорметаном.

44. Способ по п.42, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии (г) является этил ацетатом или н-гептаном.

45. Способ по п.42, отличающийся тем, что он дополнительно включает
(д) кристаллизацию эпотилона для получения очищенного эпотилона В.