АНАЛИЗ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/564 

Данная не предварительная заявка претендует в соответствии со статьей 35 USC § 119 на приоритет по предварительной заявке № 60/490,678, поданной 29 июля 2003, полное описание которой включено в данное описание путем ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к анализу для обнаружения нейтрализующих антител против антитела или антагониста и применению указанного анализа.

Предшествующий уровень техники

Лимфоциты представляют собой один из множества типов белых кровяных клеток, продуцируемых костным мозгом в процессе гематопоэза. Существуют две основные популяции лимфоцитов: В-лимфоциты (В-клетки) и Т-лимфоциты (Т-клетки). В данном случае особый интерес представляют В-клетки.

В-клетки созревают в костном мозге и покидают его, экспрессируя на своей клеточной поверхности антиген-связывающее антитело. Когда простая В-клетка впервые встречается с антигеном, в отношении которого ее мембрано-связанное антитело является специфическим, клетка начинает быстро делиться, и продукты ее деления дифференцируются в В-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые «плазматическими клетками» (плазмоциты). В-клетки памяти имеют более продолжительный период жизни и продолжают экспрессировать мембрано-связанное антитело той же специфичности, что и первоначальная исходная клетка. Плазматические клетки не продуцируют мембрано-связанное антитело, но вместо этого продуцируют антитело в такой форме, которая может быть секретирована. Секретируемые антитела являются основными эффекторными молекулами гуморального иммунитета.

Антиген CD20 (также называемый В-лимфоцит-ограниченным дифференцировочным антигеном человека, Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой приблизительно в 35 кДа, расположенный на предшественниках В-клеток и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al., J.Biol.Chem., 264(19): 11282-11287 (1989); и Einfeld et al., EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). Этот антиген экспрессируется также более чем на 90% В-клеточных неходжкинских лимфом (NHL) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), но он не обнаружен на гематопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, обычных плазматических клетках или других обычных тканях (Tedder et al., J.Immunol., 135(2): 973-979 (1985)). CD20 регулирует раннюю(ие) стадию(ии) процесса активации для инициирования и дифференцировки клеточного цикла (Tedder et al., см.выше) и, возможно, функционирует в качестве канала иона кальция (Tedder et al., J.Cell Biochem., 14D: 195 (1990)).

Предрасположенный к экспрессии CD20 в В-клеточных лимфомах данный антиген может служить в качестве кандидата для «нацеливания» на такие лимфомы. В сущности, такое нацеливание может быть обобщено следующим образом: антитела, специфичные в отношении поверхностного антигена CD20 В-клеток, вводят пациенту. Данные анти-CD20-антитела специфически связываются с антигеном CD20 (якобы) как нормальных, так и злокачественных В-клеток; антитело, связанное с поверхностным антигеном CD20, может приводить к деструкции и уменьшению неопластических В-клеток. Кроме того, химические агенты или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, могут быть конъюгированы с антителом против CD20, таким образом, чтобы агент специфически «доставлялся» в неопластические В-клетки. Безотносительно к подходу, главная цель заключается в разрушении опухоли; специфический подход может быть определен посредством конкретного используемого антитела против CD20, и, следовательно, доступные подходы к нацеливанию на антиген CD20 могут значительно варьироваться.

CD19 представляет собой другой антиген, который экспрессируется на поверхности клеток В-линии. Аналогично CD20, CD19 обнаружен на клетках в процессе дифференцировки линии от стадии стволовых клеток до момента, непосредственно предшествующего конечной дифференцировке в плазматические клетки (Nadler, L. Lymphocyte Typing II 2: 3-37 и Appendix, Renling et al., Eds. (1986), Springer Verlag). Однако, в отличие от CD20, антитело, связывающееся с CD19, вызывает интернализацию антигена CD19. Антиген CD10 идентифицируют, помимо прочего, с помощью антитела HD237-CD19 (так называемого антитела «В4») (Kissel et al., Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)). Антиген CD19 присутствует на 4-8% мононуклеарных клеток периферической крови, селезенки, лимфатических узлов или миндалевидных желез. CD19 не обнаруживается на Т-клетках периферической крови, моноцитах или гранулоцитах. Виртуально все не-Т-клеточные острые лимфобластные лейкемии (ALL), В-клеточные хронические лимфоцитные лейкемии (CLL) и В-клеточные лимфомы экспрессируют CD19, обнаруживаемый с помощью антитела В4 (Nadler et al., J.Immunol., 131:244 (1983); и Nadler et al., в Progress in Hematology, Vol.XII, pp.187-206. Brown E., ed. (1981) Grune&Stratton, Inc.).

Были идентифицированы дополнительные антитела, которые узнают специфические для стадии дифференцировки антигены, экспрессируемые клетками В-клеточной линии. К ним относится антитело В2, направленное против антигена CD21; антитело В3, направленное против антигена CD22; и антитело J5, направленное против антигена CD10 (так называемое CALLA). См., патент США № 5595721, выданный 21 января 1997 (Kaminski et al.).

Антитело ритуксимаб (RITUXAN®) представляет собой генетически сконструированное химерное моноклональное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20. Ритуксимаб представляет собой антитело, называемое «С2В8» в патенте США № 5736137, выданном 7 апреля 1998 г. (Anderson и др.). RITUXAN® предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или рефрактерной, низкоуровневой или фолликулярной, CD20 положительной, В-клеточной неходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro продемонстрировали, что RITUXAN® связывает комплемент человека и растворяет лимфоидные В-клеточные линии за счет комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)). Кроме того, он обладает значительной активностью в анализах антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Позднее было показано, что RITUXAN® обладает антипролиферативным действием в анализах, в которых используется меченный по тритию тимидин, и непосредственно индуцирует апоптоз, тогда как другие анти-CD19- и анти-CD20- антитела таким свойством не обладают (Maloney et al., Blood, 88(10): 637a (1996)). Синергизм между RITUXAN® и химиотерапией и токсинами также наблюдался экспериментально. В частности, RITUXAN® повышает чувствительность устойчивых к действию лекарственных средств клеточных линий В-клеточной лимфомы человека к цитотоксическому действию доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)). Доклинические исследования in vivo показали, что RITUXAN® резко уменьшает количество В-клеток в периферической крови, лимфатических узлах и костном мозге обезьян cynomolgus (макака-крабоед, Macaca fascicularis), предположительно посредством комплемент- и клеточно-опосредованных процессов (Reff et al. Blood 83(2): 435-445 (1994)).

Патенты и патентные публикации, касающиеся антител против CD20, включают в себя патенты США №№ 5776456, 5736137, 6399061 и 5843439, а также заявки на патент США № US 2002/0197255A1 и US 2003/0021781A1 (Anderson и др.); патент США № 6455043В1 и WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez и White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez и Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky и др.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter и White); WO 01/10460 (White и Grillo-Lopez); заявки на патент США № US 2002/0006404 и WO 02/04021 (Hanna и Hariharan); заявки на патент США № US 2002/0012665A1 и WO 01/74388 (Hanna, N); заявки на патент США № US 2002/0009444A1 и WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C.); заявки на патент США № US 2002/0128488A1 и WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky и др.); WO 02/096948 (Braslawsky и др.); WO 02/079255 (Reff и Davies); патент США № 6171586B1 и WO 98/56418 (Lam et al.); WO 98/58964 (Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.); WO 99/51642, патент США № 6194551B1, патент США № 6242195B1, патент США № 6528624B1 и патент США № 6538124 (Idusogie и др.); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd и др.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez и др.); заявки на патент США № US 2002/0004587A1 и WO 01/77342 (Miller и Presta); заявки на патент США № US 2002/0197256 (Grewal, I.); патенты США №№ 6090365B1, 6287537B1, 6015542, 5843398 и 5595721 (Kaminski и др.); патенты США №№ 5500362, 5677180, 5721108 и 6120767 (Robinson и др.); патент США № 6410391B1 (Raubitschek и др.); патент США № 6224866B1 и WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg и Hansen); WO 00/76542 (Golay и др.); WO 01/72322 (Wolin и Rosenblatt); патент США № 6368596B1 (Ghetie и др.); заявку на патент США № US 2003/0026801A1 (Weiner и Hartmann); WO 02/102312 (Engleman, E), каждый из которых специально включен в данное описание путем ссылки. См. также патент США 5849898 и заявку ЕР № 330191 (Seed и др.); патент США № 4861579 и ЕР 332865А2 (Meyer и Weiss) и WO 95/03770 (Bhat и др.).

Публикации, касающиеся терапии с использованием ритуксимаба, включают в себя Perotta and Abuel “Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab” Abstract # 3360, Blood 10(1) (part 1-2): p.88B (1998); Stashi et al., “Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura”, Blood 98(4): 952-957 (2001); Matthews, R. “Medical Heretics”, New Scientist 97 April, 2001); Leandro et al., “Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion” Ann Pheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro et al. “Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al. “An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”, Arthritis and Rheumatism 46(1): 2673-3677 (2002); Edwards and Cambridge “Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes” Rheumatology 40:205-211 (2001); Edwards et al. “B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders” Biochem Soc. Trans. 3094): 824-828 (2002); Edwards et al. “Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: Arandomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Penstronk “IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab”, Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. “Efficacy of selective B cell blockage in the treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheum. 46:2029-2033 (2002); Hidashida et al."Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; Ne Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002.

В заявке на патент США № 2003/0068664 (Albitar et al.) описан анализ ELISA для определения антихимерного тела человека (НАСА), направленного против ритуксимаба.

Краткое изложение сущности изобретения

В примере 1 данного изобретения описана разработка анализа комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) для обнаружения нейтрализующих антител против антитела, которое связывается с В-клеточным поверхностным маркером, а именно антигеном CD20. Активность CDC измеряли путем инкубирования CD20-положительных клеток с комплементом человека в отсутствие или в присутствии различных концентраций антитела против CD20. Затем измеряли цитотоксичность путем подсчета живых клеток. Был протестирован матриксный эффект сыворотки крови на эффективность анализа. Сыворотка крови могла допускаться в концентрации вплоть до 40% без заметного изменения величин ЕС₅₀. Затем были исследованы образцы сыворотки крови пациента с системной красной волчанкой (SLE), получившего лечение антителом против CD20 и отвечающего на антитело. CDC-активность антитела против CD20 могла быть или полностью, или частично блокирована сывороткой НАСА, указывая не нейтрализующую активность обработанных образцов. Для сравнения, образцы сыворотки крови, полученной перед введением антитела против CD20, не продемонстрировали нейтрализующей активности. Данный анализ характеризует природу любого ответа антител против лекарственного средства; следовательно, он будет представлять ценность для оценки безопасности и эффективности лекарственного средства.

Соответственно, в настоящем изобретении разработан способ оценки эффективности антитела, которое связывается с CD20, включающий в себя измерение способности биологического образца, полученного от пациента, обработанного антителом против CD20, блокировать биологическую активность антитела против CD20.

Изобретение дополнительно относится к способу иммунотерапии, включающему в себя введение пациенту антитела, которое связывается с CD20; и измерение способности биологического образца, полученного от пациента, блокировать биологическую активность антитела против CD20.

В другом аспекте, изобретение относится к способу обнаружения нейтрализующих антител в отношении терапевтического антитела, включающему в себя воздействие на клетки, которые экспрессируют антиген, с которым связывается терапевтическое антитело, комплемента в присутствии терапевтического антитела и биологического образца, полученного от пациента, обработанного данным антителом, и определение активности комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) терапевтического антитела, где снижение CDC-активности указывает на присутствие нейтрализующих антител в биологическом образце.

Кроме того, разработан способ оценки эффективности антагониста, который связывается с В-клеточным поверхностным маркером, включающий в себя измерение способности биологического образца, полученного от пациента, обработанного антагонистом, блокировать биологическую активность антагониста.

В еще одном следующем варианте осуществления изобретение относится к способу иммунотерапии, включающему в себя введение пациенту антитела, которое связывается с В-клеточным поверхностным маркером, и измерение способности биологического образца, полученного от пациента, блокировать биологическую активность антитела.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

1. Определения

Если не указано иначе, выражение «биологический образец» в данном описании означает образец, полученный от пациента. Образец может включать в себя антитела, которые связываются с антителом или лекарственным средством, которым лечат пациента, таким как антитело человека против мыши (НАМА), антихимерное антитело человека (НАСА) или антитело человека против человека (НАНА). Биологический образец может, например, представлять собой сыворотку крови, антитела, выделенные у пациента, плазму крови, клеточный лизат, молоко, слюну и другие выделения, но предпочтительно сыворотку крови.

Выражение «биологическая активность» относится к измеряемой функции антитела или его антагониста. Подразумеваются различные виды активности, которые включают в себя, но не ограничиваются указанным, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), апоптоз, ингибирование роста клеток (например, опухолевых клеток) и т.д.

Способность биологического образца (или антител, возникающих у пациента против рассматриваемого лекарственного средства) «блокировать» биологическую активность антагониста или антитела относится как к частичному, так и к полному блокированию такой активности.

Термин «В-клеточный поверхностный маркер» в данном описании относится к антигену, экспрессируемому на поверхности В-клетки, на который может быть нацелен антагонист или антиген, который с ним связывается. Иллюстративные В-клеточные поверхностные маркеры включают в себя CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 лейкоцитарные поверхностные маркеры. Конкретный представляющий интерес В-клеточный поверхностный маркер предпочтительно экспрессируется на В-клетках по сравнению с другими не-В-клеточными тканями млекопитающего и может экспрессироваться как на предшественнике В-клетки, так и на зрелой В-клетке. В одном варианте осуществления маркер является таким как CD20 или CD19, который находится на В-клетках в процессе дифференцировки линии от стадии стволовых клеток до момента непосредственно перед окончательной дифференцировкой в плазматические клетки крови. Предпочтительным В-клеточным поверхностным маркером в данном описании является CD20.

Антиген «CD20» представляет собой не гликозилированный фосфопротеин в 35 кДа, обнаруживаемый на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови и лимфатических органов. CD20 экспрессируется во время раннего пред-В-клеточного развития и остается до дифференцировки в плазматические клетки. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на злокачественных В-клетках. Другие названия для CD20, имеющиеся в литературе, включают в себя «В-лимфоцит-ограниченный антиген» и «Вр35». Антиген CD20 описан, например, в публикации Clark et al. PNAS (USA) 82:1766 (1985).

Как использовано в данном описании, термин «уменьшение (количества) В-клеток» относится к снижению уровней В клеток у животного или человека, обычно после лечения лекарственным средством или антителом, по сравнению с уровнем перед лечением. Уменьшение количества В-клеток может быть частичным или полным. Уровни В-клеток измеряют хорошо известными способами, такими как описанные у Reff et al., Blood 83:435-445 (1994) или в патенте США № 5736137 (Anderson и др.). В качестве примера, млекопитающему (например, обычному примату) можно вводить различные дозировки антитела или антагониста, и концентрации В-клеток в периферической крови могут быть определены, например, с использованием способа FACS, с помощью которого подсчитывают В-клетки.

«В-клеточное злокачественное заболевание» представляет собой злокачественное заболевание, затрагивающее В-клетки. Примеры включают в себя болезнь Ходжкина, включая лимфоцит-доминирующую болезнь Ходжкина (LPHD); неходжкинскую лимфому (NHL); фолликулярную центрально-клеточную лимфому (FCC); острую лимфоцитарную лейкемию (ALL); хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL); волосатоклеточный лейкоз; плазмацитоидную лимфоцитарную лимфому; лимфому клеток коры головного мозга, СПИД - или ВИЧ-связанную лимфому; множественную миелому; лимфому центральной нервной системы (ЦНС); посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD); макроглобулинемию Вальденстрома (лимфоплазмацитарная лимфома); лимфому, ассоциированную со слизистой лимфатической ткани (MALT) и лимфому/лейкемию маргинальной зоны.

Неходжкинская лимфома (NHL) включает в себя, но не ограничивается указанным, низкоуровневую фолликулярную NHL, рецидивирующую или рефрактерную NHL, NHL фронтальной линии низкой степени, NHL стадии III/IV, химиотерапевтически устойчивую NHL, NHL небольших лимфоцитов (SL), промежуточной степени/фолликулярную NHL, промежуточной степени диффузную NHL, диффузную NHL больших клеток, агрессивную NHL (включая агрессивную NHL фронтальной линии и агрессивную рецидивирующую NHL), рецидивирующую или рефрактерную после аутологичной трансплантации стволовых клеток NHL, иммунобластную NHL высокой степени, лимфобластную NHL высокой степени, NHL небольших нерасщепляемых клеток высокой степени, большое заболевание NHL.

В данном описании термин «аутоиммунное заболевание» относится к заболеванию или нарушению, возникающему в собственных тканях индивидуума или направленному против них. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают в себя, но не ограничиваются указанным, артрит (ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориазный артрит), псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермический некролиз, системная склеродерма или склероз, ответные реакции, связанные с воспалительным заболеванием кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, включая инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответные реакции, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, недостаток адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE), ювенильный начальный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, иммунные ответные реакции, связанные с острой и отставленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, грануломатоз, включая грануломатоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (включая ANCA), апластическую анемию, анемию Diamond Blackfan, иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению А, панцитопению, лейкопению, заболевания, включающие в себя диапедез лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС), синдром множественного повреждения органа, миастению гравис (особая форма мышечной слабости), заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, антигломерулярное заболевание базальной мембраны, синдром антифосфолипидного антитела, аллергический нефрит, болезнь Бехета, синдром Кастлемана, синдром Гудпастчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжение трансплантата плотного органа, заболевание трансплантат-против-хозяина (GVHD), буллезную пузырчатку, пузырчатку обыкновенную, аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь Рейтера, синдром окостеневшего человека, артерит гигантской клетки, иммунный комплексный нефрит, нефропатию IgA, полинейропатию IgM или IgM-опосредованную нейропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), включая флударабин-связанную ITP, тромбоцитопенический акроангиотромбоз (ТТР), аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание яичек и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотироидизм; аутоиммунные эндокринные заболевания, включая аутоиммунный тироидит, хронический тироидит (тироидит Хашимото), подострый тироидит, идиопатический гипотироидизм, болезнь Аддисона, болезнь Граве, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), диабет типа I, также относящийся к инсулинозависимому сахарному диабету (IDDM), и синдром Шихана; аутоиммунный гепатит, лимфоидную внутритканевую пневмонию (HIV), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантат) против NSIP, синдром Гуиллайна-Барре, васкулит больших сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (Такаясу), васкулит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Бергера (IgA-нефропатия), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный желчный цирроз, глютенчувствительная целиакия (глютеновая энтеропатия), криоглобулинемия, амиотрофический латеральный склероз (ALS), заболевание коронарной артерии, болезнь холодовой агглютинации, ингибиторы приобретенного фактора VIII, люпус-нефрит и т.д.

«Антагонист», который связывает В-клеточный поверхностный маркер, в данном изобретении представляет собой молекулу, которая при связывании с В-клеточным поверхностным маркером разрушает или уменьшает количество В-клеток у млекопитающего и/или препятствует одной или нескольким функциям В-клеток, например, путем снижения или предотвращения гуморальной ответной реакции, вызываемой В-клеткой. Антагонист предпочтительно способен уменьшать количество В-клеток у млекопитающего, которому он введен. Такое истощение может достигаться посредством различных механизмов, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индукция смерти В-клеток (например, путем апоптоза). Антагонисты, включенные в объем настоящего изобретения, включают в себя антитела, пептиды с синтетическими или природными последовательностями, антагонисты, имеющие небольшие молекулы, которые связываются с В-клеточным маркером, необязательно конъюгированные или слитые с цитотоксическим агентом. Предпочтительный антагонист включает в себя антитело.

Термины «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и “ADCC” относятся к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксичные клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcRs) (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на поверхности клетки-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, клетки NK, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на стр.464 публикации Raverch и Kinet, Annu.Rev.Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки ADCC активности представляющей интерес молекулы может быть осуществлен анализ ADCC in vitro, так как описано в патентах США № 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают одноядерные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, может быть проведена оценка ADCC активности представляющей интерес молекулы in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в публикации Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcRs и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по крайней мере FcγRIII и осуществляют ADCC эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают одноядерные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, где предпочтительными являются клетки PBMC и NK.

Термины «рецептор Fc» или «FcR» использованы для описания рецептора, который связывается с областью Fc антитела. Предпочтительный FcR представляет собой исконную последовательность FcR человека. Более того, предпочтительный FcR является таким, который связывает антитело IgG (гамма рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно соединенные формы данных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIА («активирующий рецептор») и FcγRIIВ («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные последовательности аминокислот, которые отличаются в первую очередь цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIА содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIВ содержит иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см. Dalron, Annu Rev.Immunol., 15:203-234 (1997)). Обзор данных по рецепторам FcR приведен в публикациях Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 :457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие рецепторы FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются в данном описании термином «FcR». Термин также включает в себя рецептор новорожденных, FcRn, который является ответственным за перенос вещества IgG в утробный плод (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J.Immunol. 24: 249 (1994)). FcR в данном описании включают полиморфизм, такой как генетический диморфизм гена, который кодирует FcγRIIА, приводя или к фенилаланину (F), или к валину (V) в аминокислоте в положении 158, расположенной в области рецептора, которая связывается с IgG1. Было показано, что гомозиготный валиновый FcγRIIIА (FcγRIIIa-158V) обладает более высокой аффинностью в отношении IgG1 человека и опосредует повышенную ADCC in vitro относительно гомозигонтого фенилаланинового (FcγRIIIa-158F) или гетерозиготного (FcγRIIIa-158F/V) рецепторов.

Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность» или “CDC” относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Комплемент-активированный путь инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента анализ CDC может быть осуществлен, как описано, например, Gazzano-Santoro et al., J.Immunol.Methods 202: 163 (1996).

«Ингибирующие рост» антагонисты или антитела представляют собой те, которые предотвращают или снижают пролиферацию клетки, экспрессирующей антиген, с которым связывается антагонист. Например, антагонист или антитело могут предотвращать или уменьшать пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

Антагонисты или антитела, которые «индуцируют апоптоз», представляют собой те, которые индуцируют программируемую клеточную смерть, например, В-клетки, что может быть определено с помощью стандартных анализов апоптоза, таких как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сжатие клеток, расширение эндоплазматической сети, фрагментация клеток и/или образование мембранных везикул (так называемых апоптических тел).

Термин «антитело» в данном описании использован в наиболее широком смысле и в частности охватывает целые моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по крайней мере из двух целых антител, и фрагменты антител до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность.

Термин «фрагменты антител» охватывает части целых антител, предпочтительно включающие в себя их антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

«Природные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины примерно в 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей изменяется для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеют регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь содержит, по крайней мере, на одном конце вариабельную область (V_H), за которой следует ряд постоянных областей. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область (V_L) на одном конце и постоянную область на другом конце; постоянная область легкой цепи выровнена по первой постоянной области тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи выровнена по вариабельной области тяжелой цепи. Предполагается, что определенные остатки аминокислот образуют границу раздела между вариабельными областями легкой и тяжелой цепей.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что некоторые части вариабельных областей в значительной степени отличаются в последовательности среди антител и используются при связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена между вариабельными областями антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями в вариабельных областях как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных областей называются областями каркаса (FRs). Вариабельные области каждой из природных тяжелой и легкой цепей содержат четыре FRs, в большинстве принимающие β-листовые конфигурации, связанные тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть β-листовой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в близком соседстве посредством FRs и вместе с вариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антиген-связывающих сайтов антител (см. Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Постоянные области не включены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

Расщепление папаином антител приводит к двум идентичным антиген-связывающим фрагментам, называемым фрагментами “Fab”, где каждый содержит единственный антиген-связывающий сайт, и остаточный фрагмент “Fc”, чье название отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')₂, который содержит два антиген-связывающих сайта и еще способен к кросс-сшиванию антигена.

“Fv” представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий сайт. Данная область состоит из димера одной тяжелой цепи и одной вариабельной области легкой цепи в тесном не ковалентном взаимодействии. Именно в данной конфигурации три гипервариабельные области каждой вариабельной области взаимодействуют для определения антиген-связывающего сайта на поверхности димера V_H-V_L. Совместно, шесть гипервариабельных областей придают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако, даже единственная переменная область (или половина Fv, включающая только три гипервариабельные области, специфичные по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с пониженной аффинностью по сравнению с полным сайтом связывания.

Фрагмент Fab также содержит постоянную область легкой цепи и первую постоянную область (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением новых остатков на карбоксильных концах СН1 области тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH относится в данном описании к обозначению Fab', в котором цистеиновый(ые) остаток(ки) постоянных областей содержит по крайней мере три тиольные группы. Фрагменты антитела F(ab')₂ первоначально были получены как пары фрагментов Fab', которые содержат между собой гарнирные цистеины. Также известны другие виды химического связывания фрагментов антител.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) любого из видов позвоночных животных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (к) и лямбда (λ) на основании последовательностей аминокислот их постоянных областей.

В зависимости от последовательности аминокислот постоянной области их тяжелых цепей, антитела могут быть отнесены к различным классам. Существует пять основных классов цельных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Постоянные области тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, называют α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антител включают области V_H и V_L антитела, где данные области присутствуют в единственной полипептидной цепи. Предпочтительно полипептид Fv дополнительно включает в себя полипептидный линкер между V_H и V_L областями, который дает возможность фрагменту scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор по scFv см. Plockthun, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антиген-связывающими сайтами, фрагменты которых включают вариабельную область тяжелой цепи (V_H), связанную с вариабельной областью легкой цепи (V_L) в той же самой полипептидной цепи (V_H-V_L). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы предоставить возможность спаривания между двумя доменами одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело», как он использован в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, включающие в себя популяцию, являются идентичными за исключением природно существующих мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, направленными против единственного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам обычного (поликлонального) антитела, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела имеют преимущества в том, что они являются синтезированными с помощью гибридомных культур, не загрязненные другими иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, как на полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требование продуцирования антитела любым конкретным способом. Например, моноклональное антитело для использования в соответствии с настоящим изобретением может быть получено гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или может быть получено методами рекомбинантной ДНК (например, см. патент США 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из библиотек фаговых антител с использованием способов, например, описанных Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в данном описании конкретно включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность (патент США 4816567; Morrison et al., Proc. Natl.Acad.Sci., USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела в данном описании включают «приматизированные» антитела, включающие в себя переменные домены антиген-связывающих последовательностей, полученные от приматов, не являющихся человеком (например, низшие узконосые обезьяны, такие как бабуин, резуз или обезьяна cynomoglus) и последовательности постоянной области человека (патент США 5693780).

«Гуманизованные» формы антител не человека (например, мышиные) представляют собой антитела, которые содержат минимальные последовательности, являющиеся производными нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизованные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело реципиента), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области видов, не являющихся человеком (антитело донора), таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, обладающие желаемой специфичностью, афинностью или способностями. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками не человека. Кроме того, гуманизованные антитела могут включать остатки, которые не выявлены в антителе реципиента или в антителе донора. Такие модификации проводят для дополнительного повышения качества производительности антитела. Обычно, гуманизованное антитело будет включать по существу все из, по крайней мере, одного и, обычно два различных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям иммуноглобулина не человека, и все или по существу все из областей FR представляют собой области последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизованное антитело необязательно также будет содержать по крайней мере часть постоянной области иммуноглобулина (FC), обычно относящуюся к иммуноглобулину человека Дополнительные подробности см. в публикациях Jones et al., Nature 321: 522-525 91986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op.Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Термин «гипервариабельная область», когда он использован в данном описании, относится к остаткам аминокислот антитела, которые ответственны за антигенное связывание. Гипервариабельная область включает остатки аминокислот от «определяющей комплементарность области» или “CDR” (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65(Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55(Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; Chotia and Lesk, J.Mol.Biol. 186:901-917 (1987)). Остатки «каркас» или «FR» представляют собой те остатки переменной области, которые отличаются от определенных здесь остатков гипервариабельной области.

Антагонист или антитело «которое связывается» с представляющим интерес антигеном, например, В-клеточным поверхностным маркером или CD20, является таким, который способен связывать такой антиген с достаточной аффинностью и/или эффективностью, что такой антагонист или антитело могут использоваться в качестве терапевтического агента для нацеливания к клетке-мишени, экспрессирующей антиген.

В целях настоящего изобретения термин «иммунотерапия» будет относиться к способу лечения млекопитающего (предпочтительно пациента-человека) антителом, где антитело может быть не конъюгированным или «голым» антителом, или антитело может быть конъюгировано или слито с гетерологичной(ыми) молекулой(ами) или агентом(ами), такими как один или несколько цитотоксических агентов, образуя тем самым «иммуноконъюгат».

Как использовано в данном описании, «терапевтическое антитело» представляет собой антитело, которое является эффективным при лечении заболевания или нарушения млекопитающего, имеющего такое заболевание или нарушение, или предрасположенного к заболеванию или нарушению. Иллюстративные терапевтические антитела включают антитела против HER2, включая rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN_) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США № 5725856); антитела против CD20 (см.ниже); анти-IL-8 (St.John et al., Chest 103:932 (1993) и международная публикация № WO 95/23865); антитела против VEGF, включая гуманизованные и/или аффинно развитые антитела против VEGF, такие как гуманизованное антитело против VEGF huA4.6.1 AVASTINZ_ (Kim et al., Growth Factores, 7:53-64 (1992), международная публикация № WO 96/30046 и WO 98/45331, опубликованная 15 октября 1998 г.); антитела против PSCA (WO 01/40309); антитела против CD-40, включая S2C6 и его гуманизованные варианты (WO 00/75348); антитела против CD-11а, включая Raptiva^TM (патент США 5622700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4: 3-7 (1991) и Hourmant et al., Transplantation 58: 377-380 (1994)); антитела против IgE (Presta et al., J.Immunol. 151: 2623-2632 (1993) и международная публикация № WO 95/19181; патент США № 5714338, выданный 3 февраля 1998 г., или патент США № 5091313, выданный 25 февраля 1992 г., WO 93/04173, опубликованная 4 марта 1993 г., или Международная заявка № РСТ/US98/13410, поданная 30 июня 1998 г., патент США 5714338); антитела против CD-18 (патент США № 5622700, выданный 22 апреля 1997 г., или как в WO 97/26912, опубликованной 31 июля 1997 г.); антитела против антитела рецептора Аро-2 (WO 98/51793, опубликованная 19 ноября 1998 г.); антитела против TNF-, включая сА2 (REMICADE_), CDP571 и МАК-195 (см. патент США 5672347, выданный 30 сентября 1997 г., Lorenz et al., J.Immunol. 156(4): 1646-1653 (1996) и Dhainaut et al. Crit. Care Med., 23(9): 1461-1469 (1995)); антитела против фактора ткани (TF) (Европейский патент № 0420937 В1, выданный 9 ноября 1994 г.); антитела против интегрина человека α₄-β₇ (WO 98/06248, опубликованная 19 февраля 1998 г.); антитела против EGFR (химеризованное или гуманизованное антитело 225 как в WO 96/40210, опубликованной 19 декабря 1996 г.); антитела против CD3, такие как ОКТ3 (патент США № 4515893 выданный 7 мая 1985 г.); антитела против CD25 или против Тас, такие как CHI-621 (SIMULECT_) и ZENAPAX_ (см. патент США № 5693762, выданный 2 декабря 1997 г.); антитела против CD4, такие как антитело сМ-7412 (Choy et al., Artritis Rheum. 3991): 52-56 (1996)); антитела против CD52, такие как CAMPATH-1H (Riechmann et al., Nature 332: 323-337 (1988); антитела против рецептора Fc, такие как антитело M22, направленное против Fc_RI, как в публикации Graziano et al., J.Immunol. 155(10): 4996-5002 (1995); антитела против карциноэмбрионного антигена (СЕА), такие как hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res., 55 (23Suppl.): 5935s-5945s (1995); антитела, направленные против эпителиальных клеток молочной железы, включая huBrE-3, hu-Mc3 и CHL6 (Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); и Richman et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5916s-5920s (1995); антитела, которые связываются с клетками карциномы толстой кишки, такими как С242 (Litton et al., Eur.J.Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); антитела против CD38, например, АТ13/5 (Ellis et al., J.Immunol. 155(2): 925-937 (1995)); антитела против CD33, такие как Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res. 55 (23Suppl): 5908s-5910s (1995) и СМА-676 или CDP771; антитела против CD22, такие как LL2 или LymphoCide (Juweid et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5899s-5907s (1995); антитела против EpCAM, такие как 17-1А (PANOREX_); антитела против GpIIb/IIIa, такие как абциксимаб или с7Е3 Fab (REOPRO_); антитела против RSV, такие как MEDI-493 (SYNAGIS_); антитела против CMV, такие как PROTOVIR_; антитела против ВИЧ, такие как PRO542; антитела против гепатита, такие как антитело против Нер В OSTAVIR_; антитело OvaRex против CA-125; антитело ВЕС2 против идиотипического эпитопа CD3; антитело VITAXIN_ против _v_3; антитело против карциномы почечных клеток человека, такое как ch-G250; ING-1; антитело против 17-1А человека (3622W94); антитело против колоректальной опухоли человека (А33); антитело против меланомы человека R24, направленное против ганглиозида GD3; антитело против карциномы сквамозных клеток человека (SF-25); и антитела против лейкоцитарного антигена человека (HLA), такие как Smart ID10, и антитело Oncolym (Lym-1)против HLA DR.

Примеры антител, которые связывают антиген CD20, включают: «С2В8», называемые в настоящее время «Ритуксимаб» (“RITUXAN®”) (патент США № 5736137, специально включенный в данное описание путем ссылки); иттрий-[90]-меченое 2В8 мышиное антитело, обозначенное “Y2D8” или «Ибритумомаб Тиуксетан» ZEVALIN® (патент США № 5736137, специально включенный в данное описание путем ссылки); мышиный IgG2a “B1”, также называемый «Тозитумомаб», необязательно меченый ¹³¹I для образования “¹³¹I-B1” антитела (иод I¹³¹ тозитумомаб, BEXXAR^TM), патент США № 5595721, специально включенный в данное описание путем ссылки); мышиное моноклональное антитело “1F5” (Press et al., Blood 69(2): 584-591 (1987)); мышиное 2Н7 и химерное 2Н7 антитело, патент США № 5677180, специально включенный в данное описание путем ссылки); гуманизованное 2Н7, включая «гуманизованное 2Н7 v16» (см. ниже); huMax-CD20 (Genmab, Denmark); AME-133 (Applied Molecular Evolution); и моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl или Nu-B2, доступное от International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)).

Примеры антител, которые связывают антиген CD19, включают антитела против CD19, описанные в Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother., 32: 364-372 (1991) и Vlasveld et al., Cancer Immunol. Immunother., 40: 37-47 (1995); и антитело В4, описанное в публикации Kiesel et al., Leukemia Research II, 12: 1119 (1987).

Термины «ритуксимаб» или «RITUXAN®», использованные в данном описании, относятся к генетически сконструированному химерному моноклональному антителу мыши/человека, направленному против антигена CD20, и обозначаются как «С2И8» в патенте США 5736137, преднамеренно включенном в данное описание путем ссылки. Антитело представляет собой иммуноглобулин IgG1 каппа, содержащий последовательности переменной области легкой цепи и тяжелой цепи мыши и последовательности постоянной области человека. Ритуксимаб обладает связывающей аффинностью в отношении антигена CD20, составляющей приблизительно 8,0 нМ.

Исключительно в целях настоящего изобретения термин «гуманизованный 2Н7 v16» относится к антителу, включающему в себя показанные ниже последовательности переменной легкой и переменной тяжелой цепи.

Домен переменной легкой цепи 2Н7 v16:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1).

Домен переменной тяжелой цепи 2Н7 v16:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGN

GDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDV

WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2).

Предпочтительный гуманизованный 2Н7 v16 включает в себя последовательность аминокислот легкой цепи:

MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQK

PGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPP

TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC (SEQ ID NO: 3)

и последовательность аминокислот тяжелой цепи:

MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWV

RQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAV

YYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG

CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP

EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).

«Выделенный» антагонист или антитело представляет собой тот, который был идентифицирован и отделен, и/или выделен из компонентов окружающей его природной среды. Загрязняющие компоненты его природной окружающей среды представляют собой вещества, которые могли бы мешать диагностическим или терапевтическим применениям антагониста или антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие протеиноподобные и непротеиноподобные растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антагонист или антитело будут очищены (1) до степени, превышающей 95% по весу антагониста или антитела, как определено с помощью метода Лоури (Lowry), и наиболее предпочтительно, превышающей 99% по весу; (2) до степени, достаточной для получения по крайней мере 15 остатков N-концевой или внутренней последовательности аминокислот с использованием наращивающего-закрывающего секвенатора, или (3) до гомогенности по SDS-PAGE в восстановительных или не восстановительных условиях с использованием кумассина синего, или, предпочтительно, серебряного красителя. Выделенный антагонист или антитело включают антагонист или антитело in situ в рекомбинантных клетках, если по крайней мере один компонент природной окружающей среды антагониста или антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенный антагонист или антитело получают с использованием по крайней мере одной стадии очистки.

Термин «млекопитающее» в целях настоящего изобретения относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и выращиваемых в сельском хозяйстве животных, а также животных в зоопарке, промысловых животных или домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой человека.

Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Те, которые нуждаются в лечении, включают субъектов, которые уже имеют заболевание или нарушение, а также тех, появление заболевания или нарушения у которых следует предотвратить. Следовательно, млекопитающему может быть поставлен диагноз заболевания или нарушения, или оно может быть предрасположено или подвержено появлению заболевания. Выражение «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антагониста или антитела, которое является эффективным для предотвращения, облегчения или лечения рассматриваемого заболевания или состояния.

Термин «иммунодепрессивный агент», как он использован в данном описании применительно к адъювантной терапии, относится к веществу, которое подавляет или маскирует иммунную систему подвергаемого лечению млекопитающего. Термин включает в себя вещества, которые подавляют продуцирование цитокина, понижающе регулируют или подавляют экспрессию самоантигена или маскируют антигены МНС. Примеры таких агентов включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см.патент США 4665077, описание которого включено в данное изобретение путем ссылки); нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПВС); азатиоприн; циклофосфамид; бромкриптин; даназол; дапзон; глутаральдегид (который маскирует антигены МСН, как описано в патенте США 4120649); анти-идиотипические антитела для антигенов МНС и фрагментов МНС; циклоспорин А; стериоды, такие как гликокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон, дексаметазон и гидрокортизон; метотрексат (перорально или подкожно); гидроксихлороквин; сульфасалазин; лефлуномид; антагонисты цитокина или рецептора цитокина, включая антитела против интерферона-γ, -β или -α, антитела против фактора некроза опухоли-α (инфликсимаб или адалимумаб), антитела против иммуноагезина TNFα (этанерцепт), против фактора некроза опухоли-β, антитела против интерлейкина-2 и антитела против рецептора IL-2; антитела против LFA-1, включая антитела против CD11a и СD18; антитела против L3Т4; гетерологичный противолимфоцитарный глобулин; антитела pan-T, предпочтительно антитела против CD3 или против CD4/CD4a; растворимые пептиды, содержащие LFA-связывающий домен (WO 90/08187, опубликованная 7/26/90); стрептокиназу; TGF-β; стрептодорназу; РНК или ДНК хозяина; FK506; RS-61443; деоксиспергуалин; рапамицин; рецептор Т-клеток (Cohen et al., патент США 5114721); фрагменты рецептора Т-клеток (Offner et al. Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989) и WO 91/01133) и антитела против рецептора Т-клеток (ЕР 340109), такие как Т10В9.

Термин «цитотоксический агент», как он использован в данном описании, относится к веществу, которое ингибирует или препятствует функционированию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Предполагается, что термин включает в себя радиоактивные изотопы (например, At²¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как токсины, имеющие небольшие молекулы, или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, или их фрагменты.

«Химиотерапевтический агент» представляет собой химическое соединение, используемое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN^TM); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилилмеламин; азотные горчичные соединения, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамиид, эстрамустин, ифосфаммид, мехлоретаммин, мехлоретамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил мастард; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азазерин, блеомиины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, кармминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как акцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; анти-адреналины, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; подкрепляющая добавка к фолиевой кислоте, такая как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамиид гилкозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфонитин; эллиптиниум ацетат; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогеманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозил ('Ara-C”); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Bristol Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11ж ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленного выше. Также в это определение включены антигормональные агенты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормона на опухолях, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ароматаза-ингибирующие 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксиефн, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленного выше.

Термин «цитокин» представляет собой обобщенный термин для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку в качестве внутриклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. К цитокинам относятся гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека и бычий гормон роста; паратироидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тироидный стимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); гепатитный фактор роста; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор-α и -β некроза опухоли; маллериан-ингибирующее вещество; мышиный гонадотропин-связанный пептид; ингибин; активин; сосудистый эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как NGF-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGFs), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста I и II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSFs), такие как макрофаг-CSF (M-CSF); гранулоцит-макрофаг CSF (GM-CSF); и гранулоцит-CSF (G-CSF); интерлейкины (ILs), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некроза опухоли, такой как TNF-α и TNF-β; и другие полипептидные факторы, включая LIF и комплектный лиганд (KL). Как использовано в данном описании, термин «цитокин» включает в себя белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты природных последовательностей цитокинов.

Термин «пролекарство», как он использован в настоящей заявке», относится к предшествующей форме или к форме, представляющей собой производное фармацевтически активного вещества, которая является менее цитотоксичной по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с исходным лекарственным средством и способна ферментативно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. См., например, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615^th Meeing Belfast (1986) и Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to targeted Drug Delivery” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana press (1985). Пролекарства по данному изобретению включают, но не ограничиваются указанным, фосфат-содержащие пролекарства, тиофосфат-содержащие пролекарства, сульфат-содержащие пролекарства, пептид-содержащие пролекарства, модифицированные D-аминокислотами пролекарства, гликозилированные пролекарства, β-лактам-содержащие пролекарства, необязательно замещенный феноксиацетамид-содержащие пролекарства или необязательно замещенный фенилацетамид-содержащие пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть преобразованы в более активные цитотоксичные свободные лекарственные средства. Примеры цитотоксических лекарственных средств, на основе которых могут быть получены пролекарственные формы для применения в данном изобретении, включают в себя, но не ограничиваются указанным, описанные выше химиотерапевтические агенты.

Термин «чужеродный антиген» означает молекулу или молекулы, которые не являются эндогенными или присущими млекопитающему, на которого они оказывают действие. Чужеродный антиген может вызывать иммунный ответ, например, гуморальный и/или опосредованный Т-клетками ответ у млекопитающих. Обычно, чужеродный антиген будет приводить к продуцированию антител, направленных против него. Примеры чужеродных антигенов, рассматриваемых в данном описании, включают иммуногенные терапевтические агенты, например, белки, такие как антитела, в особенности антитела, включающие в себя аминокислотные остатки, не относящиеся к человеку (например, родент, химерный/гуманизованный и приматизированные антитела); токсины (необязательно конъюгированные с нацеливающей молекулой, такой как антитело, где нацеливающая молекула также может быть иммуногенной); вирусные векторы для генной терапии, такие как ретровирусы и аденовирусы; трансплантаты; инфекционные агенты (например, бактерии и вирус); аллоантигены (т.е. антиген, который существует в некоторых, но не в других членах одного вида), такие как различающиеся по типу крови, антигены лимфоцитов человека (HLA), антигены тромбоцитов, антигены, экспрессированные на трансплантированных органах, компоненты крови, беременность (Rh) и гемофилические факторы (например, фактор VIII и фактор IX).

Выражение «блокирование иммунного ответа» в отношении чужеродного антигена означает уменьшение или предотвращение по крайней мере одной иммунно-опосредованной ответной реакции, возникающий из-за действия чужеродного антигена. Например, можно ослабить гуморальный ответ на чужеродный антиген, т.е. путем предотвращения или уменьшения продуцирования антител, направленных против антигена у млекопитающих. Альтернативно, или дополнительно, можно подавлять идиотип; «подавлять» удаление клеток, покрытых аллоантителом и/или воздействовать на представление аллоантигена путем истощения антиген-представляющих клеток.

Термин «трансплантат», как он использован в данном описании, относится к биологическому материалу, полученному от донора для трансплантации реципиенту. Трансплантаты включают такие разнообразные материалы как, например, выделенные клетки, такие как инсулярные клетки; ткани, такие как амниотическая мембрана новорожденного, костный мозг, гематопоэтические клетки-предшественники и глазная ткань, такая как ткань роговицы и органы, такие как кожа, сердце, печень, селезенка, поджелудочная железа, щитовидная доля, легкое, почка, трубчатые органы (например, кишечник, кровеносные сосуды или пищевод) и т.д. Трубчатые органы могут использоваться для замены поврежденной части пищевода, кровеносных сосудов или желчного протока. Трансплантаты кожи можно использовать не только в случае ожогов, но также в качестве перевязочного материала для поврежденного кишечника или близких повреждений определенного рода, таких как грыжа диафрагмы. Трансплантат получают из любого источника, имеющего отношения к млекопитающим, включая человека, или из трупа, или от живых доноров. Предпочтительно трансплантат представляет собой костный мозг или орган, такой как сердце, и донор трансплантата и хозяин являются подходящими для антигенов HLA класса II.

Термин «хозяин-млекопитающее», как он использован в данном описании, относится к любому совместимому реципиенту трансплантата. Под термином «совместимый» подразумевается хозяин, у которого трансплантат донора не будет вызывать отторжения. Предпочтительно хозяин представляет собой человека. Если как донор трансплантата, так и хозяин являются людьми, они предпочтительно являются подходящими для антигенов HLA класса II, так чтобы улучшить гистологическую совместимость.

Термин «донор», как он использован в данном описании, относится к видам млекопитающих, мертвым или живым, от которых получают трансплантат. Предпочтительно донор представляет собой человека. Люди-доноры предпочтительно являются добровольными соотносимыми по крови донорами, которые являются умственно и физически здоровыми при физическом обследовании и имеют одну и ту же основную группу крови АВО, поскольку скрещивание границ основных групп крови возможно ставит под сомнение выживание аллотрансплантата. Однако допустима, например, пересадка почки донора типа О реципиенту А, В или АВ.

Термин «трансплантировать» и его варианты в данном описании относятся в внедрению трансплантата в организм хозяина, когда трансплантация является сингенной (где донор и реципиент являются генетически идентичными), аллогенной (когда донор и реципиент имеют разное генетическое происхождение, но относятся к одному и тому же виду) или ксеногенной (когда донор и реципиент относятся к разным видам). Таким образом, в типичном сценарии, хозяин представляет собой человека, и трансплантат является изотрансплантатом, полученным от человека одного и того же, или другого генетического происхождения. В другом сценарии, трансплантат получают от видов, отличающихся от того, в который его трансплантируют, как, например, сердце бабуина трансплантировано реципиенту человеку-хозяину, и включая животных от филогенетически широко отделенных видов, например, клапан сердца свиньи или бета-инсулярные клетки или нейронные клетки животного трансплантируют человеку-хозяину.

Под термином «генная терапия» подразумевается общий подход введения нуклеиновой кислоты млекопитающему, подвергаемому лечению. Нуклеиновая кислота может кодировать представляющий интерес полипептид или может быть антисмысловой нуклеиновой кислотой. Один или несколько компонентов вектора или композиции генной терапии может быть иммуногенным в отношении млекопитающего, подвергаемого лечению. Например, вирусные векторы (такие как аденовирус, вирус простого герпеса I или ретровирус); липиды и/или нацеливающие молекулы в композиции могут индуцировать иммунный ответ у млекопитающего, подвергаемого лечению.

Выражение «десенсибилизация млекопитающего, ожидающего трансплантации», относится к снижению или аннулированию чувствительности или реактивности в отношении трансплантата перед введением трансплантата млекопитающему. Это может достигаться посредством любого механизма, такого как, например, уменьшение антител против донора у десенсибилизируемого млекопитающего, например, когда такие антитела против донора направлены против антигена лимфоцитов человека (HLA).

Термин «нейтрализующие антитела» в данном описании относится к антителам, которые не только связываются с представляющим интерес антигеном (например, терапевтическим антителом, таким как антитело против CD20), но дополнительно ингибируют до определенной степени биологическую активность такого антигена.

II. Анализ нейтрализующих антител

Данное изобретение относится, по крайней мере частично, к анализу для обнаружения нейтрализующих антитело в отношении терапевтического антитела или к антагонисту, который связывается с В-клеточным поверхностным клеточным маркером (например, к антителу, которое связывается с CD20). Данный анализ определяет способность биологического образца, полученного от пациента, подвергнутого лечению антителом или антагонистом, блокировать биологическую активность антитела или антагониста. Блокированная активность может служить указанием на пониженную эффективность антитела или антагониста.

Образец предпочтительно получают от пациента перед и/или после лечения антителом и/или антагонистом. Обычно биологические образцы получают от пациента в виде серии для определенных временных точек, например, начиная от момента до лечения и во время цикла(ов) лечения. Для того чтобы исключить вмешательство лекарственного средства на качество анализа, образец обычно получают в тот момент, когда происходит вымывание лекарственного средства. Например, может быть исследован образец, полученный в основной период (базисная линия) и через 3, 6 и 9 месяцев. Если пациента позднее повторно подвергают лечению, образец, полученный в основной период (базисная линия) и через 3 или 6 месяцев, может быть протестирован в отношении нейтрализующего антитела.

Биологический образец может включать в себя антитела, которые связывают антитело или антагонист, с использованием которого пациента подвергали лечению, такие как антитело человека против мыши (НАМА), антихимерное антитело человека (НАСА) или антитело человека против человека (НАНА). НАНА может быть направлено против гуманизованного или терапевтического антитела человека. В одном варианте воплощения образец является таким, для которого было определено, что он содержит данные антитела. Например, с помощью анализа ELISA может быть установлено, что сыворотка крови, полученной от пациента, содержит антитела против рассматриваемого лекарственного средства, как в примере 1 ниже или в патентной заявке США № 2003/0068664 (Albitar et al.).

Используемый в анализе биологический образец может представлять собой сыворотку крови, плазму крови, клеточный лизат, молоко, слюну или другие выделения, а также антитела, выделенные из любого одного или нескольких таких биологических образцов. Предпочтительно в данном изобретении анализируют сыворотку крови, полученной от пациента.

Нейтрализующие антитела могут снижать ожидаемый фармакологический уровень поступающего посредством инфузии лекарственного средства, таким образом понижая эффективность или делая вероятность ответной реакции более переменной. Нейтрализующие антитела могут быть связаны с заболеванием сыворотки крови или болезнью иммунной системы при повторном лечении. В качестве примера, когда наблюдается ответ нейтрализующего антитела, лечение может быть приостановлено или отложено, или может быть повышена дозировка, или пациенту можно дополнительно давать агенты, которые улучшают эффективность антитела или антагониста и/или снижают любой иммунный ответ в их отношении. Известны различные иммунодепрессивные агенты, которые можно комбинировать с лечением для снижения иммунного ответа, когда наблюдается ответная реакция нейтрализующего антитела, и иллюстративные примеры таких лекарственных средств специально приведены в данном описании.

В дополнение к использованию лечащими врачами результатов анализа при лечении пациентов, нейтрализующие свойства антител против лекарственных средств в сочетании с НАМА, НАСА или НАНА данными демонстрируют иммунногенность или тенденцию к иммуногенности, а также природу иммуногенности антитела или антагониста. Данная информация полезна при оценке безопасности лекарственного средства и предсказании потенциальных иммунных ответных реакций пациентов на лечение.

Настоящий анализ имеет преимущество перед анализом ELISA, описанным в заявке США № 2003/0068664 (Albitar et al.), поскольку он дает возможность оценить, будет или не будет ответная реакция антител на рассматриваемое лекарственное средство действительно нейтрализовать (по крайней мере, в определенной степени) биологическую активность лекарственного средства, в том случае если лекарственное средство будет представлять собой антитело или антагонист В-клеточного поверхностного маркера. Таким образом, данную информацию можно использовать для определения эффективности антитела или антагониста для лечения пациента. В контексте антитела против CD20 или другого антагониста, который связывает В-клеточный поверхностный маркер, предполагается, что данный анализ будет особенно полезен, когда лечение ими будет приводить только к частичному уменьшению числа В-клеток, в тех случаях, когда происходит гиперактивация В-клеток (например, как в случае системной красной волчанки (SLE)), или когда постоянные симптомы заболевания существуют на протяжении многих лет (например, как в случае системной красной волчанки (SLE) или ревматоидного артрита (RA)).

Применение анализа является особенно желательным в отношении пациентов, которых подвергают лечению с использованием антитела или антагониста с целью лечения аутоиммунного заболевания. В данном описании указаны различные аутоиммунные заболевания, но иллюстративные примеры включают в себя ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), болезнь Вегенера, воспалительное заболевание кишечника, идиопатическую или иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромбоцитопенический акроангиотромбоз (ТТР), аутоиммунную тромбоцитопению, рассеянный склероз (MS), псориаз, IgA нефропатию, IgM полиневропатию, миастению гравис, васкулит, сахарный диабет, синдром Рейно, синдром Шегрена, гломерулонефрит, аутоиммунную гемолитическую анемию и др.

Когда антагонист или антитело связывается с В-клеточным поверхностным маркером, таким как антиген CD20, у пациента может наблюдаться аутоиммунное заболевание, В-клеточное злокачественное заболевание, или антагонист или антитело можно использовать для блокирования иммунного ответа на чужеродный антиген (например, когда чужеродный антиген представляет собой иммуногенный терапевтический агент или трансплантат).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения анализ биологической активности включает функциональный анализ на основе клеток, такой как анализ, определяющий комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), апоптоз или ингибирование роста клеток.

Предпочтительно в анализе исследуется CDC активность. В соответствии с данным вариантом осуществления изобретения клетки, экспрессирующие антиген (например, В-клеточный поверхностный маркер, такой как CD20), с которым связывается антитело или антагонист, могут быть подвергнуты воздействию комплемента (предпочтительно комплемента человека) в присутствии (или в отсутствие) антитела или антагониста, а также биологического образца, полученного от пациента, подвергаемого лечению с использованием антитела или антагониста. В настоящей заявке рассматривается подвергание воздействию четырех компонентов (клетки, комплемент, антитело или антагонист и биологический образец) одновременно или последовательно в любом порядке; все данные возможности охватываются выражением «подвергание клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается терапевтическое антитело, воздействию комплемента в присутствии терапевтического антитела и биологического образца, полученного от пациента, подвергаемого лечению с использованием данного антитела». Однако в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения биологический образец (например, сыворотку крови) объединяют с антителом или антагонистом таким образом, чтобы дать возможность нейтрализовать активность антитела или антагониста, а затем клетки и комплемент добавляют к данной смеси.

После стадии воздействия определяют CDC активность, предпочтительно путем оценки жизнеспособности клеток (например, определяя количество живых клеток). Для определения жизнеспособности клеток доступны различные способы, включая определение потери целостности мембраны, оцениваемое по поглощению иодида пропидия (PI), триптана синего (см. Moore et el. Cytotechnology 17:1-11 (1995)), аннексина V или 7AAD относительно необработанных клеток, анализ AlamarBlue^TM, приведенный в данном описании и т.д. Снижение способности антитела или антагониста опосредовать CDC может указывать на присутствие нейтрализующих антител в биологическом образце.

Для анализа на основе клеток обычно используют клеточную линию, которая экспрессирует антиген, с которым связывается антитело или антагонист. В случае антигена CD20 доступны различные клетки, включая клетки WIL2-S (ATCC CRL 8885, американская коллекция типовых культур) или лимфобластоидная В-клеточная линия, экспрессирующая CD20. CDC анализы с использованием CD20-положительных клеток были описаны в публикациях Idusogie et al., J.Immunol. 164: 4178-4184 (2000); Idusogie et al., J.Immunol. 166: 2571-2575 (2001); Reff et al., Blood 8392): 435-445 (1994); патент США № 6194551 В1 (Idusogie et al.) и патент США № 5736137 (Anderson et al.).

Когда анализ оценивает ADCC, антитело или антагонист можно анализировать на его способность опосредовать природную клетку-киллера (клетка NK) и/или мононуклеарную клетку периферической крови (РВМС) в лизисе клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается терапевтическое антитело. В случае антигена CD20 можно использовать клетки WIL2-S, и в публикациях Shields et al., J.Biol.Chem. 276: 6591-6604 (2001) и WO 00/42072 (Presta, L.) описан иллюстративный ADCC анализ с использованием данных клеток. См. также Clynes et al., Nature Medicine 6: 443-6 (2000). В патенте США № 5736137 (Anderson et al.) также описан ADCC анализ с использованием CD20-положительных клеток.

Апоптоз относится к программируемой смерти клетки, например, В-клетки, и может быть определен с помощью различных анализов, таких как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, усыхание клеток, расширение эндоплазматической сети, фрагментация клетки и/или образование мембранных везикул (называемых апоптозными телами). Анализ, в котором определяют способность антитела (например, ритуксимаба) индуцировать апоптоз, описан, например, Shan et al. Cancer Immunol. Immunther 48: 673-83 (2000); Pedersen et al., Blood 99: 1314-9 (2002); Demindem et al., Cancer Chemotherapy & Radiophamaceuticals 12(3): 177-186 (1997).

Способность антагониста или антитела ингибировать рост клетки, например, раковой В-клетки, экспрессирующей антиген, с которым связывается антагонист или антитело, может быть оценена с использованием ряда различных методов анализа. В публикации Taji et al., Jpn J.Cancer Res. 89: 748-56 (1996) описано, каким образом определяют ингибирование роста CD20-положительных В-клеточных линий лимфомы с использованием антитела против CD20.

С использованием описанного здесь анализа нейтрализующих антител путем измерения способности биологического образца, полученного от пациента, повергаемого лечению с использованием антитела или антагониста, можно определить эффективность антитела или антагониста (например, такого, который связывает CD20) блокировать активность антитела или антагониста, где снижение биологической активности относительно контрольного образца является указанием на то, что у пациента повышаются антитела против рассматриваемого антитела или антагониста, и/или что такие антитела могут нейтрализовать, по крайней мере до определенной степени биологическую активность антитела или антагониста. Существенная ответная реакция может быть такой, которая приведет к проблеме безопасности, возникающей из-за развития нейтрализующего антитела, и/или необходимости изменить дозировку первичного лекарственного средства в ответ на измененное выведение лекарственного средства. Например, по сравнению с тем же количеством предварительно обработанного аналогичного образца (например, НАМА, НАСА и НАНА отрицательные), образец, нейтрализующий примерно на 20% или больше активность лекарственного средства антитела или антагониста (например, в диапазоне примерно от 20% до примерно 100%) при данной концентрации, может рассматриваться как положительный в отношении нейтрализующего антитела, направленного против антитела или антагониста.

III. Продуцирование антагонистов или антител

Способы настоящего изобретения используют или включают в себя антагонист, который связывается с В-клеточным поверхностным маркером или терапевтическим антителом. Соответственно, здесь будут описаны способы генерирования таких антагонистов или антител.

Антиген, применяемый для продуцирования или отбора антагониста, или антитела может представлять собой, например, растворимую форму антигена или его часть, содержащую желаемый эпитоп. Альтернативно или дополнительно, клетки, экспрессирующие антиген на своей клеточной поверхности, можно использовать для генерирования или поиска антагониста или антитела. Другие формы антигена, используемые для генерирования антагониста или антитела, будут очевидны для специалистов в данной области. Предпочтительно, антиген представляет собой В-клеточный поверхностный маркер, такой как антиген CD20.

Хотя предпочтительным антагонистом является антитело, антагонисты, отличающиеся от антител, подразумеваются в данном описании. Например, антагонист может включать антагонист, имеющий небольшую молекулу, необязательно слитую или конъюгированную с цитотоксическим агентом (таким, как указанные в данном описании). Может быть проведен скрининг библиотек небольших молекул против представляющего интерес В-клеточного поверхностного маркера для установления небольшой молекулы, которая связывается с таким антигеном. Дополнительно может быть проведен скрининг небольших молекул на их антагонистические свойства и/или они могут быть конъюгированы с цитотоксическим агентом.

Антагонист также может представлять собой пептид, образованный с использованием разумного конструирования или путем фагового представления (см., например, WO 98/35036, опубликованную 13 августа 1998 г.). В одном варианте осуществления выбранная молекула может представлять собой «имитатор CDC» или аналог антитела, разработанный на основании CDRs антитела. Хотя такие пептиды сами по себе могут являться антагонистами, пептид необязательно может быть сконденсирован с цитотоксическим агентом, чтобы добавить или усилить антагонистические свойства пептида.

В другом варианте осуществления антагонист представляет собой иммуноадгезин, включающий в себя связывающую область, например, пептид или белок, который связывается с В-клеточным поверхностным маркером, таким как CD20, слитый с иммуноглобулином, например, областью Fc иммуноглобулина.

Далее приведено описание иллюстративных способов продуцирования антител-антагонистов, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

(i) Поликлональные антитела

Предпочтительно выработку поликлональных антител стимулируют у животных путем множества подкожных (sc) или внутриперитонеальных (ip) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгирование соответствующего антигена с белком, который является иммуногенным у иммунизируемых видов, например, гемоцианином ключевидного блюдечка, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или ингибитором трипсина сои с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, малеимидобензоильного сложного эфира сульфосукцинимида (конъюгирование через цистеиновые остатки), N-гидроксисукцинимида (через лизиновые остатки), глутаральдегида, сукцинового ангидрида, SOCl₂ или R¹N=C=NR, где R и R¹ представляют собой различные алкильные группы.

Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем объединения, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для крыс или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и введения раствора в виде инъекции внутрикожно во множество мест. Месяцем позднее животных повторно иммунизируют 1/5 - 1/10 первоначального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда посредством подкожной инъекции во множество мест. Через 7-14 дней у животных отбирают кровь и сыворотку крови анализируют на титр антитела. Животных повторно иммунизируют до тех пор, пока титр не выйдет на плато. Предпочтительно повторную иммунизацию проводят с использованием конъюгата того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или с помощью другого кросс-линкерного реагента. Конъюгаты также могут быть получены в рекомбинантной культуре клеток в качестве слитых белков. Также агрегирующие агенты, такие как квасцы, подходящим образом используют для усиления иммунного ответа.

(ii) Моноклональные антитела

Моноклональные антитела получают из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природно существующих мутаций, которые могут присутствовать в минимальных количествах. Таким образом модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, как не представляющего собой смесь дискретных антител.

Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного метода, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (патент США 4816567).

В гибридомном способе мышь, или другое подходящее животное-хозяина, иммунизируют, как описано выше для выработки лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Лимфоциты затем сливают с клетками миеломы с использованием подходящего конденсирующего агента, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: principles and Practice, pp. 59-103 (Academic press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых исходных клеток миеломы. Например, если исходные клетки миеломы не содержат фермента - гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ среда), где данные вещества предотвращают рост клеток с недостатком HGPRT.

Предпочтительными клетками миеломы являются те, которые сливаются эффективно, поддерживают продуцирование антитела на высоком уровне посредством выбранных антитело-продуцирующих клеток и являются чувствительными к среде, такой как среда НАТ. Среди них предпочтительными клеточными линиями миеломы являются миеломные линии мыши, такие как полученные от опухолей мыши МОРС-11 и МРС-11, доступные от Salk Institute Cell Distribution Center, Сан-Диего, Калифорния, США, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные от Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэрилэнд, США. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломные клеточные линии мыши-человека также были описаны как продуцирующие моноклональные антитела человека (Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984); Broder et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют по иммуноосаждению или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Аффинность связывания моноклонального антитела может быть определена, например, с использованием анализа Скатчарда (Scatchard), как описано в публикации Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы методами ограниченного разведения и роста с использованием стандартных способов (Goding, Monoclonal Antibodies: principles and Practice, pp. 59-103 (Academic press, 1986)). Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, среды DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены in vivo в виде асцитных опухолей у животных.

Моноклональные антитела, секретируемые подклонами, удобным образом отделяются от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки крови с использованием обычных способов очистки иммуноглобулина, таких как, например, протеин-А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, гелевый электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко выделяется и секвенируется с использованием обычных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридом служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфектируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи COS клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не продуцируют в других обстоятельствах иммуноглобулиновый белок, для осуществления синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al., Curr.Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) и Plackthun, Immunol. Revs., 130; 151-188 (1992).

В следующем варианте осуществления антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, генерированных с использованием способов, описанных в публикации McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J.Mol.Biol., 222: 581-597 (1991) описали выделение антител мыши и человека, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В последующих публикациях описано продуцирование антител человека с высокой аффинностью (нМ диапазон) с помощью перемещения цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), а также комбинаторное инфицирование и in vivo рекомбинация как стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc.Acids.Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, данные методики являются эффективными альтернативами традиционным гибридомным способам для выделения моноклональных антител.

ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены на кодирующие последовательности для постоянных областей тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США № 4816567; Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 81: 6851 (1984)) или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности для не-иммуноглобулинового полипептида.

Обычно, в таких не-иммуноглобулиновых полипептидах замещены постоянные области антитела или в них замещены различные области одного антиген-объединяющего сайта антитела для создания химерного двухвалентного антитела, включающего в себя один антиген-объединяющий сайт, обладающий специфичностью по отношению к антигену, и другой антиген-объединяющий сайт, обладающий специфичностью по отношению к другому антигену.

(iii) Гуманизованные антитела

Способы гуманизации антител, не являющихся человеческими, были описаны в данной области. Предпочтительно, гуманизованное антитело содержит один или несколько остатков аминокислот, введенных в него из источника, который не является человеком. Данные остатки аминокислот, не относящиеся к человеку, часто упоминаются как «импортированные» остатки, которые обычно берут из «импортной» вариабельной области. Гуманизация по существу может быть выполнена в соответствии со способом Winter с сотрудниками (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science , 239: 1534-1536 (1988)) путем замещения соответствующих последовательностей антитела человека на последовательности гипервариабельной области. Соответственно, такие «гуманизованные» антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), в которых по существу менее чем целая вариабельная область человека была заменена на соответствующую последовательность вида, не относящегося к человеку. На практике, гуманизованные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и возможно некоторые остатки FR заменены на остатки из аналогичных сайтов в антителах грызунов.

Выбор вариабельных областей человека, как легких, так и тяжелых, для использования при получении гуманизованных антител является очень важным для снижения антигенности. В соответствии с так называемым методом «лучшей подгонки», проводят скрининг последовательности вариабельной области антитела грызуна против целой библиотеки известных последовательностей вариабельных областей человека. Последовательность человека, которая является ближайшей к таковой грызуна, затем принимается как каркасная область гуманизованного антитела (Sims et al., J.Immunol., 151: 2296 (1993); Chotia et al., J.Mol.Biol., 186: 901 (1987)). В другом способе используют определенную каркасную область, полученную от консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Та же самая каркасная область может использоваться для нескольких различных гуманизованных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J.Immunol., 151: 2623 (1993)).

Кроме того, важно, что антитела являются гуманизованными с сохранением высокой аффинности в отношении антигена и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительным способом гуманизованные антитела получают процессом анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизованных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизованной последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина обычно являются доступными и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатов для последовательностей иммуноглобулина. Экспертиза данных отображений дает возможность анализа вероятной роли остатков в функционировании кандидата последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидата-иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким образом могут быть выбраны остатки FR и объединены от реципиентной и импортной последовательностей таким образом, что достигаются желаемые характеристики антитела, такие как повышенная аффинность в отношении антигена(ов)-мишени(ей). Обычно остатки гипервариабельной области непосредственно и наиболее значимо вовлечены во влияние на связывание антигена.

(iv) Человеческие антитела

В качестве альтернативы гуманизации, могут быть генерированы человеческие антитела. Например, в настоящее время можно получить трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации продуцировать полный набор человеческих антител в отсутствие эндогенного продуцирования иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготное деление гена объединения тяжелой цепи антитела (J_H) в химерной и зародышевой линии мутантных мышей приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос набора генов иммуноглобулина зародышевой линии человека в такие зародышевые линии мутантных мышей будет приводить к продуцированию антител человека при антигенном вызове. Cм., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993) и патенты США №№ 5591669, 5589369 и 5545807.

Альтернативно, для продуцирования антител человека и фрагментов антител in vitro можно использовать технологию фагового отображения (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) из набора генов вариабельной области (V) иммуноглобулина от иммунизованных доноров. В соответствии с данным способом, гены области V антитела клонируют в рамке считывания или в основной, или в минорный ген белка оболочки волокнистого бактериофага, такого как М13 или fd и отображают как функциональные фрагменты антител на поверхности фаговой частицы. Поскольку волокнистая частица содержит одноцепочечную копию ДНК генома фага, селекции на основе функциональных свойств антитела также приводят к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее данные свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговое отображение может быть осуществлено в разнообразных форматах, обзор в данной области см., например, Johnson, Kevin S., and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Несколько источников сегментов V-гена можно использовать для фагового отображения. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) выделили разнообразный набор анти-оксазолоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученных из селезенки иммунизованных мышей. Может быть сконструирован набор V-генов от иммунизованных людей доноров и антитела в отношении разнообразного набора антигенов (включая само-антигены) могут быть выделены по существу в соответствии со способами, описанными Marks et al., J.Mol.Biol. 222: 581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). См. также патенты США №№ 5565332 и 5573905.

Человеческие антитела также могут быть генерированы с помощью активированных in vitro В-клеток (см. патенты США 5567610 и 5229275).

(v) Фрагменты антител

Были разработаны различные способы продуцирования фрагментов антител. Традиционно данные фрагменты получали путем протеолитического расщепления целых антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Однако данные фрагменты в настоящее время можно продуцировать непосредственно с использованием рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител могут быть выделены из обсуждавшихся выше фаговых библиотек антител. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH могут быть непосредственно выделены из E/coli и химически связаны с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом фрагменты F(ab')₂ могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие способы продуцирования фрагментов антител будут очевидны практикующим специалистам. В других вариантах осуществления выбранное антитело представляет собой Fv фрагмент с единственной цепью (scFv). См. WO 93/16185; патент США № 5571894 и патент США № 5587458. Фрагмент антител также может представлять собой «линейное антитело», например, как описано в патенте США № 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

(vi) Биспецифические антитела

Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении по крайней мере двух различных эпитопов. Иллюстративные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами на В-клеточном поверхностном маркере. Другие подобные антитела могут связывать первый В-клеточный поверхностный маркер и дополнительно связывать второй В-клеточный поверхностный маркер. Альтернативно, связывающая «рука» против В-клеточного маркера может комбинироваться с «рукой», которая связывается с запускающей молекулой на лейкоците, таком как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD2 или CD3) или рецепторами Fc отношении IgG (FCγR), таким как FCγRI (CD64), FCγRII (CD32) и FCγRIII (CD16) таким образом, чтобы сфокусировать клеточные защитные механизмы на В-клетке. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов на В-клетках. Данные антитела обладают связывающей В-клеточный маркер рукой и рукой, которая связывает цитотоксический агент (например, сапорин, анти-интерферон-α, алкалоид винка, цепь А рицина, метотрексат или гаптен с радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела могут быть получены в виде антител полной длины или фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab')₂).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное продуцирование биспецифических антител полной длины основано на со-экспрессии двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, где две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Благодаря случайному ассортименту тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, данные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь 10 различных молекул антител, среди которых только одна обладает корректной биспецифической структурой. Очистка корректной молекулы, которую обычно проводят с помощью стадий аффинной хроматографии, достаточно обременительна, и продукт получают с низкими выходами. Подобные способы описаны в WO 93/08829 и в публикации Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

В соответствии с другим подходом, вариабельные области антитела с желаемыми специфичностями связывания (антитело-антиген объединяющие сайты) сливают с последовательностями постоянной области иммуноглобулина. Сливание предпочтительно проводят с постоянной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, включая, по крайней мере часть шарнирных, СН2 и СН3 областей. Является предпочтительным иметь первую постоянную область тяжелой цепи (СН1), содержащую сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующую по крайней мере в одном из сливаний. ДНК, кодирующие сливания тяжелой цепи иммуноглобулина и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, вводят в отдельные векторы экспрессии и со-трансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в регулировании совместной пропорции трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, где используются неэквивалентные соотношения трех полипептидных цепей в конструкции, обеспечивая оптимальные выходы. Однако возможно вставлять кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, когда экспрессия по крайней мере двух полипептидных цепей в равном соотношении приводит к высоким выходам, или когда соотношения не являются особенно значимыми.

В предпочтительном варианте осуществления данного подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одной руке и гибридной паре тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающая вторую специфичность связывания) во второй руке. Было установлено, что такая асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинацией иммуноглобулиновых цепей, поскольку наличие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий способ выделения. Данный подход описан в WO 94/04690. Дополнительные подробности образования биспецифических антител смотри, например, в Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). В соответствии с другим подходом, описанным в патенте США № 5731168, поверхность раздела между парой молекул антитела может быть сконструирована для увеличения до максимума процента гетеродимеров, которые выделяют из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела включает в себя по крайней мере часть С_Н3 домена постоянной области антитела. В данном способе одну или несколько небольших цепей аминокислот из поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют на большие боковые цепи (например, тирозин или триптофан). На поверхности раздела второй молекулы антитела создаются компенсаторные «полости» идентичного или подобного размера для большой боковой цепи(ей) путем замены больших цепей аминокислот на меньшие (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по сравнению с нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают сшитые или «гетероконъюгированные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с адивином, другое - с биотином. Такие тела были, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Гетероконъюгированные антитела могут быть получены с использованием любого удобного способа связывания. Подходящие кросс-линкерные агенты хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980, наряду с рядом методов связывания.

Способы генерирования биспецифических антител из фрагментов антител также были описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химических связей. Brennan et al., Science, 229:81 (1985); Shalaby et al., J.Exp. Med., 175: 217-225 (1992).

Также были описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела были получены с использованием лейциновых «зипперов» Kostelny et al., J.Immunol., 148(5) 154-1553 (1992). Лейциновые «застегивающие» пептиды из белков Fos и Jun были связаны с частями Fab' двух различных антител с помощью слияния генов. Гомодимеры антител были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окислены с образованием гетеродимеров антител. Данный способ также может быть использован для продуцирования гомодимеров антител. Технология «диатела», описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), обеспечила альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты включают вариабельную область тяжелой цепи (V_H), связанную с вариабельной областью легкой цепи (V_L) c помощью линкера, который является слишком коротким. Чтобы дать возможность спаривания между двумя доменами одной и той же цепи, соответственно, области V_H и V_L одного фрагмента вынуждены образовывать пару с комплементарными областями V_H и V_L другого фрагмента, образуя таким образом два антиген-связывающих сайта. Также сообщалось о другой стратегии получения фрагментов биспецифических антител с использованием одноцепочечных Fv (sFv) димеров. См., Gruber et al., J.Immunol., 152: 5368 (1994).

Рассматриваются антитела, имеющие более чем две валентности. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al., J.Immunol., 147: 60 (1991). Антитела с тремя или более сайтами связывания антигена описаны в WO 01/77342 (Miller and Presta), специально включенной в настоящее описание путем ссылки.

IV. Конъюгаты и другие модификации антагониста или антитела

Антагонист или антитело, использованные в способах или включенные в изделия, получаемые в данном изобретении, необязательно конъюгируют с цитотоксическим агентом.

Химиотерапевтические агенты, используемые для образования таких конъюгатов антагонист- или антитело-цитотоксический агент, были описаны выше в данном изобретении.

Конъюгаты антагониста или антитела и одного или нескольких токсинов, имеющих небольшие молекулы, таких как калихеамицин, майтанзин (патент США 5208020), трихотен и СС1065, также рассматриваются в данном описании. В одном варианте осуществления изобретения антагонист или антитело конъюгируют с одной или несколькими молекулами майтанзина (например, примерно от 1 до примерно 10 молекул майтанзина на молекулу антагониста или антитела). Майтанзин, например, может быть преобразован в May-SS-Me, который может быть восстановлен до May-SH3 и подвергнут взаимодействию с модифицированным антагонистом или антителом (Chari et al., Сancer Research 52: 127-131 (1992)) с образованием конъюгата майтанзиноил-антагонист или -антитело.

Альтернативно, антагонист или антитело конъюгируют с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Калихеамициновое семейство антибиотиков способно осуществлять расщепления двойных спиралей ДНК в суб-пикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются указанным, γ₁ ¹, α₂ ¹, α₃ ¹, N-ацетил-γ₁ ¹, PSAG и θ₁ ¹ (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993) и Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

Настоящее изобретение, кроме того, охватывает антагонист или антитело, конъюгированное с соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или эндонуклеазой ДНК в качестве деоксирибонуклеазы; DNase).

Множество радиоактивных изотопов доступно для получения изотопно меченых антагонистов или антител. Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu.

Конъюгаты антагониста или антитела и цитотоксичного агента могут быть получены с использованием множества бифункциональных агентов для связывания белков, таких как N-cукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бисазидо соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(п-диазонийбензоил)этилендиамин, диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рицин-иммунотоксин может быть получен, как опиcано Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Углерод-14-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративный хелатирующий агент для конъюгирования радионуклеотида к антагонисту или антителу. См. WO 94/11026. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать лабильный к кислотам линкер, пептидаза-чувствительный линкер, диметильный линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)).

Альтернативно, может быть получен слитый белок, включающий в себя антагонист или антитело и цитотоксический агент, например, с помощью рекомбинантных технологий или пептидного синтеза.

Антагонисты или антитела согласно изобретению также могут быть конъюгированы с активирующим пролекарство ферментом, который преобразует пролекарство (например, пептидил-химитерапевтический агент, см. WO 81/01145) в активное противораковое лекарственное средство. См., например, WO 88/07378 и патент США 4975278.

Ферментативный компонент таких конъюгатов включает в себя любой фермент, способный воздействовать на пролекарство таким образом, чтобы превращать его в более активную цитотоксическую форму.

Ферменты, которые можно использовать в способе согласно изобретению, включают в себя, но не ограничиваются указанным, щелочную фосфатазу, используемую для преобразования фосфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, используемую для преобразования сульфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндеаминазу, используемую для преобразования нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, 5-фторурацил; протеазы, такие как серратиапротеаза, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые полезны для преобразования пептид-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, используемые для преобразования пролекарств, которые содержат D-аминокислотный заместитель; углевод-расщепляющие ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, используемые для преобразования гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, используемая для преобразования лекарственных средств, функционализированных β-лактамами в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин V-амидаза или пенициллин G-амидаза, используемые для преобразования лекарственных средств, производные которых были получены функционализацией в них аминного азота с использованием феноксиацетильной или фенилацетильной групп, соответствнно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно, антитела с ферментативной активностью, также известные в данной области как «абзимы», можно использовать для преобразования пролекарств по данному изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Конъюгаты антагонист- или антитело-абзим могут быть получены, как описано в данном описании, для доставки абзима к популяции опухолевых клеток.

Ферменты по данному изобретению могут быть ковалентно связаны с антагонистом или антителом с использованием способов, хорошо известных в данной области, как например, с применением обсуждавшихся выше гетеробифункциональных кросс-линкерных реагентов. Альтернативно, слитые белки, включающие в себя по крайней мере антиген-связывающую область антитела, связанную по крайней мере с функционально активной частью фермента по изобретению, могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных ДНК методов, хорошо известных в данной области (см., например, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)).

Другие модификации антагониста или антитела подразумеваются в данном изобретении. Например, антагонист или антитело могут быть связаны с одним из множества непротеиноподобных полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

Описанные здесь антагонисты или антитела также могут быть введены в состав липосом. Липосомы, содержащие антагонист или антитело, получают способами, известными в данной области, такими, как описанные в Epstein et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 77: 4030 (1980); патенты США №№ 4485045 и 4544545 и WO 97/38731, опубликованная 23 октября 1997 г. Липосомы с повышенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556.

Особенно полезные липосомы могут быть получены методом упаривания с обращенной фазой с использованием липидной композиции, включающей в себя фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-функционализированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ). Липосомы экструдируют через фильеры с определенным размером пор, получая липосомы желаемого диаметра. Фрагменты Fab' антитела могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в публикации Martin et al., J.Biol.Chem., 257: 286-288 (1992) посредством дисульфидной реакции обмена. Химиотерапевтический агент необязательно заключен внутрь липосом. См., Gabizon et al., J.National Cancer Inst., 81(19), 1484 (1989).

В данном изобретении предполагается модификация(и) последовательности аминокислот белка или пептида в описанных здесь антагонистах или антителах. Например, может оказаться желательным улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антагониста или антитела. Варианты последовательности аминокислот антагониста или антитела получают путем введения подходящих изменений нуклеотидов в нуклеиновой кислоте антагониста или антитела или с использованием пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замещения остатков в последовательностях аминокислот антагониста или антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замещения осуществляется для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желательными характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы антагониста или антитела, такие как изменение числа или положения сайтов гликозилирования.

Полезный способ идентификации определенных остатков или областей антагониста или антитела, которые являются предпочтительными месторасположениями для мутагенеза, называется «аланин-сканирующий мутагенез», как описано Cunningham and Wells, Science, 244; 1081-1085 (1989). В данном случае идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют их нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для того, чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот с антигеном. Те расположения аминокислот, которые демонстрируют функциональную чувствительность к замещениям, затем детализируют путем введения дополнительных или других вариантов в или для сайтов замещения. Таким образом, хотя сайт для введения вариации последовательности аминокислоты является предварительно определенным, саму по себе природу мутации не требуется предварительно определять. Например, для анализа осуществления мутации в данном сайте, проводят аланин-сканирование или случайный мутагенез в кодоне-мишени или области-мишени, и проводят скрининг экспрессируемых вариантов антагониста или антитела в отношении желаемой активности.

Вставки аминокислот включают сливания по амино- и/или карбоксильным концевым группам, колеблющиеся по своей длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или множества остатков аминокислот внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антагонист или антитело с N-концевым метионильным остатком или антагонист, слитый с цитотоксичным полипептидом. Другие варианты молекулы антагониста или антитела, содержащей вставки, включают сливание по N- или С-концам антагониста или антитела с ферментом или полипептидом, который увеличивает период продолжительности существования антагониста или антитела в сыворотке крови.

Другой тип варианта представляет собой вариант с замещением аминокислот. В данном варианте по крайней мере один остаток аминокислоты в молекуле антагониста или антитела заменен на другой остаток. Сайты, представляющие наибольший интерес для замещающего мутагенеза антагонистов антител, включают гипервариабельные области, но также подразумеваются изменения в области FR. Консервативные замещения показаны в таблице под заголовком «предпочтительные замещения». Если такие замещения приводят к изменению биологической активности, то можно ввести большее число существенных изменений, обозначенных в таблице как «иллюстративные замещения», или последующих замещений, описанных ниже со ссылкой на классы аминокислот, и провести скрининг продуктов.

  Первоначальный остаток Иллюстративные замещения Предпочтительные замещения Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp; lys; arg gln Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine leu Leu (L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu

Существенные модификации в биологических свойствах антагониста или антитела осуществляют путем выбора замещений, которые существенно отличаются по своему действию на поддержание (а) структуры цепи полипептида в области замещения, например, в виде пластинчатой или спиральной конформации, (b) заряд или гидрофобность молекулы в целевом сайте или (с) объем боковой цепи. Природно существующие остатки разделены на группы на основании обычных свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;

(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;

(3) кислотные: asp, glu;

(4) основные: asn, gln, his, lys, arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly, pro и

(6) ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замещения будут вызывать изменение члена одного из данных классов на другой класс.

Любой цистеиновый остаток, не включенный в поддержание правильной конформации антагониста или антитела, также может быть заменен, обычно на серин, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения сшивания, отклоняющегося от нормы. Наоборот, цистеиновая(ые) связь(и) может быть добавлена к антагонисту или антителу для улучшения его стабильности (особенно, когда антагонист представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv).

Особенно предпочтительный вариант замещения включает в себя замещение одного или нескольких остатков гипервариабельных областей исходного антитела. Обычно, конечный вариант(ы), выбранный для дальнейшего развития, будет обладать улучшенными биологическими свойствами относительно исходного антитела, из которого он был образован. Удобным способом образования таких вариантов замещения является аффинное развитие с использованием фагового отображения. Кратко, проводят мутацию нескольких сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) для генерирования всех возможных аминозамещений в каждом сайте. Образованные таким образом варианты антитела отображают одновалентным образом из частиц волокнистых фагов в виде слияний с продуктом M13- гена III, упакованным в каждой частице. Затем проводят скрининг отображенных фагами вариантов в отношении их биологической активности (например, связывающей активности), как раскрывается в данном описании. Для идентификации возможных сайтов гипервариабельной области для модификации может быть проведен аланин-сканирующий мутагенез для идентификации остатков гипервариабельной области, вносящих существенный вклад в связывание антигена. Альтернативно или дополнительно может оказаться выигрышным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами для замещения в соответствии с разработанными здесь способами. После образования таких вариантов набор вариантов подвергают скринингу, как указано в данном описании, и антитела, обладающие превосходящими свойствами по данным одного или нескольких значимых анализов, могут быть отобраны для дальнейшей разработки.

Другой тип варианта аминокислот антагониста или антитела изменяет первоначальную схему гликозилирования антагониста или антитела. Под изменением подразумевается удаление одного или нескольких углеводных остатков, выявленных в антагонисте или антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в антагонисте или антителе.

Гликозилирование полипептидов обычно осуществляется или как N-связанное, или как О-связанное. N-Связанное гликозилирование относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой распознающие последовательности для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-Связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Присоединение сайтов гликозилирования к антагонисту или антителу обычно осуществляют путем изменения последовательности аминокислот таким образом, чтобы она содержала одну или несколько из вышеуказанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть выполнено путем добавления или замещения с использованием одного или нескольких из остатков серина или треонина к последовательности первоначального антагониста или антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).

Антитела с измененной Fc областью гликозилирования описаны в WO 02/079255 (Reff and Davies) и WO 03/035835 (Presta), специально включенных в данное описание путем ссылки.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты последовательности аминокислот антагониста или антитела, получают с использованием множества способов, известных в данной области. Данные способы включают, но не ограничиваются указанным, выделение из природного источника (в случае существующих в природе вариантов последовательности аминокислот) или получение с использованием олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР мутагенеза и кассетного мутагененза ранее полученного варианта или не-вариантной версии антагониста или антитела.

Может оказаться желательным модифицировать антагонист или антитело по изобретению в отношении эффекторной функции, например, так, чтобы усилить антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) антагониста или антитела. Этого можно достичь путем введения одного или нескольких замещений аминокислот в области Fc антитела-антагониста. Альтернативно или дополнительно, может быть введен остаток(ки) цистеина, давая возможность межцепочечного образования дисульфидных связей в данной области. Генерированное таким образом гомодимерное антитело может обладать способностью интернализации и/или повышенной комплемент-зависимой способностью убивать клетки и антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J.Exp.Med. 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, B., J.Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также могут быть получены с использованием гетеробифункциональных кросс-линкеров, как описано в публикации Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Альтернативно может быть сконструировано антитело, которое обладает удвоенной областью Fc и следовательно может обладать повышенным лизисом комплемента и ADCC способностями. См., Stevenson et al., AntiCancer Drug Desing 3:219-230 (1989). Антитела с измененным (повышенным или пониженным) связыванием C1q и/или CDC способностью описаны в патентах США №№ 6194551В1 и 6538124В1 (Idusogie et al.), специально включенных в данное описание путем ссылки. Антитела с измененным (повышенным или пониженным) FcR-связыванием и/или ADCC активностью описаны в WO 00/42072 (Presta, L.), специально включенном в данное описание путем ссылки.

Для увеличения продолжительности полупериода существования в сыворотке крови антагониста или антитела, можно вводить в антагонист или антитело эпитоп связывания спасательного рецептора (особенно фрагмент антитела), как описано, например, в патенте США 5739277. В данном описании термин «эпитоп связывания спасательного рецептора» относится к эпитопу области Fс молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), который является ответственным за увеличение продолжительности полупериода существования в сыворотке крови молекулы IgG. Альтернативно или дополнительно, можно увеличить или уменьшить продолжительность периода полужизни в сыворотке крови путем изменения последовательности аминокислот области Fc антитела для образования вариантов с измененным связыванием FcRn. Антитела с измененным связыванием FcRn и/или полупериодом существования описаны в WO 00/42072 (Presta, L.), специально включенном в данное описание путем ссылки.

V. Фармацевтические препараты

Терапевтические препараты антагонистов или антител, используемых в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения путем смешивания антагониста или антитела, имеющих требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 издание, Osol A. Ed (1980)) в виде лиофилизованных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадециддиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалькония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабены; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахар, такой как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Иллюстративные препараты антитела против CD20 описаны в WO 98/56418, специально включенной в данное описание путем ссылки. В данной публикации описан жидкий многодозовый препарат, включающий в себя 40 мг/мл ритуксимаба, 25 мМ ацетата, 150 мМ трегалозы, 0,9% бензилового спирта, 0,02% полисорбата 20 при рН 5,0, который имеет минимальный срок хранения два года при 2-8°С. Другой представляющий интерес препарат включает в себя 10 мг/мл ритуксимаба в 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл дигидроцитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильную воду для инъекций, рН 6,5.

Лиофилизованные препараты, приспособленные для подкожного введения, описаны в WO 97/04801 и патенте США № 6267958 (Andya et al.). Содержание влаги в таких лиофилизованных препаратах может быть восстановлено с использованием подходящего разбавителя до высокой концентрации белка и восстановленный препарат может быть введен подкожно млекопитающему, предназначенному для лечения в соответствии с данным описанием.

Препарат согласно изобретению также может содержать более одного активного компонента, если необходимо в связи в конкретными предписаниями для лечения, и, предпочтительно, такие компоненты, дополняющая активность которых не будет оказывать неблагоприятного влияния друг на друга. Например, может оказаться желательным обеспечить дополнительно цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, цитокин или иммунодепресант. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антагониста или антитела, присутствующего в препарате, типа заболевания или нарушения или лечения и других обсуждавшихся выше факторов. Их обычно используют в тех же дозировках и с помощью тех же путей введения, как использовано ранее или примерно от 1 до 99% от ранее используемых дозировок.

Активные ингредиенты также могут быть включены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в виде коллоидных систем доставки (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в виде макроэмульсий. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 издание, Osol A. Ed (1980).

Могут быть получены препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист или антитело, где матрицы находятся в виде сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц замедленного высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полиактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^TM (микросферы для инъекций, состоящий из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и леупролидацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксибутановую кислоту.

Препараты, предназначенные для применения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется путем фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны.

VI. Лечение с использованием антагониста или антитела

Настоящее изобретение охватывает терапию различных заболеваний и нарушений с использованием антител и антагонистов. Когда антитело или антагонист связываются с В-клеточным поверхностным маркером, таким как CD20, состояния, подвергаемые лечению, включают В-клеточные злокачественные новообразования (см. патент США № 6455043В1, Grillo-Lopez, целенаправленно включенный в данное описание путем ссылки) и аутоиммунные заболевания (см. WO 00/67796, Curd и др., целенаправленно включенный в данное описание путем ссылки). Антагонист или антитело, которое связывается с В-клеточным поверхностным маркером, также можно использовать для блокирования иммунного ответа на чужеродный антиген, например, когда чужеродный антиген представляет собой иммуногенное лекарственное средство или трансплантат (см. WO 01/037734б Grillo-Lopez и др., целенаправленно включенный в данное описание путем ссылки).

Для различных описанных здесь предназначений, композиции, включающие в себя антагонист или антитело, будут получены, дозированы и введены таким образом, который согласуется с высококачественной медицинской практикой. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретного млекопитающего, подвергаемого лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания или состояния, место доставки агента, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Терапевтически эффективное количество антагониста или антитела для введения будет определяться при рассмотрении вышесказанного.

В качестве общего предложения, терапевтически эффективное количество антагониста или антитела, вводимого парентерально на дозу, будет составлять в диапазоне примерно от 0,1 до 20 мг/кг веса тела пациента в сутки, при типичном используемом первоначальном диапазоне антагониста или антитела в диапазоне примерно от 2 до 10 мг/кг.

Предпочтительный антагонист представляет собой антитело, например, такое антитело как ритуксимаб или гуманизованный 2Н7, которое не конъюгировано с цитотоксическим агентом. Подходящие дозировки для не конъюгированного антитела составляют, например, диапазон примерно от 20 мг/м² до примерно 1000 мг/м². В одном варианте осуществления, дозировка антитела отличается от рекомендованной в настоящее время для ритуксимаба. Иллюстративные режимы дозировки для антитела против CD20 включают 375 мг/м² еженедельно × 4 или 8; или 1000 мг × 2 (например, в 1 и 15 дни).

Однако, как отмечено выше, такие предлагаемые количества антагониста или антитела являются, в большей степени, предметом терапевтической прозорливости. Ключевым фактором в выборе подходящей дозы и режима является полученный результат, как указано выше. Например, относительно высокие дозы могут первоначально потребоваться для лечения продолжающихся и острых заболеваний. Для получения наиболее эффективных результатов, в зависимости от заболевания или нарушения, антагонист или антитело вводят наиболее близко к моменту первого признака, диагноза. Появления или существования заболевания или нарушения, насколько это возможно или во время ремиссии заболевания или нарушения.

Антагонист или антитело вводят любыми подходящими способами, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, и, при необходимости местного иммунодепрессантного лечения, введение внутрь раны. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антагонист или антитело могут подходящим образом быть введены путем пульсирующей инъекции, например, с понижающимися дозами антагониста или антитела. Предпочтительно дозировку вводят с помощью инъекций, частично в зависимости от того, является ли введение кратким или постоянным.

В данном случае можно вводить другие соединения, такие как цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, иммунодепрессивные средства и/или цитокины вместе с антагонистами или антителами. Комбинированное введение включает со-введение с использованием отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно имеется промежуток времени, когда оба (или все) активных агентов одновременно оказывают их биологическую активность.

Для ревматоидного артрита (RA) или других аутоиммунных заболеваний, антагонист или антитело (например, антитело против CD20) могут быть объединены с любым одним или несколькими иммунодепрессивными средствами, химиотерапевтическими агентами и/или цитокинами, перечисленными выше в разделе «Определения»; любым одним или несколькими модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (DMARDs), такими как гидроксихлороквин, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномид, азатиоприн, D-пеницилламин, Золото (перорально), Золото (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин, иммунопоглотитель белка А стафилококка; внутривенный иммуноглобулин (IVIG); нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (НПВС); глюкокортикоидом (например, посредством совместной инъекции; кортикостероидом (например, метилпреднизалон и/или преднизон); фолат; антителом противоопухолевого фактора некроза (TNF), например, этанерцепт/ENBREL^TM, инфликсимаб/REMICADE^TM, D2E7 (Knoll) или CDP-870 (Celltech); антагонистом IL-1R (например, Кинерет); антагонистом IL-10 (например, ллодекакин); модулятором свертываемости крови (например, WinRho); антагонистом IL-6/анти-TNF (CBP 1011); антагонистом CD40 (например, IDEC 131); антагонистом рецептора Ig-Fc (MDX33); иммуномодулятором (например, талидомид или ImmuDyn); антителом против CD5 (например, H5g1.1); ингибитором макрофагов (например, MDX 33); состимулирующим блокатором (например, BMS 188667 или Толеримаб); ингибитором комплемента (например, h5G1.1, 3E10 или антитело против фактора ускорения разложения (DAF); или антагонистом IL-2 (zxSMART).

Для В-клеточных злокачественных новообразований антагонист или антитело (например, антитело против CD20) могут быть объединены с химиотерапевтическим агентом; цитокином, например, лимфокином, таким как IL-2, IL-12 или интерферон, такой как интерферон альфа-2а; другим антителом, например, радиоактивно меченым антителом, таким как ибритумомаб тиуксетан (ZEVALIN®), иод I¹³¹ тозитумомаб (BEXXAR^TM), ¹³¹I Lym-1 (ONCOLYM^TM), ⁹⁰Y-LYMPHOCIDE^TM); антителом против CD52, таким как алемтузумаб (CAMPATH-1H^TM), антителом против HLA-DR-β, таким как аполизумаб, антитело против CD80 (например, IDEC-114), эпратузумаб, Hu1D10 (SMART 1D10^TM), антитело CD19, антитело CD40 или антитело CD22; иммуномодулятором (например, талидомидом или ImmyDyn); ингибитором ангиогенеза (например, антителом против сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), таким как AVASTINTM или талидомид); идиотипической вакциной (EPOCH); ONCO-TCSTM; HSPPC-96 (ONCOPHAGETM); липосомальной терапией (например, липосомы цитрата даунорубицина) и т.д.

Предпочтительные химиотерапевтические агенты для сочетания с антителом против CD20 (или атагонистом, который связывается с В-клеточным поверхностным маркером) представляют собой алкилирующие агенты или химиотерапевтические агенты на основе антрациклина или химиотерапевтические агенты на основе флударабина; цисплатин, флударабин, винбластин, доксорубицин, циклофосфамид и/или винкристин. Что касается антител против CD20 или других антител, которые связываются с В-клеточным поверхностным маркером, особенно желательная химиотерапия для сочетания с антителом, включает в себя, но не ограничивается указанным: циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон (СНОР) (Czuczman et al., J.Clin.Oncol., 17: 268-76 (1999)); циклофосфамид, винкристин и преднизон (CVP); флударабин (например, для лечения CLL); флударабин, циклофосфамид и митоксантрон (FCM); или доксорубицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин (ABVD).

Антагонист или антитело также можно использовать в миелоотделяемом режиме. Например, антагонист или антитело можно использовать для in vivo очистки перед сбором стволовых клеток или после трансплантации для подавления минимального остаточного заболевания.

Помимо введения антагонистов белка пациенту, настоящая заявка подразумевает введение антагонистов или антител путем генной терапии. См., например, WO 96/07321, опубликованный 14 марта 1996 г., касающийся генной терапии для генерирования внутриклеточных антител.

Существует два основных подхода для введения нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту непосредственно вводят в виде инъекции пациенту, обычно в место, где требуется антагонист или антитело. Для лечения ex vivo, клетки пациента удаляют, нуклеиновую кислоту вводят в данные выделенные клетки, и модифицированные клетки вводят пациенту или непосредственно, или, например, инкапсулированными в пористых мембранах, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США 4892538 и 5283187). Существует множество способов, доступных для введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Способы изменяются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивированные клетки in vitro или in vivo в клетки предназначенного хозяина. Способы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосомов, электропорацию, микроинъекцию, клеточное слияние, DEAE-декстран, способ кальций-фосфатного осаждения и т.д. Обычно используемый вектор для доставки гена ex vivo представляет собой ретровирус.

Предпочитаемые в настоящее время способы переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают в себя трансфекцию векторами вирусов (таких как аденовирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и систем на основе липидов (полезными липидами для липид-опосредованного переноса гена являются DOTMA, DOPE и DC-Chol, например). В некоторых ситуациях желательно обеспечить источник нуклеиновой кислоты агентом, который нацелен на клетки-мишени, таким как антитело, специфическое для белка поверхности клеточной мембраны или для клетки-мишени, лиганд рецептора на поверхности клетки-мишени и т.д. Когда используются липосомы, для нацеливания и/или облегчения поглощения могут быть использованы белки, которые связываются с белком поверхности клеточной мембраны, связанным с эндоцитозом, например, капсидные белки или их фрагменты, тропные в отношении конкретного типа клетки, антитела для белков, которые подвергаются интернализации в клеточном цикле, и белки, которые нацелены на внутриклеточную область и увеличивают внутриклеточный период полужизни. Способ рецептор-опосредованного эндоцитоза описан, например, в публикациях Wu et al., J.Biol.Chem., 262: 4429-4432 (1987) и Wagner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 3410-3413 (1990). Обзор в области известного в настоящее время маркирования гена и протоколы генной терапии приведены в публикации Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). См., также WO 93/25673 и процитированные там ссылки.

Дополнительные подробности изобретения проиллюстрированы в следующих не ограничивающих примерах. Сущность всех процитированных публикаций в описании преднамеренно включена в него путем ссылки.

Пример 1

Анализ комплемент-зависимой цитотоксичности для обнаружения нейтрализующих антител против ритуксимаба.

Ритуксимаб проявляет свою биологическую функцию посредством уменьшения числа CD20+ В-клеток посредством антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или обеих из них. In vitro, CDC активность может быть измерена путем инкубирования CD20+WIL2-S клеток лимфомы с комплементом человека в отсутствие или в присутствии различных концентраций Ритуксимаба. Затем измеряют цитотоксичность путем оценки количества живых клеток с использованием ALAMAR BLUE® (Gazzano-Santoro et al., J.Immunol.Methods, 202, 163-171 (1997)).

В данном примере были идентифицированы образцы сыворотки крови, полученной от пациента, подвергавшегося лечению Ритуксимабом, что привело к образованию антител НАСА. НАСА-положительную сыворотку крови, что было подтверждено по уменьшению иммунитета, затем подвергали анализу на нейтрализующие антитела, описанному далее. Анализ НАСА имеет мостиковый формат с использованием Ритуксимаба в качестве захватывающего реагента и биотинилированного Ритуксимаба в качестве реагента обнаружения. Анализ имеет калиброванную стандартную кривую, полученную с использованием поликлональных козьих антител против ритуксимаба. Минимальное разведение образца в анализе составляет 1/5 с наиболее низким стандартом при 1 ОЕд (относительные единицы)/мл. Ответная реакция образца ниже 5 ОЕд/мл (величина, соответствующая фактору разведения 1/5) рассматривается как отрицательная в отношении НАСА.

Был разработан анализ для обнаружения нейтрализующих антител против Ритуксимаба. Анализ нейтрализующих антител был проведен с использованием культуральной среды RPMI 1640, дополненной 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 20 мМ HEPES (pH 7,2-7,4) и 0,1 мМ гентамицина. Анализ был разработан и откалиброван с использованием аффинно-очищенных козьих антител против Ритуксимаба. Когда анализ был проведен в буферной матрице, обычно 1-10 мкл козьего антитела против ритуксимаба предварительно инкубировали с 50 мкл раствора Ритуксимаба различной концентрации (0-10 мкг/мл) в плоскодонном 96-луночном планшете для культур тканей. После предварительной инкубации при комнатной температуре в течение 1-2 часов, добавляли 50 мкл комплемента человека, разведенного в среде для анализа в соотношении 1/3, 50 мкл лимфобластных клеток WIL2-S из расчета 10⁶ клеток/мл, суспендированных в буфере для анализа, и смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С и 5% СО₂ для облегчения комплемент-опосредованного лизиса клеток. Затем добавляли 50 мкл неразведенного AlamarBlue, и инкубирование продолжали в течение 15-26 часов. Планшеты оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение 10 минут при встряхивании и флуоресценцию считывали с использованием 96-луночного флуориметра при возбуждении при 530 нм и эмиссии при 590 нм. Строили график относительных единиц флуоресценции (RFU) относительно концентрации Ритуксимаба с использованием 4-параметрической программы подбора кривой (Softmax). При сопоставлении двух кривых, полученных с предварительным инкубированием с антителом и без предварительного инкубирования, может быть определена нейтрализующая способность антител против Ритуксимаба. Если антитела против ритуксимаба нейтрализуют активность Ритуксимаба на двадцать процентов или более при данной концентрации, антитела против Ритуксимаба определялись как положительные по нейтрализующей способности. Этот результат может быть дополнительно оценен количественно путем определения количества антител против Ритуксимаба для нейтрализации 1 мкг Ритуксимаба. Было определено, что молярное соотношение для козьих поликлональных антител против Ритуксимаба для нейтрализации Ритуксимаба составляет приблизительно 3 к 1.

Поскольку большинство образцов, полученных от пациентов, представляют собой образцы сыворотки крови, оценивали влияние матрицы сыворотки на эффективность проведения анализа. Включение 5% и 10% обычной сыворотки человека в среду для анализа оказывало минимальное действие на 4-параметрический подбор кривой. Сигнальное подавление верхней асимптоты наблюдалось в том случае, когда концентрация сыворотки составляла выше 20%. Однако сыворотка может переноситься в концентрации приблизительно до 50% без заметного смещения величин IC₅₀. Эти данные показывают выполнимость использования CDC анализа для обнаружения антител против Ритуксимаба без дополнительного манипулирования с образцами сыворотки крови пациента. При тестировании образцов сыворотки крови вплоть до 50 мкл сыворотки крови инкубировали с 50 мкл разведений Ритуксимаба перед добавлением комплемента и суспензии клеток. Оставшаяся часть методики была такой, как описано выше. Для анализа данных нейтрализующую способность обработанной ритуксимабом сыворотки крови сравнивали по отдельности с предварительно обработанными образцами сыворотки крови для определения нейтрализующей активности. Предел чувствительности/предела обнаружения в анализе в матрице сыворотки крови был определен путем добавления аффинно-очищенных козьих антител против Ритуксимаба в обычную сыворотку крови человека. С использованием формата настоящего анализа наиболее низкое количество нейтрализующего антитела в сыворотке крови, которое может быть определено, составляет приблизительно 1 мкг/мл.

В анализе нейтрализующих антител были протестированы образцы, полученные от пациента с системной красной волчанкой (SLE), который подвергался лечению Ритуксимабом, имеющие ответ антител (НАСА+) в соответствии с данными вышеуказанного анализа ELISA. Межу базовой линией сыворотки крови и сывороткой после обработки Ритуксимабом наблюдалась существенная разница. CDC активность была или полностью или частично блокирована НАСА+ сывороткой крови, указывая на нейтрализующую активность обработанных образцов. Для сравнения, образцы сыворотки крови, полученные перед лечением Ритуксимабом, не продемонстрировали нейтрализующей активности.

Подводя итог вышесказанному, в примере описан функциональный анализ на основе клеток, анализ комплемент-зависимой цитотоксичности (СDC), для обнаружения нейтрализующей активности в сыворотке крови пациентов, подвергающихся лечению Ритуксимабом. Данный анализ в большой степени будет помогать в определении природы ответной реакции антител против лекарственного средства; следовательно, он будет иметь большую значимость при оценке безопасности и эффективности лекарственного средства.

Пример 2

Терапия аутоиммунного заболевания

В соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения, описанный здесь анализ можно использовать по отношению к режимам лечения пациентов с аутоиммунным заболеванием. Иллюстративные аутоиммунные заболевания включают в себя ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), включая экзематозный нефрит, болезнь Вегенера, воспалительное заболевание кишечника, идиопатическую или иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромбоцитопенический акроангиотромбоз (ТТР), аутоиммунную тромбоцитопению, рассеянный склероз (MS), псориаз, IgA нефропатию, IgM полиневропатию, миастению гравис, васкулит, сахарный диабет, синдром Рейно, синдром Шегрена, гломерулонефрит, аутоиммунную гемолитическую анемию и т.д.

Антитело, которое связывает CD20 (например, ритуксимаб или гуманизованный 2Н7), вводят пациенту в количестве, эффективном для лечения рассматриваемого аутоиммунного заболевания. Например, антитело можно вводить в дозировке

375 мг/м² еженедельно в течение 4 или 8 недель; или 1000 мг в 1 и 15 дни. Антитело необязательно комбинируют с одним или несколькими другими лекарственными средствами, которые предназначены для лечения аутоиммунного заболевания, такими как иммунодепрессивные препараты, химиотерапевтические агенты и/или цитокины, перечисленные выше в разделе «Определения»; любым одним или несколькими модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (DMARDs), такими как гидроксихлороквин, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномид, азатиоприн, D-пеницилламин, Золото (перорально), Золото (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин, иммунопоглотитель белка А стафилококка; внутривенный иммуноглобулин (IVIG); нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (НПВС); глюкокортикоидом (например, посредством совместной инъекции; кортикостероидом (например, метилпреднизалон и/или преднизон); фолатом; антителом против опухолевого фактора некроза (TNF), например, этанерцепт/ENBREL^TM, инфликсимаб/REMICADE^TM, D2E7 (Knoll) или CDP-870 (Celltech); антагонистом IL-1R (например, Кинерет); антагонистом IL-10 (например, ллодекакин); модулятором свертываемости крови (например, WinRho); антагонистом IL-6/анти-TNF (CBP 1011); антагонистом CD40 (например, IDEC 131); антагонистом рецептора Ig-Fc (MDX33); иммуномодулятором (например, талидомид или ImmuDyn); антителом против CD5 (например, H5g1.1); ингибитор макрофагов (например, MDX 33); состимулирующим блокатором (например, BMS 188667 или Толеримаб); ингибитором комплемента (например, h5G1.1, 3E10 или антитело против фактора ускорения разложения (DAF); или антагонистом IL-2 (zxSMART).

Биологический образец сыворотки крови, который может содержать антитела НАСА (направленный против ритуксимаба) или НАНА (направленный против гуманизованного 2Н7), получают от пациента в основной период (базисная линия) и через 3, 6 и 9 месяцев. Сыворотку крови анализируют с помощью ELISA для определения присутствия в ней НАСА или НАНА. Анализ описан выше в примере 1.

Сыворотку крови, в которой показано наличие НАСА или НАНА, затем исследуют на нейтрализующие антитела, как описано выше в примере 1. По сравнению с тем же количеством предварительно обработанного аналогичного образца (т.е. НАСА и НАНА отрицательного), образец, нейтрализующий активность ритуксимаба или 2Н7 при данной концентрации примерно на 20% или больше, может рассматриваться как положительный в отношении нейтрализующего антитела, направленного против ритуксимаба или гуманизованного 2Н7. Положительный результат является указанием на пониженную эффективность антитела при лечении аутоиммунного заболевания.

Пример 3

Лечение В-клеточного злокачественного заболевания

Пациента, имеющего CD20-положительное В-клеточное злокачественное заболевание, такое как болезнь Ходжкина, включая лимфоцит-доминирующую болезнь Ходжкина (LPHD); неходжскинская лимфома (NHL); фолликулярная центральноклеточная лимфома (FCC); острая лимфоцитарная лейкемия (ALL); хроническая лимфоцитарная лейкемия (CLL); волоcатоклеточный лейкоз; плазмацитоидная лимфоцитарная лимфома; лимфома клеток коры головного мозга, СПИД - или ВИЧ-связанная лимфома; множественная миелома; лимфома центральной нервной системы (ЦНС); посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD); макроглобулинемия Вальденстрома (лимфоплазмацитарная лимфома); лимфома ассоциированной со слизистой лимфатической ткани (MALT) и лимфома/лейкемия маргинальной зоны, подвергают лечению в соответствии с данным примером.

Антитело, которое связывает CD20 (например, ритуксимаб или гуманизованный 2Н7), вводят пациенту в количестве, эффективном для лечения рассматриваемого В-клеточного злокачественного заболевания. Например, антитело можно вводить в дозировке 375 мг/м² еженедельно в течение 4 или 8 недель.

Антитело против CD20 необязательно комбинируют с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами. Предпочтительными химиотерапевтическими агентами для комбинирования с антителом являются химиотерапевтические агенты алкилаторного типа или на основе антрациклина, или химиотерапевтические агенты на основе флударабина; цисплатин, флударабин, винбластин, доксорубиин, цилофосфамид и/или винкристин. Особенно желательная химиотерапия для комбинирования с антителом включает в себя, но не ограничивается указанным: циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон (СНОР) (Czuczman et al. J.Clin.Oncol., 17: 268-76 (1999)); циклофосфамид, винкристин и преднизон (CVP); флударабин (например, для лечения CLL); флударабин, циклофосфамид и митоксантрон (FCM); или доксорубицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин (ABVD) и т.д.

Биологический образец сыворотки крови, который может содержать антитела НАСА (направленный против ритуксимаба) или НАНА (направленный против гуманизованного 2Н7), получают от пациента в основной период (базисная линия) и через 3, 6 и 9 месяцев. Сыворотку крови анализируют с помощью ELISA для определения присутствия в ней НАСА или НАНА. Анализ описан выше в примере 1.

Сыворотку крови, в которой показано наличие НАСА или НАНА, затем исследуют на нейтрализующие антитела, как описано выше в примере 1. По сравнению с тем же количеством предварительно обработанного аналогичного образца (т.е. НАСА и НАНА отрицательного), образец, нейтрализующий активность ритуксимаба или 2Н7 при данной концентрации примерно на 20% или больше, может рассматриваться как положительный в отношении нейтрализующего антитела, направленного против ритуксимаба или гуманизованного 2Н7. Присутствие нейтрализующих антител указывает на пониженную эффективность антитела при лечении В-клеточного злокачественного заболевания.

Пример 4

Блокирование иммунного ответа на чужеродный антиген

В настоящем примере антитело против CD20 используют для блокирования иммунного ответа на чужеродный антиген, такой как терапевтический белок (например, мышиное антитело или иммунотоксин), вирусный вектор генной терапии, фактор крови (например, фактор VIII), тромбоциты или трансплантат и т.д.

Подходящая дозировка антитела против CD20 составляет 375 мг/м², вводимая с помощью четырех или восьми вливаний каждую неделю. Введение антитела против CD20 будет снижать или исключать иммунный ответ у пациентов и, следовательно, облегчать успешное проведение терапии.

Для блокирования иммунного ответа на транстплантат, антитело против CD20 может быть использовано как часть комбинации иммунодепрессивного режима для профилактики острого отторжения. В таком оформлении, антитело против CD20, такое как ритуксимаб или гуманизованный 2Н7, вводят в пери-трансплантационный период как часть последовательного комбинированного режима, который включает в себя агенты, направленные на Т-клетки, такие как циклоспорин, кортикостероиды, микофенолят мофетил с использованием или без использования антитела против рецептора IL2. Следовательно, антитело против CD20 следует рассматривать как часть индукционного режима для использования в сочетании с постоянной иммунодепрессантной терапией. Антитело против CD20 может вносить вклад в предотвращение ответной реакции аллоотторжения путем ингибирования продуцирования аллоантител и/или воздействуя на представление аллоантигена посредством истощения антиген-представляющих клеток.

Дозировки дополнительных иммунодепрессивных агентов являются следующими: циклоспорин (5 мг/кг/день); кортикостероиды (1 мг/кг, постепенно уменьшающиеся); микофенолят мофетил (1 грамм дважды в день) и антитело против рецептора IL2 (1 мг/кг, пять инфузий еженедельно). Антитело против CD20 можно комбинировать с другими индукционными иммунодепрессивными лекарственными средствами, такими как поликлональные антитела против лимфоцитов или моноклональные антитела против CD3; поддерживающие иммунодепрессивные лекарственные средства, такие как ингибиторы кальцинеурина (например, такролимус) и антипролиферативные агенты (такие как азатиоприн, лефлуномид или сиролимус) или с комбинированными режимами, которые включают блокаду со-стимуляции Т-клеток, блокаду Т-клеточных адгезионных молекул или блокаду Т-клеточных вспомогательных молекул.

Помимо профилактики острого отторжения, антитела против CD20 можно использовать для лечения острого отторжения. Подходящие дозировки CD20 описаны выше. Антитело против CD20 необязательно объединяют с моноклональным антителом против CD3 и/или кортикостероидами при лечении острого отторжения.

Антитела против CD20 также можно использовать (а) после пост-трансплантационного периода либо индивидуально, либо в сочетании с другими иммунодепрессивными агентами и/или состимулирующей блокадой для лечения или профилактики «хронического» отторжения аллотрансплантата; (b) как часть индуцирующего переносимость режима или (с) при размещении ксенотрансплантации.

Биологический образец сыворотки крови, который может содержать НАСА (направленный против ритуксимаба) или НАНА (направленный против гуманизованного 2Н7), получают от пациента в основной период (базисная линия) и через 3, 6 и 9 месяцев. Сыворотку крови анализируют с помощью ELISA для определения присутствия в ней НАСА или НАНА. Анализ описан в примере 1 выше.

Сыворотку крови, в которой показано наличие НАСА или НАНА, затем исследуют на нейтрализующие антитела, как описано выше в примере 1. По сравнению с тем же количеством предварительно обработанного аналогичного образца (т.е. НАСА и НАНА отрицательные), образец, нейтрализующий активность ритуксимаба или 2Н7 при данной концентрации примерно на 20% или больше, может рассматриваться как положительный в отношении нейтрализующего антитела, направленного против ритуксимаба или гуманизованного 2Н7. В тех случаях, когда обнаруживается нейтрализующая ответная реакция антитела, это указывает, что антитело обладает пониженной способностью блокировать иммунный ответ на рассматриваемый чужеродный антиген.

Изобретение относится к медицине и биохимии и касается способа обнаружения нейтрализующих антител к терапевтическому антителу, такому как антитело против CD20. Изобретение обеспечивает оценку безопасности и эффективности антитела в способе иммунотерапии. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ оценки эффективности антитела, которое связывается с CD20, включающий в себя измерение способности биологического образца, полученного от пациента, обработанного антителом против CD20, блокировать биологическую активность антитела против CD20, где пациент имеет аутоиммунное заболевание.

2. Способ по п.1, где биологическую активность выбирают из группы, состоящей из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), апоптоза и ингибирования роста клеток.

3. Способ по п.1, где биологическая активность представляет собой комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).

4. Способ по п.1, где антитело против CD20 представляет собой ритуксимаб.

5. Способ по п.1, где антитело против CD20 представляет собой гуманизированный 2Н7.

6. Способ по п.1, где биологический образец включает в себя антитела пациента, которые связывают антитело против CD20.

7. Способ по п.6, где биологический образец подвергают анализу, который дает возможность определить присутствие антител пациента, которые связывают антитело против CD20 в биологическом образце, полученном от пациента.

8. Способ по п.1, где биологический образец включает в себя сыворотку крови пациента.

9. Способ по п.1, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита (RA), системной красной волчанки (SLE), болезни Вегенера, воспалительного заболевания кишечника, идиопатической или иммунной тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромбоцитопенического акроангиотромбоза (ТТР), аутоиммунной тромбоцитопении, рассеянного склероза (MS), псориаза, IgA-нефропатии, IgM-полиневропатии, миастении гравис, васкулита, сахарного диабета, синдрома Рейно, синдрома Шегрена, гломерулонефрита и аутоиммунной гемолитической анемии.

10. Способ по п.3, где анализ включает в себя воздействие комплемента на CD20 положительные клетки в присутствии антитела против CD20 и биологического образца, а затем определение выживаемости клеток, подвергнутых воздействию.

11. Способ иммунотерапии, включающий в себя
введение пациенту антитела, которое связывается с CD20; и
измерение способности биологического образца, полученного от пациента,
блокировать биологическую активность антитела против CD20,
где пациент имеет аутоиммунное заболевание.

12. Способ обнаружения нейтрализующих антител к терапевтическому антителу, включающий в себя
воздействие комплемента на клетки, которые экспрессируют антиген, с которым связывается терапевтическое антитело, в присутствии терапевтического антитела и биологического образца, полученного от пациента, подвергаемого лечению, и
определение комплемент-зависимой цитотоксической (CDC) активности терапевтического антитела, где снижение активности CDC указывает на присутствие нейтрализующих антител в биологическом образце,
где пациент имеет аутоиммунное заболевание.