ХИМЕРНЫЙ ПЕПТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Российский патент 2009 года по МПК A61K38/17 A61K39/385 A61P35/00 C12N15/62 

Изобретение относится к лекарственным препаратам, а именно к химерным пептидам, содержащим транспортную (интернализуемую, в мировой литературе встречается также термин "cell penetrating peptides" - СРР) часть и функциональную часть, предназначенным для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований (то есть злокачественных новообразований нелимфоидного происхождения).

Создание химерных пептидов, обладающих цитостатической и цитотоксической активностью, является перспективным направлением развития современной терапии злокачественных новообразований нелимфоидного происхождения.

Из описания к патенту RU 2297241 С2 на изобретение "Химерный белок для лечения злокачественных лимфом" (опубликованного 20.04.2007) известно, что одним из направлений лечения опухолевых заболеваний является использование ингибиторов циклиновых киназ, например белков семейства INK4a, влияющих на клеточный цикл. При этом также известно, что желательно, чтобы молекулярные конструкции доставлялись в клетку "адресно" и воздействовали именно на конкретный внутриклеточный сигнал или функцию. Из упомянутого документа также известно, что в зависимости от структуры разные пептиды могут по разному накапливаться в разных компартментах клетки, что дало теоретическую возможность конструировать последовательности с целевой доставкой в различные органеллы клетки.

Химерный пептид VP-22_p16INK4a по патенту RU 2297241 С2 обладает повышенным биологическим действием благодаря улучшенным свойствам транспортного агента и предназначен для лечения злокачественных лимфом, однако при этом неизвестно о возможности его использования для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований.

Задачей настоящего изобретения является расширение области использования химерного пептида VP-22_p16INK4a и применение данного пептида для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований.

Техническим результатом изобретения является медико-биологический эффект, объективно проявляющийся при использовании данного химерного пептида и заключающийся в решении указанной задачи.

Технический результат достигается благодаря применению для лечения новообразований нелимфоидного происхождения химерного пептида VP-22_p16INK4a, содержащего две последовательности аминокислот, первая из которых включает в себя ингибитор циклиновых киназ в виде активного фрагмента p16INK4a (аминокислотные остатки 84-103 или 84-106) в качестве терапевтического агента, а вторая включает в себя пептид VP22 (аминокислотные остатки 140-301) вируса простого герпеса в качестве транспортного агента для переноса ингибитора циклиновых киназ внутрь целевых клеток.

Химерный пептид VP-22_p16INK4a содержит следующую последовательность аминокислот: D-A-A-T-A-T-R-G-R-S-A-A-S-R-P-T-E-R-P-R-A-P-A-R-S-A-S-R-P-R-R-P-V-E-D-A-A-R-E-G-F-L-D-T-L-V-V-L-H-R-A-G-A-R (далее - SEQ ID NO. 1, подчеркнута последовательность из р16).

Контроль и синхронизация событий в процессе клеточного деления осуществляется большим комплексом молекул, одним из ключевых участников данного процесса являются циклины, активирующие так называемые циклин зависимые киназы (CDK). В течение клеточного цикла происходит последовательная активация транскрипции определенного циклина с последующим образованием активного комплекса циклин-CDK. Остановка клеточного деления в контрольных (рестрикционных) точках (G1, S, G2) осуществляется ингибированием соответствующего циклинового комплекса через специфические белки. Семейство белков, ингибирующих циклин D (контролирующий переход G1-S) относится к пептидам INK4a.

Наиболее изучен из указанной группы пептид p16INK4a. Данный пептид ингибирует активность CDK4 и CDK6, входящих в комплекс с циклином D, что препятствует фосфорилированию pRb и высвобождению E2F, и приводит к остановке клеточного цикла на границе G1-S перехода. Структурно функциональные исследования данного белка выявили активный фрагмент p16INK4a (аминокислоты 84-103 или 84-106), который ответственен за ингибирование CDK4 и CDK6, входящих в комплекс с циклином D.

Пептид p16INK4a играет важную роль в процессе дифференцировки и старения клеток, кроме того, данный пептид не функционален или отсутствует во многих опухолевых тканях. Для злокачественных новообразований нелимфоидного происхождения характерно нарушение функции пептида p16INK4a и гиперэкспрессия циклина D. Таким образом, при злокачественных новообразованиях нелимфоидного происхождения наблюдаются нарушения контроля рестрикционной точки R1 (G1-S перехода).

Как было указано в описании к патенту RU 2297241 С2, возможность использовать естественные ингибиторы циклиновых киназ для контроля пролиферации возникла после открытия способности некоторых белков к трансактивации. То есть белки, синтезированные в одной клетке, могли выходить из нее и, проникая в другую клетку, приводить к активации определенных генов. Исследование структуры этих белков позволило выявить короткие (от 10 до 30 аминокислот) аминокислотные последовательности, ответственные за внутриклеточный транспорт. Было показано, что добавление такой последовательности в структуру произвольного белка наделяет его свойствами внутриклеточной и внутриядерной интернализации. В настоящее время известно около 30 последовательностей таких пептидов.

Сконструированная химерная молекула пептида, включающая фрагменты белка VP22 и фрагмент белка p16INK4a - ингибитора циклиновых киназ, ранее использовалась исключительно для лечения злокачественных лимфом. Однако в настоящее время существуют экспериментальные подтверждения пригодности использования химерного пептида VP-22_p16INK4a и для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований.

Возможность осуществления изобретения с реализацией указанного назначения подтверждают следующие результаты исследований.

Материалы и методы. Примеры

Работа с культурами клеток

Клетки культивировали при 37°С в 5% атмосфере СO2 в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FSB) (ПанЭко, Россия), 10 мкг/мл антибиотика-антимикотика гентамицина (ПанЭко, Россия) и 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия).

Химерный пептид и противоопухолевые препараты растворяли в культуральной среде и добавляли к клеткам при смене среды. Эффект оценивали через 24 часа инкубации.

Краткосрочные культуры опухолей человека

Для оценки эффективности цитотоксического воздействия химерного пептида VP-22_p16INK4a на опухоли человека использовали краткосрочные культуры, полученные из операционного материала рака молочной железы, рака тела желудка, рака матки и рака почки. Также было оценено влияние химерного пептида на краткосрочные культуры кожи, неизмененной слизистой желудка, неизмененного эндометрия и неизмененной почки. Краткосрочные культуры получали путем механической дезагрегации операционного материала, клетки инкубировали 24 часа при 37°С в 5% атмосфере CO₂ в среде RPMI (ПанЭко, Россия), содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FSB) (ПанЭко, Россия) и необходимые для роста составляющие. Далее проводилась замена среды на среду, содержащую химерный пептид VP-22_p16INK4a в концентрации 40 мкМ. Эффект оценивали через 24 и 48 часов инкубации с пептидом.

При работе in vitro эффекты воздействия на клетки химерных пептидов оценивали с помощью метода проточной цитофлуориметрии (проточный цитофлуориметр DAKO Galaxy). Исследовались уровень апоптоза, количество мертвых клеток по окраске AnnexinV-PI (пропидий йодид) и количественное распределение клеток по фазам клеточного цикла по окраске PI.

Окраска на AnnexinV. Использовали набор AnnexinV KIT (Caltag laboratories LI 2004). Клетки отмывали от среды в холодном фосфатно-солевом буфере (PBS), ресуспендировали в 1 × Binding Buffer в концентрации 106 клеток в мл. Отбирали 100 мкл полученной суспензии и добавляли к ней 5 мкл AnnexinV-FITC и 10 мкл PI. Инкубировали в темноте при комнатной температуре 15 минут. Добавляли 400 мкл 1 × Binding Buffer и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Окраска PI. Клетки отмывали от сыворотки двухкратным центрифугированием в 1 мл PBS (4 минуты при 2000 об/мин). Удаляли супернантант, добавляли 300 мкл PBS, по каплям добавляли 700 мкл ледяного 70% этилового спирта и оставляли при -20°С на ночь (фиксация). Зафиксированные образцы клеток осаждали центрифугированием (4 минуты при 2000 об/мин), промывали 1 мл PBS и повторяли центрифугирование. К осажденным клеткам добавляли 100 мкл PBS и 20 мкл РНКазы А (1 мг/мл) и инкубировали 30 минут при 37°С. Далее к суспензии добавляли 30 мкл PI и инкубировали 40 минут при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубации доводили объем исследуемого образца до 1 мл с помощью PBS.

При исследовании химерных пептидов in vivo противоопухолевый эффект оценивали на бестимусных мышах (nude) с перевитыми опухолевыми клетками человека линий А549 (рак легкого) и НСТ-116 (рак толстой кишки человека).

Для исследования эффектов на опухолях человека использовали метод краткосрочных культур.

Исследование влияния химерного пептида на краткосрочные культуры рака молочной железы, рака желудка, рака почки. Показано, что для этой модели наиболее чувствительным вариантом опухоли является рак почки.

Эксперименты in vivo

На бестимусных мышах (Nude) исследовалась противоопухолевая активность химерного интернализуемого пептида VP-22_p16INK4a. Мышам подкожно были перевиты опухолевые культуры клеток человека линий А549 (рак легкого) и НСТ-116 (рак толстой кишки) в количестве около 1 млн клеток на мышь. Введение пептида начинали после обнаружения опухолевого узла (3-4 мм) на 4-6 день после перевивки опухоли. Вводили 100 (первая группа) или 200 мкг (вторая группа) пептида через день. Для обеих опухолевых линий получили 50% торможение роста опухоли. Отличий в эффекте для дозы в 100 и 200 мкг не обнаружено.

Результаты исследований терапии злокачественных новообразований нелимфоидного происхождения с использованием химерного пептида VP-22_p16INK4a поясняются следующими чертежами:

Фиг.1: уровень апоптоза в краткосрочных культурах неизмененной почечной ткани (норма) и рака почки (рак) при инкубации с химерным пептидом VP-22_p16INK4a в концентрации 40 мкМ 24 часа. Средние значения по 4 экспериментам. Количество апоптотических частиц определялось, как положительные по AnnexinV при двойной окраске AnnexinV-PI;

Фиг.2: цитотоксический эффект химерного пептида VP-22_p16INK4a на краткосрочные культуры неизмененной почечной ткани (норма) и рака почки (рак). Средние значения количества частиц, положительных по AnnexinV, и частиц, включающих PI, при двойной окраске AnnexinV-PI по четырем поставленным экспериментам. Инкубация с химерным пептидом 24 часа;

Фиг.3: уровень апоптоза в краткосрочных культурах неизмененной ткани слизистой оболочки желудка (норма) и рака желудка (рак) при инкубации с химерным пептидом VP-22_p16INK4a в концентрации 40 мкМ 24 часа. Средние значения по 4 экспериментам. Количество апоптотических частиц определялось, как положительные по AnnexinV при двойной окраске AnnexinV-PI;

Фиг.4: цитотоксический эффект химерного пептида VP-22_p16INK4a на краткосрочные культуры неизмененной ткани слизистой оболочки желудка (норма) и рака желудка (рак). Средние значения количества частиц, положительных по AnnexinV, и частиц, включающих PI, при двойной окраске AnnexinV-PI по четырем поставленным экспериментам. Инкубация с химерным пептидом 24 часа;

Фиг.5: уровень апоптоза в краткосрочных культурах неизмененной ткани тела матки (норма) и рака шейки матки (рак) при инкубации с химерным пептидом VP-22_p16INK4a в концентрации 40 мкМ 24 часа. Средние значения по 4 экспериментам. Количество апоптотических частиц определялось, как положительные по AnnexinV при двойной окраске AnnexinV-PI;

Фиг.6: цитотоксический эффект химерного пептида VP-22_p16INK4a на краткосрочные культуры неизмененной ткани тела матки (норма) и рака шейки матки (рак). Средние значения количества частиц, положительных по AnnexinV, и частиц, включающих PI, при двойной окраске AnnexinV-PI по четырем поставленным экспериментам. Инкубация с химерным пептидом 24 часа;

Фиг.7: уровень апоптоза в краткосрочных культурах неизмененной ткани кожи молочной железы (норма) и рака молочной железы (рак) при инкубации с химерным пептидом VP-22_p16INK4a в концентрации 40 мкМ 24 часа. Средние значения по 4 экспериментам. Количество апоптотических частиц определялось, как положительные по AnnexinV при двойной окраске AnnexinV-PI;

Фиг.8: цитотоксический эффект химерного пептида VP-22_p16INK4a на краткосрочные культуры неизмененной ткани кожи молочной железы (норма) и рака молочной железы (рак). Средние значения количества частиц, положительных по AnnexinV, и частиц, включающих PI, при двойной окраске AnnexinV-PI по четырем поставленным экспериментам. Инкубация с химерным пептидом 24 часа;

Фиг.9: изменение объема опухолевого узла у мышей nude. Мышам были перевиты подкожно клетки НСТ-116 (рак прямой кишки человека) в количестве 1 млн Химерный пептид VP-22_p16INK4a в дозе 0,1 мг вводили опытной группе (опыт) в район опухолевого узла, контрольной группе (контроль) в район опухолевого узла вводили физиологический раствор. Первая инъекция была сделана на 6 день после перевивки клеток НСТ-116.

Результаты экспериментов, показаных на фиг.1-9, на которых видно увеличение уровня апоптоза и некроза в злокачественных новообразованиях нелимфоидного генеза при использовании химерного пептида VP-22_p16INK4a, подтверждают выраженный цитостатический и цитотоксический эффект в отношении опухолей нелимфоидного генеза как ин витро, так и в моделях на животных.

Описываемые эксперименты по внутриопухолевому введению пептидов при подкожном варианте перевивки опухоли проведены первые в мире. В литературе не описаны аналогичные эксперименты.

При этом результаты на краткосрочных моделях опухолей человека получены впервые в мире. Впервые показано, что пептид со структурой VP-22_p16INK4a может быть применен для лечения злокачественных новообразований нелимфоидного происхождения.

Изобретение относится к лекарственным препаратам, а именно к применению химерного пептида VP-22_p16INK4a для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований. Заявлен химерный пептид VP-22_p16INK4a, содержащий две последовательности аминокислот, первая из которых включает в себя ингибитор циклиновых киназ в виде активного фрагмента p16INK4a в качестве терапевтического агента, а вторая включает в себя пептид VP22 вируса простого герпеса в качестве транспортного агента для переноса ингибитора циклиновых киназ внутрь целевых клеток. Изобретение позволяет расширить область применения химерного пептида VP-22_p16INK4a. 9 ил.

Применение химерного пептида VP-22_p16INK4a, содержащего последовательность аминокислот SEQ ID NO.1, для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований.