Изобретение относится к новому соединению ВМУ -46164, полученному с помощью ферментации штамма Actinomadura, составам и способам его использования, и способам его выделения. Следует отметить, что использование авторами всех фармацевтически приемлемых производных этого соединения.
Основываясь на данных масс-спектометрии высокого разрешения, использующей бомбардировку быстрыми атомами, полагают, что новый продукт ферментации имеет молекулярную формулу C40H43N2O12Cl и мол. м. 778. Это бесцветное, аморфное твердое вещество, имеющее свойства, приведенные ниже.
Этот продукт ферментации небелковый, нековалентно связанный хромофор, который ассоциирован, как полагают, через образование комплекса с белком, полученным из штаммов Actinomadura.
Было обнаружено, что продукт ферментации проявляет антимикробную активность по отношению к ряду грамположительных организмов, т.е. Enterococcus faecalis, staphylococcus aureus, Bacillus subtilis. Кроме того, он проявляет активность при обработке противоопухолевых моделей, таких, как Р 388 лейкемия.
Новый антибиотик можно получить с помощью ферментации ВМУ 46164 продуцирующего штамма или его мутанта в водной питательной среде в аэробных условиях нижнего брожения до тех пор, пока с помощью указанного микроорганизма в указанной питательной среде не образуется существенное количество ВМУ - 46164. Вслед за ферментацией следует регенерация ВМУ 46164 из питательной среды, в значительной степени освобожденного от побочных продуктов.
Хранилище микроорганизмов.
Биологически чистую культуру штамма Actinomadura Q 473-8, из которого получают соединение в соответствии с изобретением, хранили вместе с Американской Коллекцией Образцов Культур /АТСС/ в г.Роквилл шт.Мэриленд и ввели в ее постоянное собрание под Кодом новых поступлений АТСС 53806.
Культуры этого штамма хранят также в качестве лиофильных соединений в Коллекции культур актиномицетов в Исследовательском институте фармацевтики, принадлежащем компании "Бристол-Мейерз Сквибб", расположенном в г. Валлингфорд, шт. Коннектикут.
Указанные культуры были сданы на хранение в Американскую Коллекцию Образцов Культур до подачи настоящей заявки с соблюдением всех требований положений 35 V.S.C. 112 в отношении таких процедур.
На фиг.1 показан УФ-спектр ВМУ 46164 в метаноле; на фиг.2 ИК-спектр ВМУ 46164 /в таблетке КВr/; на фиг.3 протонный ЯРМ-спектр ВМУ 46164 в d6 ДМСО /диметилсульфоксид/; на фиг.4 C13 ЯРМ-спектр ВМУ - 46164 в d6 ДМСО.
Описание изобретения.
Продукт ферментации, известный, как соединение ВМУ 46164 имеет эмпиридическую формулу C40H43N2O12Cl и мол.м. 778.
Один предпочтительный способ получения ВМУ 46164 включает стадии:
(1) ферментации подходящего штамма актиномицета,
(2) экстракции белкового продукта ферментации,
(3) денатурации продукта стадии (2) и
(4) выделение соединения, имеющего эмпирическую формулу C40H43N2O12Cl и мол. м. 778.
Бесцветное, аморфное твердое вещество, его химическая структура пока еще не установлена. Однако его свойства следующие.
Масс-спектр: Масс-спектрометр модели /"Кратос MS 50ТС"/. Масс-спектрометрия, использующая бомбардировку быстрыми атомами 778, 2527. Кроме того, большие ионные фрагменты при 294.1339 и 149.0603.
УФ-спектр: спектометр с диодной решеткой модели "Хьюлетт Пакард 8452А", концентрация 1,0 мг/100 мл метанола. Нейтральный раствор дал следующий максимум поглощения λ
ИК-спектр: ИК-спектрометр с Фурье-преобразователеи модели "Перкин-Елмер 1800", таблетка КВr, см-1: 3424, 3076, 2934, 2838, 2170, 1640, 1578, 1520, 1490, 1462, 1424, 1376, 1292, 1248, 1184, 1156, 1112, 1072, 1046, 952, 900, 880, 832, 810, 754, 682, 666, 648, 576, 524.
500 МГц 1Н-ЯМР: Спектрометр модели "Брукер АМ-500". Двойной углерод-протонный зонд, 5 мм. Растворитель d6 ДМСО. Наблюдаемые химические сдвиги /м. д./: 9,18 (br.5, IH), 8.09 (dd, IH), 7, IH), 7,25 (d, IH), 6,97 (d, IH), 6,81 (d, IH), 6,58 (d, IH), 6,37 (t, IH), 5,41 (S, IH), 5,37 (dd, IH), 5,27 (m, IH), 5,13 (br. S, IH), 4,91 (S, IH), 4,89 (m, IH), 4,65 (d, IH), 4,22 (br. d, IH), 4,13 (ddd, IH), 3,94 (m, IH), 3,80 (dd, IH), 3,54 (S, 3H), 3,46 (dd, IH), 3,21 (d, IH), 3,12 (S, 3H), 2,94 (ddd, IH), 2,73 (m, IH), 2,71 (dd, IH), 2,58 (dd, IH), 2,31 (dd, IH), 2,19 (S, IH), 2,10 (S, 3H), 1,26 (S, 3H).
125 МГц 13С-ЯМР: спектрометр модели "Брукер АМ-500". Спектр несвязанного протона. Двойной углерод-протонный зонд, 5 мм. Растворитель d6 ДМСО. Наблюдаемые химические сдвиги (м.д.):
168,4, 168,1, 153,3, 152,8, 139,3, 138,5, 133,0, 131,4, 131,3, 131,0, 130,8, 126,8, 124,7, 124,3, 122,5, 122,1, 121,0, 109,2, 97,5, 95,7, 94,3, 94,2, 93,3, 90,1, 74,0, 73,2, 70,9, 69,8, 69,6, 66,3, 62,5, 55,4, 54,4, 52,3, 43,2, 37,5, 33,6, 22,7, 19,5, 16,1.
Во всех описанных здесь методах использовали следующие параметры.
Растворители не подвергали повторной дистилляции перед использованием. Метанол, этилацетат, хлороформ, гексаны, диэтиловый эфир, хлористый метилен и ацетонитрил имели качество реагентов согласно стандартам Американского Химического Общества. Вода для жидкостной хромотографии высокого разрешения /ЖХВР/ относятся к деионизованной воде, полученной в лабораторных условиях с помощью системы "Барнстед Нанопьюр П". Метанол и ацетонитрил для использования в жидкостной хромотографии высокого разрешения имели "Би энд Джи Брэнд" ЖХВР качество растворителей. Ацетат аммония имел "Фишер" ЖХВР качество. ДЕАЕx целлюлоза представляла собой Анионно-обменную целлюлозу фирмы "Шлейхер и Шуэлл" (партии 2932 и 2893). Трис буфер [трис (гидроксиметил) аминометан] был энзимного ультрачистого качества (Исследовательские лаборатории Бетесда), 0,05 М, рН 7,4. Дикалит имел качество "спид плюс" вспомогательный фильтрующий материал ("Грефко Минералс").
Тонкослойную нормально-фазовую хроматографию (ТНФХ) осуществляли на силикагеле 60, пластинках F254 ("ЕМ Реагенс") носитель 33 5765, 5Х10 см, толщина 0,25 мм). Тонкослойная обращенно-фазовая хроматография (ТОФХ) проводилась с использованием Ватман МКС18 пластин (носитель4803-110, толщина 0,2 мм). Пластины проявляли в цилиндрических сосудах Ватмана с колпачками и с 10 мл растворителя для элюирования. Хромофоры наблюдались как УФ-гасящие зоны при использовании ультрафиолетового света с длиной волны 254 нм.
Препаративная тонкослойная хроматография (ПТХ) осуществлялась на силикагеле 60, пластинках F254 ("ЕМ Реагентс", носитель 5766, 20x20 см, толщина 2 мм). Пластины проявляли в стеклянных резервуарах с крышками и с 100 мл растворителя для элюирования.
Устройство для вакуумной жидкостной хроматографии (ВЖХ) состояло из воронки Бюхнера ("Контес", Арт, K-9541100), содержащей вваренный пористый стеклянный диск (М пористость), боковое соединение под шланг для вакуума и расположенное ниже 24/40 соединение для прикрепления принимающих колб. Воронки уравновешивали за счет вытягивания исходного растворителя для элюирования под вакуумом для образования плотно упакованного слоя адсорбента высотой 5 см. Образцы предварительно адсорбировали на адсорбенте и наносили на воронки в качестве сорбента в исходном растворителе для элюирования. Ступенчатые градиенты осуществляли, используя предварительно рассчитанные объем растворителей для элюирования с возрастающей полярностью. Воронка осушалась насухо после каждого объема. Фракции концентрировали на роторном испарителе и объединяли на основе биоаналитических результатов, полученных в искусственных условиях вне организма и с учетом результатов анализа, проведенного методами жидкостной хроматографии высокого разрешения с УФ-детектированием и тонкослойной хроматографии. Дикалитовая хроматография относится к адсорбционной хроматографии на диатомовой земле. Образцы растворяли в хлороформе-метаноле (2:1) и адсорбировали на дикалите. Полученные порошки разжижали в гексанах и наносили на ВЖХ воронки. Предварительно рассчитанные объемы растворителей протягивали через дикалит в круглодонные колбы, затем их концентрировали с помощью роторного испарителя. Устройство для экслюзионно-размерной хромотографии состояло из следующих частей: колонки Гленко (2.5.1.Д.х100 см), снабженной устойчивыми к действию растворителей тефлоновыми концевыми пластинками, лабораторного насоса FMI фирмы "Флюид Митеринг" (Модель RP-C150), стеклянного резервуара Гленко (500 мл), коллектора фракций "Иско Модел 328". Колонки заполняли мелкозернистым сорбентом 150 г Сефадекс Н-20 ("Фармация") предварительно набухшим в элюирующем растворителе. Растворитель подавался снизу через колонку со скоростью, контролируемой лабораторным насосом. ЖХВР очистку осуществляли на ячейке "Бекман Систем Голд", состоящей из следующих компонентов: модуля доставки растворителя Модели 126, программируемого детектора Модели 166Р, комплекта емкостей для растворителя, инжектора "Алтекс", Динамакс 600А полу-препаративной колонки, нормально-фазового силикагеля (25 см•10 мм, 8 микрон, Si-83-111(C) (или) 25 см•21,4 мм, 8 микрон, Si-83-121-C (и обращенно-фазового силикагеля (25 см•10 мм, 8 микрон, C18-83-211-C).
Антибиотический противоопухолевый препарат по изобретению может быть получен с помощью ферментации ВМУ 46164 продуцирующего штамма актиномицета. Предпочтительный продуцирующий организм-актиномицет, выделенный из образца почвы, взятой в Афинах в Греции и обозначенный штамм Q 473-8. Биологически чистая культура штамма Q 473-8 хранилась вместе с Американской Коллекцией образцов культур, как описано выше.
Таксономические исследования на штамме Q 473-8 подробно описаны в Заявке на патент США S.N.464.046. Хемотаксономические данные вместе с морфологическими особенностями штамма Q 473-8 показывают, что организм является членом класса Actinomadura, больше всего напоминая Actinomadura madurae по своей морфологии и характеристикам использования углерода. См. работу Вильямса с сотр. "The Prokaryotes, vol.11", p.p. 2103-17, 1981 / Stars, Stolp. Truper, Balows and Schlegel, eds/.
Дополнительные характеристики, включая менахинонный анализ, необходимы для того, чтобы определить, имеет ли штамм Q 473-8 свойства, совпадающие с недавно предложенным новым классом Nonomuria. См. работу Гудфеллоу с сотр. "Biology of Actinomycetes, 1988", p.p. 223-38, 1988 /Okami, Beppu and Ogawara, eds/.
Следует понимать, что изобретение не ограничивается использованием конкретного предпочтительного штамма, описанного выше, или организмами, полностью отвечающими его описанию. В частности, предполагается включить другие ВМУ 46164 продуцирующие варианты или мутанты описанных организмов, которые могут быть получены известными методами, такими, как рентгеновское облучение, ультрафиолетовое облучение, обработка азотными горчицами, действие бактериофагов и т.д.
ВМУ 46164 может быть получен культивацией ВМУ 46164 продуцирующего штамма вида Actinomadura, предпочтительно штамма Q 473-8 или его мутанта, или его разновидности в водной питательной среде в аэробных условиях нижнего брожения.
Организм выращивают в питательной среде, содержащей усвояемый источник углерода, например, сахарозу, лактозу, глюкозу, рамнозу, фруктозу, маннозу, мелибозу, глицерин или растворимый крахмал. Питательная среда должна также содержать усвояемый источник азота, такой, как пептон, рыбий корм, соевая мука, питание из земляного ореха, питание из хлопковых семян, жидкость, полученная после вымачивания кукурузы, дрожжевой экстракт или соли аммония. При желании могут быть добавлены неорганические соли, такие, как: хлорид натрия, хлорид калия, сульфат магния, карбонат кальция, фосфаты и т.д.
Микроэлементы, такие, как медь, марганец, железо, цинк и т.д. добавляют к среде при желании они могут быть внесены в питательную среду в качестве примесей других составляющих частей.
Получение ВМУ 46164 можно осуществлять при любой температуре, способствующей удовлетворительному росту продуцирующего организма, например, приблизительно при 16 41 oC. Предпочтительно производить ферментацию приблизительно при 25 32oC, наиболее предпочтительно приблизительно при 27 32oC. Целесообразно использовать нейтральное рН среды. Получение антибиотика осуществляется в период от 4 до 5 дней.
Ферментация может быть проведена в колбах или в лабораторных, или промышленных ферментерах различной производительности. Когда необходимо использовать ферментацию в чане, желательно производить вегетативный посевной материал в питательном бульоне с помощью посева на небольшом объеме питательной среды косого агара или лиофилизованной культуры организма.
После получения активного посевного материала указанным способом его переводят асептически в среду бродильного чана крупномасштабного производства ВМУ 46164. Среда, в которой получают вегетативный посевной материал может быть той же самой или отличаться от среды, используемой в чане, лишь бы она обеспечивала хороший рост продуцирующего организма. Перемешивание в ходе ферментации может быть обеспечено механической трубинной мешалкой. Если нужно, то можно добавить известные антипенные присадки, такие, как олеомаргарин из свиного сала или силиконовое масло.
Выделение ВМУ 46164 антибиотика из ферментативной среды и очистку ВМУ - 46164 нельзя осуществить известными способами экстракции растворителем и хроматографическими методами. Вместо этого выделение проводят с помощью следующего способа.
Весь бульон (90 л) фильтруют с помощью дикалита. К фильтрату добавляют 1 кг ДЕАЕ целлюлозы, тщательно перемешивают и охлаждают до 4 oC. ДЕАЕ целлюлозу регенерируют фильтрацией и ополаскивают свежим охлажденным (4oC) трис буфером. Подложку из ДЕАЕ целлюлозы экстрагируют, помещая ее на 1 ч в 6-литровую смесь метанолас этилацетатом (1:1). Экстрагированную смесь фильтруют, а полученную целлюлозную подложку ополаскивают дополнительно этилацетатом (3 л). К сложному органическому экстракту добавляют 6 л охлажденной воды. Слой этилацетата отделяют и концентрируют при пониженном давлении, получая 1,0 г неочищенного экстракта хромофора.
Другой способ получения экстракта хромофора заключается в замене этилацетата на хлористый метилен на стадии разделения. Так, к одному объему метанола, полученному после экстрагирования ДЕАЕ целлюлозной подложки, связанной с белком, добавляют два объема охлажденной воды (4oC) и один объем хлористого метилена. Органический слой концентрируют на роторном испарителе для получения неочищенного экстракта хромофора.
Экстракт хромофора (1,0 г) адсорбировали на 3,5 г Универсального силикагеля (62-200 микрон) и наносили на 60 мл ВЖХ воронку, содержащую 25 г Лихропрен Si 60 силикагель/ "ЕМ Сайенс", Арт. 9320, 25-40 микрон/. Ступенчатый градиент хлороформа-метанола осуществляли, используя 300 мл объема элюента. Активность соединений, элюированных во фракциях 3-5 была такой, как определяли с помощью анализов в искусственных условиях вне организма. Состав элюента в этих фракциях был следующим: хлороформ, содержащий 3% МеОН соответственно. Эти смешанные фракции (202 мг) подвергали дальнейшей очистке с помощью препаративной тонкослойной хроматографии (ПТХ), используя CHCl3 МеОН (90:10) для проявления.
Регенерированную главную зону активности (Рf 0.37, 48 мг) подвергали дальнейшей очистке с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения на полу-препаративной силикагелевой колонке (Si 83-111-С), используя изократические условия (CHCl3- МеОН 94:6) при 4 мл/мин. Главный пик элюируется через 13.3 минут, как показывает УФ-детектирование (254 нм). Смесь веществ, отвечающую пику, собрали и испарили насухо. Осадок (28 мг) нанесли на вторую "Мерк" ПТХ пластинку. Появление осуществляли хлороформом-ацетонитриллом (60: 40). Главная регенерированная зона (Rf 0,15) имела массу 16,5 мг.
Окончательную очистку проводили с помощью обращенного факзовой ЖХВР, используя "Динамакс" полу-препаративную колонку (С18 83-211-С). Градиентное элюирование осуществляли следующим способом: 20% А 80% В _→ 40% А 60% В через 40 минут, где А ацетонитрил, В 0,1 М ацетат аммония-метанол (3:1). Необходимый хромофор (11 мг) элюировался через 30,9 мин и был идентифицирован, как ВМУ 46164.
Другой процесс очистки для выделения ВМУ 46164 из неочищенного экстракта хромофора осуществляли следующим образом: неочищенный экстракт (12,9 г) растворяли в смеси x хлороформа-метанола 2:1 и адсорбировали на 300 г дикалита (диатомовая земля). Дикалитовую подложку промывали объемами, равными 1 л, следующих растворителей: гексаны, диэтиловый эфир, этилацетат, хлористый метилен и метанол. ВМУ 46164 концентрировали во фракциях диэтилового эфира и этилацетата, которые имели общую массу 0,6 г.
Этот осадок растворяли в 5 мл смеси хлороформа-метанола (1:1) и наносили на колонку "Сефадекс L Н-20", предварительно набухшую в том же самом растворителе. Скорость потока составляли 1,5 мл/мин. Было собрано пять фракций. ВМУ 46164 элюировался главным образом, в третьей фракции при 0,7 объемах слоя. После концентрирования эта фракция весила 143 мг.
Окончательную очистку проводили с помощью нормально- фазовой ЖХВР, используя 21,4 мм "Динамакс" препаративную колонку (Si 83-121-С) при 10 мл/мин. Градиентное элюирование осуществляли из смеси хлороформ-метанол (95:5) в смесь хлороформ-метанол (85:15) через 40 мин. Детектирование проводили при 300 нм. ВМУ 46164 (34 мг) элюировался через 27,7 мин.
Составы, использующие соединение ВМУ 46164 и/или его кислые или основные соли, полученные по реакции присоединения, в качестве лекарственных препаратов могут содержать подходящие количества других ингредиентов. В общем, можно использовать приблизительно от 0,001 до 99,99% одной или более фармацевтически приемлемых нейтральных добавок, таких, как наполнители, носители, стабилизаторы, гелеобразователи, красители, одоранты и им подобные. Содержание лекарственного(ных) препарата(ов) в таких составах обычно составляет приблизительно от 0,01 до 10% предпочтительно приблизительно от 0,17 до 5%
Следующие предпочтительные конкретные варианты осуществления изобретения приведены просто в качестве демонстрации его сути и ни в коей мере не ограничивают объема настоящего изобретения.
Пример 1. Ферментация ВМУ 46164 во встряхиваемых колбах.
Штамм Q 473-8 сохраняли жизнеспособным и переносили в пробирки на косой агар дрожжей из вытяжки солода с содержанием CaCO3. Эта среда состоит из 4,0 г декстрозы, 4,0 г дрожжевого экстракта, 10 г вытяжки солода, 1,5 г карбоната кальция и 15 г агара, доведенная до объема 1 л дистиллированной водой. При каждом переносе косой агар выдерживали в течение 5-7 дней при температуре 28oC.
Чтобы приготовить посевной материал для продуктивной фазы, поверхностной нарост на питательной среде из косого агара переносили в 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл вегетативной среды, состоящей из 2% глюкозы, 1% рыбьего корма и 0,5% карбоната кальция. Вегетативную среду выдерживали в течение 3 дней при температуре 28oC на роторном шейкере, настроенном на режим 250 об/мин.
Пять мл этого вегетативного нароста переносили в 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл продуктивной среды, состоящей из 2% глюкозы, 2% пептона и 0,5% карбоната кальция. Продуктивную среду снова выдерживали в течение 4-5 дней при 28oC на роторном шейкере, настроенном на режим 250 об/мин. Культура давала максимальные уровни ВМУ 46164 примерно через 4 дня ферментативного цикла.
Пример 2. Ферментация ВМУ 46164 в лабораторных ферментерах.
Для ферментации в ферментере "Биолафитте" с номинальным объемом 50 л использовали вегетативную среду, приготовленную в две стадии. Шестнадцать мл вегетативной культуры, как в примере 1, перенесли в 2 л колбу Эрленмейера, содержащую 400 мл второй вегетативной среды, состоящей из 2% глюкозы, 2% пептона и 0,5% карбоната кальция. Эту вторую вегетативную культуру выдерживали в течение трех дней при температуре 28oC на роторном шейкере, настроенном на режим 250 об/мин.
1200 мл этой вегетативной культуры перенесли в 4 л склянку Витро и затем этот посевной материал в ферментер "Биолафитте" с номинальным объемом 50 л, содержащий 30 л продуктивной среды, состоящей из 2% глюкозы, 2% пептона и 0,5% карбоната кальция. Организм оставляли при следующих условиях: перемешивание, 250 об/мин, температура 28oC, аэрация, 30 л/мин. Для контроля пенообразования использовали антипенную присадку (полипропиленгликоль 2,000, "Доу Кемикал".) Максимальные уровни получения ВМУ 46164 достигались в течение 4-5 дней с начала ферментативного цикла.
Пример 3. Изучение Бактериальной Активности.
Используя описанный ниже способ, характеристики ВМУ 46164 сравнивали с характеристиками ампицилина с точки зрения их действия на ряд микроорганизмов. Результаты исследований приведены в табл.1.
Антибактериальный спектр действия ВМУ 46164 определяли методом последовательного разбавления бульона, используя питательный бульон ("Дифко").
Пример 4. Изучение Противоопухолевой Активности.
Характеристики ВМУ 46164 в качестве противоопухолевого препарата против Р 388 лейкемии исследовали на мышах. В табл. 2 приведены результаты, полученные для оливомицина А и для ВМУ 46164.
Метод, используемый для получения данных, приведенных в табл. 2, был описан в статье "Transplanted Animal Tumors," Bradner, W.T. Cancer and Chemotherapy, vo1. 1, p.p.221-227, 1980, L.S.T. Crooke and A.W. Prestayko, eds, Academic Press.
Эти примеры показывают эффективность соединения, относящегося к предмету изобретения и его фармацевтически приемлемых производных для лечения бактериальных инфекционных заболеваний и опухолей в организме "хозяина".
Под термином "хозяин" подразумеваются не только испытания клеток вне организма и испытания, проведенные на мышах, но и также и высшие организмы, например млекопитающие. Люди или пациенты являются предпочтительной группой "хозяев", которых можно лечить соединением в соответствии с изобретением.
Соединения и составы по изобретению можно вводить в подходящие организмы "хозяев", например, пациентам, имеющим бактериальные инфекции и/или опухоли с помощью ряда способов. Рассматриваются оральные, перентеральные, местные, рецептуры, а также капли в нос и глазные капли.
Разумные вариации, которые могли бы прийти в голову опытным специалистам в данной области техники, могут быть осуществлены в границах объема настоящего изобретения.
Использование: микробиология, получение антибиотиков. Сущность изобретения: антибиотик ВМУ-46164, обладающий противоопухолевой активностью, выделенный из продукта ферментации штамма Actinomadura АТСС 53806 с эмпирической формулой C40H43N2O12C, мол.м. 778 и представленными спектральными характеристиками. В способе получения антибиотика после ферментации штамма-продуцента ферментационную жидкость фильтруют, фильтрат смешивают с ДЕАЕ целлюлозой, охлаждают смесь, отделяют ДЕАЕ целлюлозу фильтрованием, промывают ее буфером и экстрагируют смесью органических веществ, экстракт фильтруют, промывают сорбент органическим растворителем, объединяют фильтраты, добавляют к ним воду, отделяют органический слой, его концентрируют с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 с.и 2 з. п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.
