СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 2010 года по МПК A61K39/395 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза (множественного склероза) (МС) у субъекта с использованием специальных схем и протоколов введения доз и к изделию с инструкциями в отношении такого использования.

Область техники

Рассеянный склероз

Рассеянный склероз (МС) является воспалительным демиелинизирующим дегенеративным заболеванием центральной нервной системы человека (ЦНС). Он является заболеванием, распространенным по всему миру, которое поражает приблизительно 300000 лиц в Соединенных Штатах; он является заболеванием молодых взрослых, причем у 70-80% пациентов он появляется в возрасте между 20 и 40 годами (Anderson et al. Ann Neurology 31(3):333-6 (1992); Noonan et al. Neurology 58:136-8 (2002)). МС является гетерогенным нарушением, на основе клинического течения, оценки изображения сканирующей ядерно-магнитной резонансной томографии (ЯМР-томографии) и анализа патологии материала биопсии и аутопсии (Lucchinetti et al. Ann Neurol 47:707-17 (2000)). Это заболевание манифестируется в большом количестве возможных комбинаций нарушений, в том числе синдромов спинного мозга, ствола головного мозга, черепного нерва, мозжечка, церебрального и когнитивного синдромов. Прогрессирующая потеря трудоспособности является судьбой большинства пациентов с МС, в частности, с 25-летней перспективой. Половина пациентов с МС нуждаются в палке для хождения в пределах 15 лет от возникновения заболевания. МС является основной причиной неврологической недееспособности у молодых взрослых и взрослых среднего возраста и до прошлого десятилетия не имел известных благоприятных способов лечения. МС трудно диагностировать вследствие неспецифических клинических показателей, что привело к развитию высокоструктурированных диагностических критериев, которые включают в себя несколько технологических достижений, состоящих из сканирующей ЯМР-диагностики, вызванных (индуцированных) потенциалов и исследований цереброспинальной жидкости (CSF). Все диагностические критерии основываются на общих принципах рассеянных повреждений в белом веществе мозга, встречающихся в различное время и не объяснимого другими этиологиями, такими как инфекция, сосудистое нарушение или аутоиммунное нарушение (McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001)). МС имеет четыре картины заболевания: рецидивирующий-ремиттирующий МС (RRMS; 80-85% случаев при возникновении), первичный прогрессирующий МС (PPMS; 10-15% при возникновении), прогрессирующий рецидивирующий МС (PRMS; 5% при возникновении) и вторичный прогрессирующий МС (SPMS) (Kremenchutzky et al. Brain 122 (Pt 10):1941-50 (1999); Confavreux et al. N Engl J Med 343(20):1430-8 (2000)). По приближенной оценке у 50% пациентов с RRMS в течение 10 лет будет развиваться SPMS и у до 90% пациентов с RRMS будет в конечном счете развиваться SPMS (Weinshenker et al. Brain 112(Pt 1):133-46 (1989)).

В настоящее время шесть лекарственных средств в четырех классах являются одобренными в Соединенных Штатах Америки для лечения RRMS, в то время как никакие лекарственные средства не были одобрены для PPMS. Способы лечения RRMS включают в себя следующее: класс интерферонов, IFN-бета-1а (REBIF® и AVONEX®) и IFN-бета-1b (BETASERON®); глатирамер ацетат (COPAXONE®), полипептид; натализумаб (TYSABRI®) и митоксатрон (NOVANTRONE®), цитотоксический агент. Другие лекарственные средства использовали с переменными степенями успеха, в том числе кортикостероиды, метотрексат, циклофосфамид, азатиоприн и внутривенный (IV) иммуноглобулин. Благоприятные эффекты одобренных в настоящее время способов лечения являются относительно скромными (~30%) для скорости рецидива и предупреждения нетрудоспособности при RRMS, как предполагается по результатам двух недавних мета-анализов (Filippini et al. Lancet 361:545-52 (2003)).

В других клинических исследованиях оценивали другие иммуномодулирующие средства для лечения в МС, в том числе ингибиторы фактора некроза опухолей α и измененные пептидные лиганды, которые скорее ухудшали, чем улучшали течение МС (Lenercept Multiple Sclerosis Study Group and the University of British Columbia MS/MRI Neurology 53:457-65 (1999); Bielekova et al. Nat Med 2000;6:1167-75 (2000), опечатки приведены в Nat Med 6:1412 (2000)).

Господствовала преобладающая точка зрения на патофизиологию МС, что воспаление опосредуется главным образом CD4⁺ Тh1 Т-клетками. Терапевтические подходы, основанные на этой теории, такие как использование IFN-бета и глатирамерацетата, уменьшают, но полностью не предотвращают проявление обострений или накопление недееспособности.

Существование гуморального компонента в МС человека безоговорочно признавалось в течение десятилетий, как было показано включением олигоклональных полос CSF и увеличенным внутриоболочечным синтезом IgG в диагностических критериях для МС (Siden A. J Neurol 221:39-51 (1979); McDonald et al., Ann Neurol 50:121-7 (2001); Andersson et al., Eur J Neurol 9:243-51 (2002); O'Connor, P. Neurology 59:S1-33 (2002)). Присутствие олигоклональных полос, увеличенных свободных легких цепей и увеличенного внутриоболочечного синтеза IgМ коррелирует с активностью заболевания МС и может быть прогностическим фактором более тяжелых результатов (Rudick et al. Mult Scler 1:150-5 (1995); Zeman et al. Acta Cytol 45:51-9 (2001); Izquierdo et al. Acta Neurol Scand 105:158-63 (2002); Wolinsky J. J Neurol Sci 206:145-52 (2003); Villar et al. Ann Neurol 52:222-6 (2002)).

Антимиелиновые антитела (против миелинового основного белка (МВР) и миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG)) были детектированы в сыворотке пациентов с прогрессирующей и рецидивирующей формами МС (Reindl et al. Brain 122:2047-56 (1999); Egg et al. Mult Scler 7(5): 285-9 (2001)). Антимиелиновые антитела были также детектированы в CSF пациентов с МС (Reindl et al. Brain 122:2047-56 (1999); Egg et al. Mult Scler 7(5): 285-9 (2001); Andersson et al., Eur J Neurol 9:243-51 (2002)). Дополнительные типы антител, такие как антиганглиозидные антитела или антинейрофиламентные антитела, наблюдали у пациентов с МС (Mata et al. Mult Scler 5:379-88 (1999); Sadatipour et al. Ann Neurol 44:980-3 (1998)). Недавнее сообщение указывало на то, что присутствие сывороточных анти-MOG- и анти-MBP-антител было сильным прогностическим фактором прогрессирования из клинически изолированного демиелинизирующего события в точно определенный RRMS (Berger et al. N Engl J Med 349:139-45 (2003)). Корректированный коэффициент риска в отношении получения обострения был равен 76,5 для пациентов, которые были серопозитивными в отношении обоих антител, и 31,6 для пациентов, которые были серонегативными только в отношении анти-MOG-антител.

На Международном консорциуме по патологии определено, что антитела, связанные с миелином, присутствуют в большинстве пациентов с МС, с клетками плазмы и В-клетками, также обнаруживаемыми в повреждениях МС, что обеспечило дополнительное доказательство в отношении гуморальной роли в МС (Prineas and Wright, Lab Invest 38:409-21 (1978); Esiri M. Neuropathol Appl Neurobiol 6:9-21 (1980); Genain et al. Nat Med 5:170-5 (1999); Lucchinetti et al. Ann Neurol 47:707-17 (2000); Wingerchuk et al. Lab Invest 81:263-81 (2001)). В-клетки являются детектируемыми в цереброспинальной жидкости (CSF) пациентов с МС, и присутствие относительно высокой доли В-клеток может быть показателем более тяжелого прогрессирования недееспособности (Cepok et al. Brain 124(Pt 11):2169-76 (2001)).

Ритуксимаб, как сообщалось, истощал периферические В-клетки у всех субъектов с RRMS или синдромом опсоклонуса-миоклонуса и уменьшал количество В-клеток CSF у некоторых пациентов (Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppl1) PO5.128:A395 (2003); Cross et al. “Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS” (abstract) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis ACTRIMS 20-1 (October, 2004)). См. также Cree et al. “Tolerability and Effects of Rituximab “Anti-CD20 Antibody” in Neuromyelitis Optica and Rapidly Worsening Multiple Sclerosis” Meeting of the Am. Acad. Neurol. (April, 2004).

CD20-антитела и терапия с их применением

Лимфоциты являются одним из многих типов лейкоцитов, продуцируемых костным мозгом во время процесса гемопоэза. Имеются две основных популяции лимфоцитов: В-лимфоциты (В-клетки) и Т-лимфоциты (Т-клетки). Лимфоцитами, которые здесь представляют особый интерес, являются В-клетки.

В-клетки созревают в костном мозге и покидают костный мозг, экспрессируя антигенсвязывающее антитело на их клеточной поверхности. Когда «необученная» В-клетка впервые встречается с антигеном, в отношении которого является специфическим ее мембраносвязанное антитело, эта клетка начинает быстро делиться, и ее потомство дифференцируется в В-клетки иммунологической памяти и эффекторные клетки, называемые «плазматическими клетками» (плазмацитами). В-клетки памяти имеют большую продолжительность жизни и продолжают экспрессировать мембраносвязанное антитело с той же самой специфичностью, что и исходная родительская клетка. Плазматические клетки не продуцируют мембраносвязанное антитело, но вместо этого продуцируют антитело в форме, которая может быть секретирована. Секретируемые антитела являются главной эффекторной молекулой гуморального иммунитета.

Антиген CD20 (также называемый консервативным антигеном дифференцировки В-лимфоцитов человека, Вр35) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярной массой приблизительно 35 кД, локализованным на пре-В- и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989); и Einfeld et al. EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). Этот антиген экспрессируется также на более чем 90% В-клеточных не-ходжкинских лимфом (NHL) (Anderson et al. Blood 63(6):1424-1433 (1984)), но не обнаруживается на гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD20 регулирует раннюю стадию (ранние стадии) в процессе активации для инициации клеточного цикла и дифференцировки (Tedder et al. см. выше) и, возможно, функционирует в качестве канала ионов кальция (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).

При условии экспрессии CD20 в В-клеточных лимфомах этот антиген может служить в качестве кандидата для «нацеливания» на такие лимфомы. По существу, такое нацеливание может быть в общем виде следующим: антитела, специфические в отношении поверхностного антигена CD20 В-клеток, вводят пациенту. Эти анти-CD20-антитела специфически связываются с антигеном CD20 (очевидно) как нормальных, так и злокачественных В-клеток; это антитело, связанное с поверхностным антигеном CD20, может приводить к разрушению и истощению неопластических В-клеток. Кроме того, химические агенты или радиоактивные метки, имеющие потенциал разрушения опухоли, могут быть конъюгированы с анти-CD20-антителом, так что этот агент специфически “доставляется” к неопластическим В-клеткам. Независимо от этого подхода, первичной задачей является разрушение опухоли; конкретный подход может определяться конкретным используемым анти-CD20-антителом, и, следовательно, доступные подходы к нацеливанию на антиген CD20 могут значительно варьироваться.

Антитело Ритуксимаб (RITUXAN®) является генетически сконструированным химерным мышиным/человеческим моноклональным антителом, направленным против антигена CD20. Ритуксимаб является антителом, называемым “C2B8” в Патенте США № 5736137, выданном 7 апреля 1998 года (Anderson et al.). RITUXAN® показан для лечения пациентов с рецидивирующей или трудноизлечимой низкозлокачественной или фолликулярной, CD20-положительной, В-клеточной не-ходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro показали, что RITUXAN® связывает комплемент человека и лизирует лимфоидные В-клеточные линии через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Дополнительно, он имеет существенную активность в анализах на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Более недавно было показано, что RITUXAN® имеет антипролиферативные действия в анализах включения тимидина, обработанного тритием, и непосредственно индуцирует апоптоз, тогда как другие анти-CD19- и CD20-антитела прямо не индуцируют апоптоз (Maloney et al. Blood 88(10):637a (1996)). Синергизм между RITUXAN® и химиотерапией и токсином также наблюдали экспериментально. В частности, RITUXAN® сенсибилизирует устойчивые к лекарственным средствам линии клеток В-клеточной лимфомы человека к цитотоксическим эффектам доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceutical 12(3):177-186 (1997)). Преклинические исследования in vivo показали, что RITUXAN® истощает В-клетки из периферической крови, лимфатических узлов и костного мозга собакоподобных обезьян, предположительно через комплемент- и клеточно-опосредованные процессы (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)).

Ритуксимаб был одобрен в Соединенных Штатах в ноябре 1997 года для лечения пациентов с рецидивирующей или трудноизлечимой низкозлокачественной или фолликулярной CD20⁺ В-клеточной не-ходжкинской лимфомой (NHL) в дозе 375 мг/м² один раз в неделю в виде четырех доз. В апреле 2001 года Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) одобрило дополнительные притязания в отношении лечения низкозлокачественной NHL: повторное лечение (один раз в неделю в виде четырех доз) и дополнительную схему введения доз (один раз в неделю в виде восьми доз). Более чем 300000 пациентов получали Ритуксимаб либо в виде монотерапии, либо в комбинации с иммуносупрессором или химиотерапевтическими лекарственными средствами. Пациентов лечили также Ритуксимабом в качестве поддерживающей терапии в течение до 2 лет (Hainsworth et al. J Clin Oncol 21:1746-51 (2003); Hainsworth et al. J Clin Oncol 20:4261-7 (2002)).

Ритуксимаб изучался также в различных незлокачественных аутоиммунных нарушениях, в которых В-клетки и аутоантитела, по-видимому, играют роль в патофизиологии заболевания (Edwards et al. Biochem Soc Trans 30:824-8 (2002)). Сообщалось, что Ритуксимаб потенциально ослабляет признаки и симптомы ревматоидного артрита (RА) (Leandro et al. Ann Rheum Dis. 61:883-8 (2002); Emery et al. Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003)), красной волчанки (Eisenberg R. Arthritis Res Ther 5:157-9 (2003); Leandro et al. Arthritis Rheum 46:2673-7 (2002)), иммунной тромбоцитопении (D'Arena et al. Leuk Lymphoma 44:561-2 (2003)), аутоиммунной анемии (Zaja et al., Haematologica 87:189-95 (2002) (опечатки приведены в Haematologica 87:336 (2002)), аутоиммунной невропатии (Pestronk et al. J. Neurol Neurosurg Psychiatry 74:485-9 (2003)), паранеопластического синдрома опсоклонуса-миоклонуса (Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppl1) PO5.128:A395 (2003)) и рецидивирующего-ремиттирующего рассеянного склероза (RRMS) (Cross et al. (abstact) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis 20-1 (2003)).

Исследование фазы II (WA16291) проводили на пациентах с ревматоидным артритом (RА) с получением результатов 48-дневного последующего врачебного (катамнестического) наблюдения по безопасности и эффективности Ритуксимаба (Emery et al. Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003); Szczepanski et al. Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003)). В целом 161 пациент были равномерно рандомизированы на четыре ветви лечения: метотрексат; только Ритуксимаб; Ритуксимаб плюс метотрексат; Ритуксимаб плюс циклофосфамид (СТХ). Схемой лечения Ритуксимабом была схема 1 г, вводимый внутривенно в дни 1 и 15. Инфузии Ритуксимаба пациентам с RА хорошо переносились большинством пациентов, и 36% пациентов испытывали по меньшей мере одно неблагоприятное событие во время их первой инфузии (в сравнении с 30% пациентов, получавших плацебо). В целом, считалось, что большинство неблагоприятных событий были слабыми - умеренными по тяжести и были хорошо сбалансированными во всех группах лечения. В целом, было 19 серьезных неблагоприятных событий во всех четырех ветвях исследования на протяжении 48 недель, которые были слегка более частыми в группе Ритуксимаб/CTX. Случаи инфекций были хорошо сбалансированными по всем группам. Средний коэффициент серьезной инфекции в этой популяции пациентов с RА был 4,66 на 100 пациентов-лет, который является более низким, чем коэффициент инфекций, требующий госпитализации в случае пациентов с RА (9,57 на 100 пациентов-лет), сообщенный в эпидемиологическом исследовании на основе сообщества (Doran et al. Arthritis Rheum 46:2287-93 (2002)).

Сообщенный профиль безопасности Ритуксимаба у небольшого количества пациентов с неврологическими нарушениями, включающими аутоиммунную невропатию (Pestronk et al. J. Neurol Neurosurg Psychiatry 74:485-9 (2003)), синдром опсоклонуса-миоклонуса (Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppl1) PO5.128:A395 (2003)) и RRMS (Cross et al. Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS (abstact) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis 20-1 (2003)), был сходным с профилем, о котором сообщалось в онкологии или при лечении RА. В продолжающемся спонсируемом исследователем испытании (IST) Ритуксимаба в комбинации с интерфероном-бета (IFN-бета) или глатирамерацетатом у субъектов с RRMS (Cross et al., см. выше) 1 из 10 подвергнутых лечению субъектов госпитализировали для ночного наблюдения после того как он испытал умеренную лихорадку и озноб после первой инфузии Ритуксимаба, тогда как 9 субъектов завершили схему с четырьмя инфузиями без каких-либо сообщенных неблагоприятных событий.

Патенты и публикации патентов, относящихся к антителам против CD20, включают в себя Патенты США № 5776456, 5736137, 5843439, 6399061 и 6682734, а также US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885 (Anderson et al.); Патент США № 6455043, US 2003/0026804 и WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez and White); WO 2000/27433 и US 2004/0213784 (Grillo-Lopez and Leonard); WO 2000/44788 (Braslawsky et al.); WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WО 01/10461 (Rastetter and White); WO 2001/10460 (White and Grillo-Lopez); US 2001/0018041, US 2003/0180292, WO 2001/34194 (Hanna and Hariharan); US 2002/0006404 и WO 2002/04021 (Hanna and Hariharan); US 2002/0012665 и WO 2001/74388 (Hanna, N.); US 2002/0058029 (Hanna, N.); US 2003/0103971 (Hariharan and Hanna); US 2002/0009444 и WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858 (White, C.); US 2002/0128488 и WO 2002/34790 (Reff, M.); WO 2002/060955 (Braslawsky et al.); WO 2002/096948 (Braslawsky et al.); WO 2002/079255 (Reff and Davies); US Patent № 6171586 и WO 1998/56418 (Lam et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 (Raju, S.); WO 1999/51642, Патент США № 6194551, Патент США № 6242195, Патент США № 6528624 и Патент США № 6538124 (Idusogie et al.); WO 2000/42072 (Presta, L.); WO 2000/67796 (Curd et al.); WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et al.); US 2002/0004587 и WO 2001/77342 (Miller and Presta); US 2002/0197256 (Grewal, I.); US 2003/0157108 (Presta, L.); WO 04/056312 (Lowman et al.); US 2004/0202658 и WO 2004/091657 (Benyunes, K.); WO 2005/000351 (Chan, A.); US 2005/0032130A1 (Beresini et al.); US 2005/0053602A1 (Brunetta, P.); Патенты США №№ 6565827, 6090365, 6287537, 6015542, 5843398 и 5595721, (Kaminski et al.); Патенты США №№ 5500362, 5677180, 5721108, 6120767 и 6652852 (Robinson et al.); Патент США № 6410391 (Raubitschek et al.); Патент США № 6224866 и WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); US2005/0079174A1 (Barbera-Guillem et al.); WO 2000/67795 (Goldenberg); US 2003/0133930 и WO 2000/74718 (Goldenberg and Hansen); US 2003/0219433 и WO 2003/68821 (Hansen et al); W02004/058298 (Goldenberg and Hansen); WO 2000/76542 (Golay et al.); WO 2001/72333 (Wolin and Rosenblatt); Патент США № 6368596 (Ghetie et al.); Патент США № 6306393 и US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); US 2003/0026801 (Weiner and Hartmann); WO 2002/102312 (Engleman, E.); US 2003/0068664 (Albitar et al.); WO 2003/002607 (Leung, S.); WO 2003/049694, US 2002/0009427 и US 2003/0185796 (Wolin et al.); WO 2003/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 (Bohen et al.); US 2003/0219433 и WO 2003/068821 (Hansen et al.); US 2003/0219818 (Bohen et al.); US2002/0136719 (Shenoy et al.); WO 2004/032828 (Wahl et al.); и WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter). См. также патенты США 5849898 и EP 330191 (Seed et al.); EP332865A2 (Meyer and Weiss); Патент США № 4861579 (Meyer et al.); US2001/0056066 (Bugelski et al.); WO 1995/03770 (Bhat et al.); US 2003/0219433 Al (Hansen et al.); WO 2004/035607 (Teeling et al.); US 2004/0093621 (Shitara et al.); WO 2004/103404 (Watkins et al.); WO 2005/000901 (Tedder et al.); US 2005/0025764 (Watkins et al.); WO 2005/016969 и US 2005/0069545 A1 (Carr et al.); WO 2005/014618 (Chang et al.). Некоторые из них включают в себя, inter alia, лечение рассеянного склероза.

Публикации, касающиеся терапии с использованием Ритуксимаба, включают в себя: Perotta и Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88В (1998); Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4):952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001); Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with В lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): 5370 (2001); Leandro et al. "An open study of В lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete В lymphocytes" Rhematology 40:205-211 (2001); Edwards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans., 30(4):824-828 (2002); Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. "Efficacy of selective В cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002); Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with Rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with Rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Specks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism 44(12):2836-2840 (2001); Anolik et al., "B lympocyte Depletion in the Treatment of Systemic Lupus (SLE): Phase I/II Trial of Rituximab (RITUXAN®) in SLE" Arthritis And Rheumatism, 46(9), S289-S289 Abstract 717 (October, 2002), and Albert et al., "A Phase I Trial of Rituximab (Anti-CD20) for Treatment of Systemic Lupus Erythematosus" Arthritis And Rheumatism, 48(12): 3659-3659, Abstract LB9 (December, 2003); Martin and Chan "Pathogenic Roles of В cells in Human Autoimmunity: Insights from the Clinic" Immunity 20:517-527 (2004).

Раскрытие изобретения

Данное изобретение включает в себя, по меньшей мере частично, выбор дозы для анти-CD20-антитела, которая обеспечивает безопасную и активную схему лечения субъектов с рассеянным склерозом, таким как PPMS или RRMS.

Таким образом, данное изобретение относится к способу лечения рассеянного склероза у субъекта, предусматривающему введение эффективного количества CD20-антитела субъекту для обеспечения начального воздействия антитела в количестве приблизительно 0,5-4 г с последующим вторым воздействием антитела приблизительно 0,5-4 г, причем это второе воздействие антитела не проводят до приблизительно 16-60 недель после начального воздействия антитела, и каждое из воздействий антитела проводят субъекту в виде одной или двух доз антитела.

Кроме того, данное изобретение относится к изделию, содержащему: (а) контейнер, содержащий CD20-антитело; и (b) вкладыш упаковки с инструкциями в отношении лечения рассеянного склероза у субъекта, где эти инструкции указывают, что субъекту вводят количество антитела, которое является эффективным для проведения начального воздействия антитела в количестве приблизительно 0,5-4 г с последующим вторым воздействием антитела в количестве приблизительно 0,5-4 г, причем это второе воздействие антитела не проводят до приблизительно 16-60 недель после начального воздействия антитела, и каждое из воздействий антитела проводят субъекту в виде одной или двух доз антитела.

Краткое описание чертежей

Фиг.1А обозначает сопоставление последовательностей, сравнивающее аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи (V_L) каждого из мышиного 2Н7 (SEQ ID NO:1), гуманизированного варианта 2Н7.v16 (SEQ ID NO:2) и подгруппы I легкой каппа-цепи человека (SEQ ID NO:3). CDR V_L 2Н7 и hu2Н7.v16 являются следующими: CDR1 (SEQ ID NO:4), CDR2 (SEQ ID NO:5) и CDR3 (SEQ ID NO:6).

Фиг.1В обозначает сопоставление последовательностей, сравнивающее аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (V_Н) каждого из мышиного 2Н7 (SEQ ID NO:7), гуманизированного варианта 2Н7.v16 (SEQ ID NO:8) и консенсусной последовательности человека подгруппы III тяжелой цепи (SEQ ID NO:9). CDR V_Н 2Н7 и hu2Н7.v16 являются следующими: CDR1 (SEQ ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:11) и CDR3 (SEQ ID NO:12).

На фиг.1А и фиг.1В CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой цепи заключены в скобки, фланкированы каркасными районами FR1-FR4, как указано. 2Н7 относится к мышиному антителу 2Н7. Звездочки между двумя рядами последовательностей указывают положения, которые различаются между этими двумя последовательностями. Нумерация остатков соответствует Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), с инсерциями, показанными как а, b, c, d и е.

Фиг.2 показывает аминокислотную последовательность легкой цепи зрелого 2Н7.v16 (SEQ ID NO:13).

Фиг.3 показывает аминокислотную последовательность тяжелой цепи зрелого 2Н7.v16 (SEQ ID NO:14).

Фиг.4 показывает аминокислотную последовательность тяжелой цепи зрелого 2Н7.v31 (SEQ ID NO:15). L-цепь 2Н7.v31 является такой же, что и для 2Н7.v16.

Фиг.5 показывает сопоставление легких цепей зрелых 2Н7.v16 и 2Н7.v511 (SEQ ID NO:13 и 16 соответственно) с нумерацией Kabat остатков вариабельного домена и нумерацией Eu остатков константного домена.

Фиг.6 показывает сопоставление тяжелых цепей зрелых 2Н7.v16 и 2Н7.v511 (SEQ ID NO:14 и 17 соответственно) с нумерацией Kabat остатков вариабельного домена и нумерацией Eu остатков константного домена.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

I. Определения

В-клетка является лимфоцитом, который созревает в костном мозге и включает необученную В-клетку, В-клетку памяти или эффекторную В-клетку (плазматическую клетку, плазмацит). Здесь В-клетка может быть нормальной или незлокачественной В-клеткой.

«Маркер поверхности В-клетки» или «поверхностный антиген В-клетки» обозначает в данном контексте антиген, экспрессируемый на поверхности В-клетки, который может быть мишенью антитела, которое связывается с ним. Примеры поверхностных маркеров В-клеток включают в себя поверхностные маркеры лейкоцитов CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CDw79а, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (в отношении описаний см. The Leukocyte Antigen Facts Book, 2^nd Edition, 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Другие поверхностные маркеры В-клеток включают в себя RP105, FcRH2, CR2 В-клеток, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA и 239287. Маркер В-клеточной поверхности, представляющий здесь особый интерес, преимущественно экспрессируется на В-клетках в сравнении с другими не-В-клеточными тканями млекопитающего и может экспрессироваться как на предшественниках В-клеток, так и на зрелых В-клетках. Предпочтительным поверхностным маркером В-клеток является здесь предпочтительно CD20.

Антиген «CD20», или «CD20», является негликозилированным фосфобелком 35 кДа, обнаруживаемым на поверхности более чем 90% В-клеток из периферической крови или лимфоидных органов. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на злокачественных В-клетках, но не экспрессируется на стволовых клетках. Другие названия CD20 в литературе включают в себя “консервативный антиген В-лимфоцитов” и “Вр35”. Антиген CD20 описан, например, в Clark et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766 (1985).

“Антитело-антагонист” обозначает здесь антитело, которое, после связывания с маркером поверхности В-клетки на В-клетках, разрушает или истощает В-клетки у млекопитающего и/или подавляет одну или несколько функций В-клеток, например, уменьшением или предотвращением гуморальной реакции, индуцируемой этой В-клеткой. Антитело-антагонист предпочтительно способно истощать В-клетки (т.е. уменьшать циркулирующие уровни В-клеток) в млекопитающем, обработанным этим антителом. Такое истощение может быть достигнуто посредством различных механизмов, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индукция смерти В-клеток (например, через апоптоз).

«Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и «ADCC» относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NК-клетки), нейтрофилы и макрофаги) узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис этой клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на стр. 464 Ravetсh and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть выполнен анализ ADCC in vitro, такой как описанный в Патенте США № 5500362 или 5821337. Применимые для таких анализов эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NК-клетки). Альтернативно или наряду с этим ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, в модели животного, такой как описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Эффекторные клетки человека» являются лейкоцитами, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторную функцию. Предпочтительно, эти клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NК-клетки), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; причем предпочтительными являются PBMC и NК-клетки.

Термины “Fc-рецептор” или “FcR” используют для описания рецептора, который связывается с Fc-районом антитела. Предпочтительным FcR является нативная последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительным является FcR, который связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор) и включает в себя подклассы FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают в себя FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые различаются прежде всего в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIВ содержит мотив ингибирования иммунорецептора на основе тирозина (ITIM) в его цитоплазматическом домене (см. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR рассматриваются в Ravetch и Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457-921 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). FcR, в том числе те, которые должны быть идентифицированы в будущем, включены здесь под термином «FcR». Этот термин включает в себя также рецептор новорожденных, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al. J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al. J. Immunol. 24:249 (1994)).

«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента начинается со связывания первого компонента системы комплемента С1q с молекулой (например, антителом), находящейся в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен CDC-анализ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

«Ингибирующие рост антитела» являются антителами, которые предотвращают или уменьшают пролиферацию клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается это антитело. Например, антитело может предотвращать или уменьшать пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

Антителами, которые «индуцируют апоптоз», являются антитела, которые индуцируют программированную смерть клеток, например В-клетки, как определено стандартными анализами апоптоза, такими как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сморщивание клеток, расширение эндоплазматического ретикулума, фрагментация клеток и/или образование мембранных пузырьков (называемых апоптотическими телами).

Термин “антитело” используется в данном контексте в самом широком смысле слова и он конкретно включает в себя моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность.

«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его район связывания антигена. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Для целей данного изобретения “интактное антитело” обозначает антитело, содержащее вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также Fc-район.

“Нативные антитела” являются обычно гетеротетрамерными гликопротеинами приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также дисульфидные мостики внутри цепи на регулярных расстояниях друг от друга. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на ее другом конце; константный домен легкой цепи сопоставлен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи сопоставлен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин “вариабельный” относится к тому факту, что некоторые части вариабельных доменов в значительной степени различаются по их последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако эта вариабельность не распределена равномерно по вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными районами в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными районами (FR). Вариабельные домены нативных тяжелой и легкой цепей, каждый, содержат четыре FR, принимающих в значительной степени конфигурацию β-складки, соединенных тремя гипервариабельными районами, которые образуют петли, соединяющие эту β-структуру, и в некоторых случаях образующие часть этой β-структуры. Гипервариабельные районы в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости этими FR и с гипервариабельными районами из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

Расщепление папаином антител дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый из которых имеет единственный антигенсвязывающий сайт, и остальной «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')₂-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен перекрестно связывать антиген.

«Fv» является минимальным фрагментом антитела, который содержит полный антиген-узнающий и антигенсвязывающий сайт. Этот район состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в плотной, нековалентной связи. Именно в этой конфигурации три гипервариабельных района каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антигенсвязывающего сайта на поверхности V_H-V_L-димера. Вместе эти шесть гипервариабельных районов сообщают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных района, специфических в отношении антигена) способен узнавать и связывать антиген, хотя и при более низкой аффинности, чем полный сайт связывания.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков к карбоксильному концу тяжелой цепи СН1 домену, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH является здесь обозначением Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. Фрагменты антитела F(ab')₂ первоначально были получены в виде пары Fab'-фрагментов, которые имеют между ними цистеины шарнирной области. Известны также другие химические сочетания фрагментов антител.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночного могут быть отнесены к одному из двух явно отличающихся типов, названных каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей антитела могут быть отнесены к различным классам. Имеются пять основных классов интактных антител: IgА, IgD, IgЕ и IgМ, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgА и IgА2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют этим различным классам антител, называют α, δ, ε, γ и µ соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv»-фрагменты антител содержат V_H- и V_L-домены антитела, где эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. Предпочтительно этот Fv-полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В отношении обзора scFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H-V_L). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи, эти домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более полно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело» относится в данном контексте к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов, которые могут возникать во время получения моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают в себя различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на данном антигене. Кроме их специфичности, моноклональные антитела являются ценными благодаря тому, что они не загрязнены другими иммуноглобулинами. Определение “моноклональное” указывает характер этого антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител и не должно пониматься как требующее получения этого антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., например, Патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Biol. Chem., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела, описанные конкретно здесь, включают в себя «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной с соответствующими последовательностями или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная цепь (цепи) является идентичной с соответствующими последовательностями или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность (Патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющие здесь интерес антитела включают в себя «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из примата, отличного от человека (например, низших узконосых обезьян, таких как павиан, макака-резус или собакоподобная обезьяна), и последовательности константной области человека (Патент США № 5693780).

«Гуманизированными» формами антител, не принадлежащих человеку (например, мышиные), являются химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Большей частью гуманизированными антителами являются иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области вида, отличного от человека (донорского антитела), такого как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющие желаемую специфичность, аффинность и эффективность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками каркасной области иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорском антителе. Эти модификации производят для дополнительного улучшения эффективности антител. Обычно гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, а все или по существу все из этих FR являются FR последовательности иммуноглобулина человека, за исключением замены (замен) FR, как отмечалось выше. Гуманизированное антитело будет также необязательно содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, обычно часть константной области иммуноглобулина человека. В отношении дополнительных подробностей см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин «гипервариабельный район» относится в данном контексте к аминокислотным остаткам антитела, которые являются ответственными за связывание антигена. Гипервариабельный район содержит аминокислотные остатки из «определяющего комплементарность района» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) и/или остатки из “гипервариабельной петли” (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). «Каркасные» остатки или остатки «FR» являются остатками вариабельного домена, другими, чем остатки гипервариабельной области, определенные здесь.

«Несвязанное антитело» является антителом (определенным здесь), которое не конъюгировано с гетерологичной молекулой, такой как цитотоксическая часть молекулы или радиоактивная метка.

Примеры антител, которые связывают антиген CD20, включают в себя: «С2В8», который теперь называют «Ритуксимаб» (“RITUXAN®”) (Патент США № 5736137); иттрий-[90]-меченое мышиное антитело 2В8, обозначенное “Y2B8” или «Ибритумомаб Тиуксетан» (ZEVALIN®), коммерчески доступный из IDEC Pharmaceuticals, Inc. (Патент США № 5736137; 2В8, депонированный АТСС под номером доступа НВ11388 22 июня 1993 года); мышиный IgG2а «В1», также называемый «Тоситумомабом», необязательно меченный ¹³¹I с получением антитела “¹³¹I-В1” или «иод I131 тоситумомаб» (BEXXAR™), коммерчески доступного из Corixa (см. также Патент США № 5595721); мышиное моноклональное антитело “1F5” (Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987) и его варианты, в том числе «имеющий «очажки» каркасной области» или гуманизированный 1F5 (WO03/002607, Leung, S.; депозит ATCC НВ-96450); мышиное антитело 2Н7 и химерное антитело 2Н7 (Патент США № 5677180); гуманизированное антитело 2Н7; huMax-CD20 (Genmab, Denmark, WO2004/035607); АМЕ-133 (Applied Molecular Evolution); антитело А20 или его варианты, такие как химерное или гуманизированное антитело А20 (сА20, hA20 соответственно) или IMMU-106 (Патент США 2003/0219433, Immunomedics); CD20-связывающие антитела, в том числе эпитоп-истощенные Leu-16, 1H4 или 2В8, необязательно конъюгированные с IL-2, описанные в Патенте США 2005/0069545А1 и WO 2005/16969 (Carr et al.); биспецифическое антитело, которое связывает CD22 и CD20, например hLL2xhA20 (WO2005/14618, Chang et al.); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1В3, B-C1 или NU-B2 из International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al. Blood 92:184 (1998)); конъюгат анти-CD20-ауристатин Е (Seattle Genetics); анти-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); анти-CD20-MAb-терапевтик (EpiCyte) и анти-CD20-антитело TRU 015 (Trubion).

Термины «Ритуксимаб» или “RITUXAN®” относятся в данном контексте к генетически сконструированному химерному мышь/человек моноклональному антителу, направленному против антигена CD20 и названному «С2В8» в Патенте США № 5736137, в том числе к его фрагментам, которые сохраняют способность связывать CD20. Ритуксимаб коммерчески доступен из Genentech.

Только для целей данного изобретения и если нет других указаний термин «гуманизированный 2Н7» относится к гуманизированному антителу, которое связывает CD20 человека, или его антигенсвязывающему фрагменту, где это антитело является эффективным в истощении В-клеток приматов in vivo, причем это антитело содержит в вариабельном районе его Н-цепи (V_H) по меньшей мере последовательность CDR Н3 SEQ ID NO:12 (фиг. 1В) из антитела против CD20 человека и по существу консенсусные остатки каркасной области (FR) тяжелой цепи подгруппы III человека (V_HIII). В предпочтительном варианте осуществления это антитело дополнительно содержит последовательность CDR Н1 Н-цепи SEQ ID NO:10 и последовательность CDR Н2 SEQ ID NO:11 и более предпочтительно дополнительно содержит CDR L1 L-цепи SEQ ID NO:4, последовательность CDR L2 SEQ ID NO:5, последовательность CDR L3 SEQ ID NO:6 и по существу консенсусные остатки каркасной области (FR) легкой цепи подгруппы I человека (VI), где V_H-район может быть присоединен к константной области цепи IgG человека, где этим районом может быть, например, IgG1 или IgG3. В предпочтительном варианте осуществления такое антитело содержит последовательность V_H SEQ ID NO:8 (v16, как показано на фиг. 1В), необязательно также содержит последовательность V_L SEQ ID NO:2 (v16, как показано на фиг.1А), которые могут иметь аминокислотные замены D56A и N100A в Н-цепи и S92A в L-цепи (v96). Предпочтительно это антитело является интактным антителом, содержащим аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO:13 и 14 соответственно, показанные на фиг.2 и 3. В другом предпочтительном варианте осуществления этим антителом является антитело 2Н7.v31, содержащее аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO:13 и 15 соответственно, показанные на фиг.2 и 4. Это антитело может здесь дополнительно содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-районе, которая улучшает ADCC- и/или CDC-активность, например антитело, в котором этими аминокислотными заменами являются S298A/E333A/K334A, более предпочтительно 2Н7.v31, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:15 (показанную на фиг.4). Любое из этих антител может дополнительно содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-районе, которая уменьшает CDC-активность, например, содержащее по меньшей мере замену К322А. См. Патент США № 6528624В1 (Idusogie et al.).

Предпочтительным гуманизированным 2Н7 является интактное антитело или фрагмент антитела, содержащие вариабельную последовательность легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:2)

и вариабельную последовательность тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8).

Если гуманизированное антитело 2Н7 является интактным антителом, предпочтительно оно содержит аминокислотную последовательность легкой цепи:

и аминокислотную последовательность тяжелой цепи:

или аминокислотную последовательность тяжелой цепи:

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения вариабельный район вариантов на основе 2Н7 версии 16 будет иметь аминокислотные последовательности v16, за исключением последовательностей в положениях аминокислотных замен, которые показаны в таблице ниже. Если нет других указаний, варианты 2Н7 будут иметь ту же самую легкую цепь, что и легкая цепь v16.

Версия 2Н7 Изменения тяжелой цепи (V_H) изменения легкой цепи (V_L) Изменения Fc 31 - - S298A, E333A, K334A 96 D56A, N100A S92A   114 D56A, N10 M32L, S92A S298A, E333A, K334A 115 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, E356D, M358L

“Выделенным” антителом является антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются вещества, которые могли бы препятствовать диагностическим или терапевтическим применениям этого антитела, и они могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления это антитело будет очищенным (1) до более чем 95 мас.% антитела, как определено по способу Лоури, и наиболее предпочтительно до более чем 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора с вращающейся чашкой или (3) до гомогенности при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя Кумасси синего или предпочтительно содержащего серебро носителя. Выделенное антитело включает в себя антитело in situ в рекомбинантных клетках, так как по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенное антитело получают с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

“Субъектом” называют в данном контексте субъекта-человека. Обычно этот субъект является подходящим для лечения по поводу рассеянного склероза. Для целей данного изобретения такой подходящий субъект является субъектом, который испытывает, испытывал или имеет риск испытания одного или нескольких признаков, симптомов или других показателей рассеянного склероза; был диагностирован как имеющий рассеянный склероз, независимо от того, например, диагностирован ли он только что (с “новым появлением” МС), диагностирован ли ранее с новым рецедивом или обострением, диагностирован ли ранее и находится в состоянии ремиссии и т.д. и/или имеет риск развития рассеянного склероза. Субъект, страдающий от рассеянного склероза или имеющий риск рассеянного склероза, может быть необязательно идентифицирован как субъект, который был подвергнут скринингу на повышенные уровни CD20-положительных В-клеток в сыворотке, цереброспинальной жидкости (CSF) и/или повреждение (повреждения) МС и/или подвергнут скринингу с использованием анализа для детектирования аутоантител, оцениваемых качественно и предпочтительно количественно. Примеры таких аутоантител, ассоциированных с рассеянным склерозом, включают в себя антитела против миелинового основного белка (МВР), антитела против миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG), антитела против ганглиозида и/или антитела против нейрофиламента. Такие аутоантитела могут быть детектированы в сыворотке субъекта, цереброспинальной жидкости (CSF) и/или повреждениях, обусловленных МС. Под «повышенными» уровнем (уровнями) аутоантител или В-клеток в данном контексте подразумевают уровень (уровни) таких аутоантител или В-клеток, которые значимо превышают уровень (уровни) у индивидуума, не имеющего МС.

«Лечение» субъекта относится здесь как к терапевтическому лечению, так к профилактическим или превентивным мерам. Лица, нуждающиеся в лечении, включают в себя лиц, уже имеющих рассеянный склероз, а также лиц, у которых рассеянный склероз должен быть предотвращен. Таким образом, этот субъект может быть диагностирован как имеющий рассеянный склероз или может быть предрасположенным или восприимчивым к рассеянному склерозу.

«Симптом» МС обозначает любое патологическое событие или отклонение от нормы в структуре, функции или ощущении, испытываемое этим субъектом и являющееся показателем МС.

«Рассеянный склероз» обозначает хроническое и часто приводящее к потере трудоспособности заболевание, характеризующееся прогрессирующей дисфункцией миелина. Имеются четыре международно признанных формы МС, первичный прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS), рецидивирующий-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS), вторичный прогрессирующий рассеянный склероз (SPMS) и прогрессирующий рецидивирующий рассеянный склероз (PRMS).

«Первичный прогрессирующий рассеянный склероз” или “PPMS” характеризуется постепенным развитием этого заболевания от его появления без накладывающихся друг на друга рецидивов и ремиссий. В нем могут быть периоды сглаживания активности заболевания и в нем могут быть хорошие и плохие дни или недели. PPMS отличается от RRMS и SPMS тем, что его появление обычно происходит в возрасте поздних тридцати или поздних сорока лет, он развивается как у мужчин, так и у женщин, и исходная активность заболевания находится часто в спинном мозге, а не в головном мозге. PPMS часто мигрирует в головной мозг, но с меньшей вероятностью повреждает участки головного мозга, чем RRMS или SPMS; например, у людей с PPMS с меньшей вероятностью развиваются когнитивные проблемы. PPMS является подтипом МС, который наименее вероятно обнаруживает воспалительные (с повышенным накоплением гадолиния) повреждения на сканирующих изображениях ядерно-магнитной диагностики (MRI). Эта первичная прогрессирующая форма заболевания поражает 10-15% всех людей с рассеянным склерозом. PPMS может быть определен в соответствии с критериями, приведенными в McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001). Субъектом с PPMS, подвергаемым лечению в данном контексте, является обычно субъект с вероятным или определенным диагнозом PPMS.

«Рецидивирующий-ремиттирующий склероз” или “RRMS” характеризуется рецидивами (также известными как обострения), во время которых могут появляться новые симптомы и возобновляться или ухудшаться старые симптомы. За рецидивами следуют периоды ремиссии, во время которых субъект полностью или частично восстанавливается от недостаточностей, приобретенных во время рецидива. Рецидивы могут длиться в течение нескольких дней, недель или месяцев, и восстановление может быть медленным и постепенным или почти мгновенным. Огромное большинство людей, проявляющих МС, сначала диагностируются как имеющие RRMS. Это происходит, когда они находятся в возрасте двадцати-тридцати с лишним лет, хотя известны диагнозы в гораздо более раннем или более позднем возрасте. Вдвое больше женщин, чем мужчин, проявляют этот подтип МС. Во время рецидивов миелин, защитная изолирующая оболочка вокруг нервных волокон (нейронов) в областях белого вещества центральной нервной системы (ЦНС), может повреждаться в воспалительной реакции собственной иммунной системы организма. Это вызывает большое разнообразие неврологических симптомов, которые значительно варьируются в зависимости от того, какие области ЦНС являются поврежденными. Непосредственно после рецидива воспалительная реакция исчезает, и особый тип глиальных клеток в ЦНС (называемых олигодендроцитами) организует ремиелинизацию - процесс, посредством которого миелиновая оболочка вокруг аксона может быть восстановлена. Именно эта ремиелинизация может быть ответственной за ремиссию. Приблизительно 50% пациентов с RRMS превращаются в пациентов с SPMS в пределах 10 лет от появления заболевания. После 30 лет эта цифра достигает 90%. В любой момент времени рецидивирующая-ремиттирующая форма этого заболевания ответственна за приблизительно 55% всех случаев у людей с МС.

«Вторичный прогрессирующий рассеянный склероз» или “SPMS” характеризуется постоянным прогрессированием клинического неврологического повреждения с накладывающимися друг на друга рецидивами и минорными ремиссиями и плато или без них. Люди, у которых развивается SPMS, ранее испытывали период RRMS, который длился от двух до сорока или более лет. Любые накладывающиеся друг на друга рецидивы и ремиссии имеют тенденцию затухать на протяжении времени. С момента появления вторичной прогрессирующей фазы этого заболевания нетрудоспособность начинает прогрессировать более быстро, чем она прогрессировала во время RRMS, хотя это прогрессирование может быть все еще медленным у некоторых индивидуумов. После 10 лет 50% людей с RRMS будут иметь развившийся SPMS. За 25-30 лет эта цифра повысится до 90%. SPMS имеет тенденцию ассоциироваться с более низкими уровнями образования воспалительных повреждений, чем RRMS, но общая тяжесть заболевания продолжает прогрессировать. В любой момент времени SPMS является ответственным за приблизительно 30% случаев у всех людей с рассеянным склерозом.

«Прогрессирующий рецидивирующий рассеянный склероз» или “PRMS” характеризуется постоянным прогрессированием клинического неврологического повреждения с накладывающимися друг на друга рецидивами и ремиссиями. Происходит существенное восстановление непосредственно после рецидива, но между рецидивами имеется постепенное ухудшение симптомов. PRMS поражает приблизительно 5% всех людей с рассеянным склерозом. Некоторые неврологи считают, что PRMS является разновидностью PPMS.

Выражение «эффективное количество» относится к количеству антитела (или другого лекарственного средства), которое является эффективным для предупреждения, уменьшения интенсивности симптомов или лечения рассеянного склероза. Такое эффективное количество будет обычно приводить к улучшению в признаках, симптомах или других показателях МС, таких как уменьшение скорости рецидивов, предотвращение нетрудоспособности, уменьшение количества и/или объема MRI-повреждений головного мозга, улучшение рассчитанной по времени прогулки длиной 25 футов, пролонгирование времени до прогрессирования заболевания (например, с использованием шкалы Статуса развившейся нетрудоспособности (Expanded Disability Status Scale, EDSS)), и т.д.

Термин «воздействие антитела» обозначает здесь контактирование с антителом или воздействие антитела в одной или нескольких дозах, вводимых на протяжении периода времени приблизительно 1-20 дней. Эти дозы могут вводиться один раз или при фиксированных или нерегулярных временных интервалах на протяжении этого периода воздействия антитела. Начальное и последнее (например, второе или третье) воздействие антитела отделены во времени одно от другого, как подробно описано здесь.

Термин «иммуносупрессивный агент», используемый здесь для вспомогательной терапии, относится к веществам, которые действуют для супрессии или маскирования иммунной системы млекопитающего, которому их предоставляют. Этот термин включает в себя вещества, которые подавляют продуцирование цитокинов, отрицательно регулируют или подавляют экспрессию аутоантигена или маскируют антигены МНС. Примеры таких агентов включают в себя 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. Патент США № 4665077); нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID); ганцикловир, такролимус, глюкокортикоиды, такие как кортизол или альдостерон, противовоспалительные агенты, такие как ингибитор циклооксигеназы, ингибитор 5-липоксигеназы или антагонист рецептора лейкотриена; пуриновые антагонисты, такие как азатиоприн или микофенолат мофетил (MMF); алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид; бромокриптин; даназол; дапсон; глутаровый альдегид (который маскирует антигены МНС, как описано в Патенте США № 4120649); антиидиотипические антитела для антигенов МНС и фрагментов МНС; циклоспорин А; стероиды, такие как кортикостероиды или глюкокортикостероиды или аналоги глюкокортикоидов, например преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон; ингибиторы дигидрофолатредуктазы, такие как метотрексат (пероральный или подкожный); гидроксихлорохин; сульфасалазин; лефлуномид; цитокин или антагонисты рецепторов цитокинов, в том числе анти-интерферон-альфа, -бета, или гамма-антитела, антитела против фактора некроза опухолей (инфликсимаб или адалимумаб), анти-TNF-альфа-иммуноадгезин (этанерцепт), антитела против фактора некроза опухолей бета, анти-IL-2-антитела и анти-IL-2-рецептор-антитела; анти-LFA-1-антитела, в том числе анти-CD11а- и анти-CD18-антитела; анти-L3T4-антитела; гетерологичный антилимфоцитарный глобулин; pan-Т-антитела, предпочтительно анти-CD3- или анти-CD4/CD4а-антитела; растворимый пептид, содержащий LFA-3-связывающий домен (WO 90/08187, опубликованный 7/26/90); стрептокиназу; TGF-бета; стрептодорназу; РНК или ДНК из хозяина; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалин; рапамицин; Т-клеточный рецептор (Cohen et al., Патент США № 5114721); фрагменты Т-клеточного рецептора (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989) и WO 91/01133) и антитела против Т-клеточного рецептора (ЕР 340109), такие как Т10В9.

Термин «цитотоксический агент» относится в данном контексте к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Этот термин включает в себя радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², Р³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты.

«Химиотерапевтическим агентом» является химическое соединение, применимое в лечении рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают в себя алкилирующие агенты, такие как тиотепа и CYTOXAN® циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармуцин (в том числе синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги иприта, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретаминоксида, мелфалан; новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил-аналог иприта; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма 1I и калихеамицин омега I1 (см., например, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромофоры хромопротеиновых энедииновых антибиотиков), алкациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN® (в том числе морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметотрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналин, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнители фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK® полисахаридный комплекс (JHS Natural Produсts, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндесин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (“Ara-C”); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™, не содержащая кремофора, альбумин-сконструированная композиция наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из приведенных выше лекарственных средств.

В это определение включены также антигормональные агенты, которые действуют регулирующим или ингибирующим образом на действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), в том числе, например, тамоксифен (в том числе тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует продуцирование эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARMIDEX®; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и госерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый аналог нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, таких как, например PKC-альфа, Ralf и H-Ras; вакцины, такие как вакцины генотерапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; ингибитор топоизомеразы 1 LUPROTECAN®; rmRH ABARELIX® и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из приведенных выше лекарственных средств.

Термин “цитокин” является общим термином для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины; интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некроза опухолей, такой как TNF-α или TNF-β; и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и kit-лиганд (KL). В данном контексте термин цитокин включает в себя белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с природной последовательностью, в том числе синтетически полученные низкомолекулярные частицы и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

Термин “гормон” относится к полипептидным гормонам, которые в основном секретируются железистыми органами с протоками. В термин гормоны включены, например, гормон роста, такой как гормон роста человека, N-метионил-гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); пролактин; плацентарный лактоген, мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид, ингибин; активин; мюллерово ингибирующее вещество и тромбопоэтин. В данном контексте термин гормон включает в себя белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты гормона с природной последовательностью, в том числе синтетически полученные низкомолекулярные частицы и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

Термин «фактор роста» относится к белкам, которые стимулируют рост и включают в себя, например, фактор роста печени; фактор роста фибробластов; васкулярный эндотелиальный фактор роста; факторы роста нервов, такие как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулинподобные факторы роста I и II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ, и колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарный-макрофагальный CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный CSF (G-CSF). В данном контексте термин фактор роста включает в себя белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты гормона с природной последовательностью, в том числе синтетически полученные низкомолекулярные частицы и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

Термин «интегрин» относится к рецепторному белку, который позволяет клеткам как связываться с внеклеточным матриксом, так и отвечать на внеклеточный матрикс и участвует в разнообразных клеточных функциях, таких как заживление ран, дифференцировка клеток, «хоминг» опухолевых клеток и апоптоз. Они являются частью большого семейства клеточных адгезионных рецепторов, которые участвуют во взаимодействиях клетка-внеклеточный матрикс и клетка-клетка. Функциональные интегрины состоят из двух трансмембранных гликопротеиновых субъединиц, названных альфа и бета, которые являются нековалентно связанными. Альфа-субъединицы, все, имеют некоторую гомологию относительно друг друга, как и бета-субъединицы. Эти рецепторы всегда содержат одну альфа-цепь и одну бета-цепь. Примеры включают в себя Альфа6бета1, Альфа3бета1, Альфа7бета1, LFA-1, альфа-4-интегрин и т.д. В данном контексте термин интегрин включает в себя белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты гормона с природной последовательностью, в том числе синтетически полученные низкомолекулярные частицы и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

Примеры «антагонистов или антител интегринов» включают в себя здесь антитело против LFA-1, такое как Эфализумаб (RAPTIVA®), коммерчески доступный от Genentech; антитело против альфа-4-интегрина, такое как натализумаб (TYSABRI®), доступное от Biogen; диазациклические производные фенилаланина (WO 2003/89410); производные фенилаланина (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 и WO 2003/53926); производные фенилпропионовой кислоты (WO 2003/10135); производные енамина (WO 2001/79173); производные пропановой кислоты (WO 2000/37444); производные алкановой кислоты (WO 2000/32575); замещенные фенилпроизводные (Патенты США с номерами 6677330 и 6348463); производные ароматических аминов (Патент США № 6369229) и полипептид домена дизинтегрина ADAM (Патент США 2002/0042368), антитела к интегрину альфа5бета3 (ЕР 633945); соединенные аза-мостиковой связью бициклические производные аминокислот (WO 2002/02556) и т.д.

Для описанных здесь целей термин «фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа)» относится к молекуле TNF-альфа человека, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) или Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985).

«Ингибитором TNF-альфа» является в данном контексте агент, который ингибирует, до некоторой степени, биологическую функцию TNF-альфа, обычно посредством связывания с TNF-альфа и нейтрализации его активности. Примерами ингибиторов TNF, конкретно расматриваемых здесь, являются Этанерцепт (ENBREL®), Инфликсимаб (REMICADE®) и Адалимумаб (HUMIRA™).

Примеры «модифицирующих заболевание антиревматических лекарственных средств» или “DMARD” включают в себя гидроксиклорохин, сульфасалазин, метотрексат, лефлуномид, этанерцепт, инфликсимаб (плюс пероральный и подкожный метотрексат), азатиоприн, D-пеницилламин, Золото (пероральное), Золото (внутримышечное), миноциклин, циклоспорин, иммуноадсорбцию белка А стафилокока, в том числе их соли и производные, и т.д.

Примерами «нестероидных противовоспалительных лекарственных средств» или “NSAID” являются ацетилсалициловая кислота, ибупрофен, напроксен, индометацин, сулиндак, толметин, в том числе их соли и производные, и т.д.

«Кортикостероидом» называют любое из нескольких синтетических или природно встречающихся веществ с общей химической структурой стероидов, которые имитируют или увеличивают действия природно встречающихся кортикостероидов. Примеры синтетических кортикостероидов включают в себя преднизон, преднизолон (в том числе метилпреднизолон), дексаметазон, глюкокортикоид и бетаметазон.

«Вкладыш упаковки» является инструкциями, обычно включаемыми в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, введении, противопоказаниях, других терапевтических продуктах, которые могут комбинироваться с продуктом упаковки, и/или предостережения, касающиеся применения таких терапевтических продуктов, и т.д.

II. Терапия

Данное изобретение обеспечивает способ лечения рассеянного склероза у субъекта, страдающего от него, предусматривающий введение эффективного количества антитела, которое связывается с маркером поверхности В-клеток (предпочтительно антитела против CD20), этому субъекту. МС, который должен подвергаться лечению, включает в себя первичный прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS), рецидивирующий-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS), вторичный прогрессирующий рассеянный склероз (SPMS) и прогрессирующий рецидивирующий рассеянный склероз (PRMS), но предпочтительными вариантами осуществления здесь являются PPMS или RRMS.

Согласно предпочтительному протоколу введения доз этот способ предусматривает введение эффективного количества антитела против CD20 субъекту с МС для обеспечения начального воздействия антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма (предпочтительно 1,5-2,5 грамма) с последующим вторым воздействием антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма (предпочтительно 1,5-2,5 грамма), причем это второе воздействие антитела не проводят до приблизительно 16-60 недель после начального воздействия антитела. Для целей этого изобретения второе воздействие антитела является следующим моментом, когда этому субъекту вводят антитело против CD20 после начального воздействия антитела, причем между начальным и вторым воздействиями антитела нет промежуточного лечения или промежуточного воздействия антитела против CD20.

Интервал между начальным и вторым или последующими воздействиями антитела может измеряться либо от первой, либо от второй дозы начального воздействия антитела, но предпочтительно его измеряют от первой дозы начального воздействия антитела.

В предпочтительных вариантах осуществления эти воздействия антитела отделены одно от другого приблизительно 24 неделями или 6 месяцами или приблизительно 48 неделями или 12 месяцами.

В одном варианте осуществления второе воздействие антитела не проводят, пока не пройдут приблизительно 20-30 недель от начального воздействия антитела, с последующим необязательным третьим воздействием антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма (предпочтительно приблизительно 1,5-2,5 грамма), причем это третье воздействие антитела не проводят до приблизительно 46-60 недель (предпочтительно приблизительно 46-54 недель) после начального воздействия, и затем предпочтительно не проводят дополнительное воздействие антитела до по меньшей мере приблизительно 70-75 недель после начального воздействия.

В альтернативном варианте осуществления второе воздействие антитела не проводят до приблизительно 46-60 недель после начального воздействия, и последующие воздействия антитела, если они имеются, не проводят до 46-60 недель после предыдущего воздействия антитела.

Любые одно или несколько воздействий антитела могут быть при этом обеспечены в виде единственной дозы антитела или в виде двух раздельных доз антитела (т.е. доз, составляющих первую и вторую дозу). Конкретное количество используемых доз (одна или две) для каждого воздействия антитела зависит, например, от типа подлежащего лечению МС, типа используемого антитела, от того, используется ли второе лекарственное средство и к какому типу относится это второе используемое лекарственное средство, и от способа и частоты введения. При использовании двух раздельных доз вторую дозу вводят предпочтительно в период приблизительно 3-17 дней, более предпочтительно приблизительно 6-16 дней и наиболее предпочтительно приблизительно 13-16 дней после введения первой дозы. При введении двух раздельных доз первая и вторая доза антитела равна предпочтительно приблизительно 0,5-1,5 г, более предпочтительно приблизительно 0,75-1,3 г.

В одном варианте осуществления субъекта подвергают по меньшей мере трем или по меньшей мере четырем воздействиям антитела, например приблизительно 3-60 воздействиям и более предпочтительно приблизительно 3-40 воздействиям, наиболее предпочтительно приблизительно 3-20 воздействиям антитела. Предпочтительно такие воздействия выполняют в интервалах, в каждом случае, приблизительно 24 недели или 6 месяцев или 48 недель или 12 месяцев. В одном варианте осуществления каждое воздействие антитела выполняют в виде единственной дозы антитела. В альтернативном варианте осуществления каждое воздействие антитела выполняют в виде двух доз антитела. Однако не каждое воздействие антитела должно обеспечиваться в виде единственной дозы или в виде двух доз.

Это антитело может быть несвязанным антителом или оно может быть конъюгировано с другой молекулой, такой как цитотоксический агент, например радиоактивное соединение. Предпочтительным антителом здесь является Ритуксимаб, гуманизированное антитело 2Н7 (например, содержащее последовательности вариабельного домена, представленные в SEQ ID NO:2 и 8), или гуманизированное антитело 2Н7, содержащее последовательности вариабельного домена, представленные в SEQ ID NO:23 и 24, или huMax-CD20 (Genmab).

В одном варианте осуществления субъект никогда ранее не лечился лекарственным средством (лекарственными средствами), такими как иммуносупрессивные агенты, для лечения рассеянного склероза и/или никогда ранее не лечился антителом к маркеру поверхности В-клеток (например, никогда ранее не лечился антителом против CD20).

Это антитело вводят любым подходящим способом, в том числе парентеральным, местным, подкожным, внутрибрюшинным, внутрилегочным, интраназальным введением и/или введением в повреждение. Парентеральные инфузии включают в себя внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Обсуждается также внутриоболочечное введение (см., например, Заявку на патент США № 2002/0009444, Grillo-Lopez, A, касающуюся внутриоболочечной доставки антитела против CD20). Кроме того, это антитело может быть удобным образом введено импульсной инфузией, например, с уменьшением доз антитела. Предпочтительно дозы вводят внутривенно, подкожно или внутриоболочечно, наиболее предпочтительно внутривенной инфузией.

Хотя антитело против CD20 может быть единственным лекарственным средством, вводимым субъекту для лечения рассеянного склероза, можно необязательно вводить второе лекарственное средство, такое как цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, иммуносупрессивный агент, цитокин, антагонист цитокина или антитело против цитокина, фактор роста, гормон, интегрин, антагонист интегрина или антитело против интегрина (например, антитело против LFA-1, такое как эфализумаб (RAPTIVA®), коммерчески доступный от Genentech, или антитело против альфа-4-интегрина, такое как натализумаб (TYSABRI®), доступное от Biogen) и т.д., с антителом, которое связывается с маркером поверхности В-клеток (например, антителом против CD20).

В предпочтительном варианте осуществления комбинированной терапии это антитело комбинируют с лекарственным средством класса интерферонов, таким как IFN-бета-1а (REBIF® и AVONEX®) или IFN-бета-1b (BETASERON®), олигопептидом, таким как глатирамерацетат (COPAXONE®); цитотоксическим агентом, таким как митоксантрон (NOVANTRONE®), метотрексат, циклофосфамид, хлорамбуцил, азатиоприн; внутривенным иммуноглобулином (гамма-глобулином); лимфоцит-истощающим терапевтическим средством (например, митоксантроном, циклофосфамидом, Кампатом, анти-CD4, кладрибином, облучением всего тела, трансплантацией костного мозга); кортикостероидом (например, метилпреднизолоном, преднизоном, дексаметазоном или глюкортикоидом), в том числе системным кортикостероидным терапевтическим средством; не истощающим лимфоциты иммуносупрессивным терапевтическим средством (например, микофенолат-мофетилом (MMF) или циклоспорином); лекарственным средством из класса «статинов», понижающим холестерин, которое включает церивастатин (BAYCOL®), флувастатин (LESCOL®), аторвастатин (LIPITOR®), ловастатин (MEVACOR®), правастатин (PRAVACHOL®), симвастатин (ZOCOR®); эстрадиолом; тестостероном (необязательно при повышенных дозах; Stuve et al. Neurology 8:290-301 (2002)); гормональной заместительной терапией; лечением в отношении симптомов, вторичных или связанных с МС (например, мышечной спастичности, недержания, боли, усталости); ингибитором TNF; модифицирующим заболевание антиревматическим лекарственным средством (DMARD); нестероидным противовоспалительным лекарственным средством (NSAID); плазмаферезом; левотироксином; циклоспорином А; аналогом соматостатина; цитокином или антагонистом рецептора цитокина; антиметаболитом; иммуносупрессивным агентом; реабилитационной хирургией; радиоактивным иодом; тиреоидэктомией; другим антагонистом/антителом поверхности В-клеток и т.д.

Второе лекарственное средство вводят с начальным воздействием и/или более поздними воздействиями CD20-антитела, такое комбинированное введение включает в себя совместное введение, использующее отдельные композиции или единую фармацевтическую композицию, и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно имеется период времени, в течение которого оба агента или все активные агенты одновременно проявляют их биологические активности.

Помимо введения антител субъекту, данная заявка рассматривает введение антител посредством генотерапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей это антитело, включено в выражение введения “эффективного количества” антитела. См., например, WO96/07321, опубликованный 14 марта 1996 года, в отношении применения генотерапии для генерирования внутриклеточных антител.

Имеются два основных подхода доставки нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки субъекта: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту инъецируют непосредственно в субъекта, обычно в место, где требуется это антитело. Для обработки ex vivo клетки субъекта извлекают, нуклеиновую кислоту вводят в эти выделенные клетки и эти модифицированные клетки вводят субъекту либо непосредственно, либо, например, в инкапсулированном виде в пористых мембранах, которые имплантируют в субъекта (см., например, Патенты США с номерами 4892538 и 5283187). Имеются различные способы, доступные для введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Эти способы варьируются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивируемые клетки in vitro или in vivo в клетки предполагаемого хозяина. Способы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают в себя применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, ДЭАЭ-декстрановый способ, способ осаждения фосфатом кальция и т.д. Обычно используемым вектором для доставки гена ex vivo является ретровирус.

Предпочтительные в настоящее время способы переноса нуклеиновых кислот in vivo включают в себя трансфекцию вирусными векторами (такими как аденовирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и системы на основе липидов (применимыми липидами для опосредованного липидами переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях желательно обеспечение источника нуклеиновой кислоты с агентом, который нацеливает на клетки-мишени, таким как антитело, специфическое в отношении мембранного белка клеточной поверхности или клетки-мишени, лиганд для рецептора на клетке-мишени и т.д. При использовании липосом белки, которые связываются с мембранным белком клеточной поверхности, ассоциированным с эндоцитозом, могут быть использованы для нацеливания и/или для облегчения поглощения, например капсидные белки или их фрагменты, тропические для конкретного типа клеток, антитела для белков, которые подвергаются интернализации в кровотоке, и белки, которые нацеливают на внутриклеточную локализацию и усиливают внутриклеточный полупериод существования. Способ опосредованного рецептором эндоцитоза описан, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). В отношении известных в настоящее время протоколов мечения генов и генотерапии см. Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). См. также WO 93/25673 и цитированные в нем ссылки.

III. Получение антител

Способы и изделия по данному изобретению используют или включают в себя антитело, которое связывает маркер поверхности В-клеток, в частности маркер, который связывается с CD20. Таким образом, здесь будут описаны способы получения таких антител.

Маркером поверхности В-клеток, применимым для получения антител или для скрининга на антитела, может быть, например, растворимая форма маркера или его части, содержащая желаемый эпитоп. Альтернативно, или наряду с этим, клетки, экспрессирующие маркер на их клеточной поверхности, могут быть использованы для генерирования антител или для скрининга на антитела. Другие формы маркера поверхности В-клеток, применимые для генерирования антител, будут очевидными специалистам с квалификацией в данной области.

Далее следует описание примеров способов получения антител, используемых в соответствии с данным изобретением.

(i) Поликлональные антитела

Поликлональные антитела предпочтительно размножают в животных множественными подкожными (sc) или внутрибрюшинными (ip) инъекциями релевантного антигена и адъюванта. Может быть полезным конъюгирование релевантного антигена с белком, который является иммуногенным в видах, подлежащих иммунизации, например гемоцианином фиссулеллы, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например малеимидобензоилсульфосукцинимидного эфира (конъюгацией через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂ или R¹N=C=NR, где R и R¹ являются различными алкильными группами.

Животных иммунизируют против этого антигена, иммуногенных конъюгатов или производных объединением, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекцией этого раствора интрадермально во множественных местах. Спустя один месяц этих животных повторно иммунизируют 1/5-1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожной инъекцией во множественных местах. Спустя 7-14 дней у этих животных берут кровь и сыворотку анализируют на титр антител. Животных повторно иммунизируют, пока не наблюдают плато титра. Предпочтительно животное иммунизируют конъюгатом одного и того же антигена, но конъюгированного с отличающимся белком и/или с использованием отличающегося сшивающего реагента. Конъюгаты могут быть также получены в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Для усиления иммунной реакции используют также агрегирующие агенты, такие как квасцы.

(ii) Моноклональные антитела

Из популяции по существу гомогенных антител получают моноклональные антитела, т.е. отдельные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов, которые возникают во время получения моноклонального антитела, причем такие ванианты обычно присутствуют в минорных количествах. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на характер антитела как не являющегося смесью дискретных или поликлональных антител.

Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного способа, описанного впервые Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (Патент США № 4816567).

В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют, как описано выше, для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, с получением гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, исходных миеломных клеток. Например, если исходные миеломные клетки лишены фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для этих гибридом обычно будет включать в себя гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), причем эти вещества предотвращают рост HGPRT-недостаточных клеток.

Предпочтительными миеломными клетками являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильное продуцирование высокого уровня антитела выбранными антителопродуцирующими клетками и являются чувствительными к такой среде, как среда НАТ. Среди них предпочтительными миеломными клеточными линиями являются мышиные миеломные линии, такие как линии, полученные из опухолей мышей МОРС-21 и МРС-11, доступные из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 или Х63-Ag8-653, доступные из Американской Коллекции Типовых культур, Rockville, Maryland USA. Миеломные клеточные линии человека и гетеромиеломные мышь-человек клеточные линии были описаны также для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против данного антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Аффинность связывания моноклонального антитела может быть определена, например, анализом Скетчарда Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, эти клоны могут быть субклонированы процедурами лимитирующих разведений и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие культуральные среды для этой цели включают в себя, например, среду D-MEM или среду RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в виде асцитных опухолей в животном.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, подходящим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми процедурами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на белок А-Сефарозе, гидроксиапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующую эти моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения эта ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника Китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в другом случае не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей это антитело, включают в себя Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

В следующем варианте осуществления антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, генерированных с использованием способов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описывают выделение мышиных антител и антител человека соответственно с использованием фаговых библиотек. Следующие публикации описывают получение высокоаффинных (нМ-диапазона) антител человека перетасовкой цепи (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекцией и in vivo рекомбинацией в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids, Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы представляют собой жизнеспособные альтернативы традиционным гибридомным способам моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

Эта ДНК может быть также модифицирована, например, введением кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (Патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) или ковалентным присоединением к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности полипептида не-иммуноглобулина.

Обычно такими полипептидами не-иммуноглобулинов заменяют константные домены антител или ими заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела для создания химерного бивалентного антитела, содержащего один антигенсвязывающий сайт, имеющий специфичность в отношении одного антигена, и другой антигенсвязывающий сайт, имеющий специфичность в отношении другого антигена.

(iii) Гуманизированные антитела

Способы гуманизации антител, не принадлежащих человеку, описаны в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него, из источника, который не является человеком. Эти аминокислотные остатки, не принадлежащие человеку, часто называют «импортными» остатками, которые обычно берутся из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация может быть выполнена в основном по способу Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) заменой последовательностями гипервариабельного района соответствующих последовательностей антитела человека. Таким образом, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (Патент США № 4817567), в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека был заменен соответствующей последовательностью из вида, не являющегося человеком. На практике гуманизированными антителами являются обычно антитела человека, в которых часть остатков гипервариабельного района и, возможно, часть остатков FR заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых, для использования в получении гуманизированных антител является очень важным для уменьшения антигенности. В соответствии с так называемым способом «наилучшей подгонки» последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу против всей библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Последовательность человека, которая является самой близкой к последовательности грызуна, принимают затем в качестве каркасного района (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Другой способ использует конкретный каркасный район, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы вариабельных районов легкой и тяжелой цепей. Один и тот же каркасный район может быть использован для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности в отношении антигена и других полезных биологических свойств. Для решения этой задачи в соответствии с предпочтительным способом гуманизированные антитела получают способом анализа исходных последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизированной последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются обычно доступными и известны специалистам в данной области. Доступны и компьютерные программы, которые иллюстрируют и изображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Обследование этих изображений делает возможным анализ вероятной роли этих остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать его антиген. Таким путем остатки FR могут быть выбраны и комбинированы из последовательностей реципиента и импортных последовательностей таким образом, что достигается желаемая характеристика антитела, такая как увеличенная аффинность в отношении антигена-мишени (антигенов-мишеней). Обычно остатки гипервариабельного района непосредственно и наиболее существенно участвуют во влиянии на связывание антигена.

(iv) Антитела человека

В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены антитела человека. Например, в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны, после иммунизации, продуцировать полный спектр антител человека в отсутствие эндогенного продуцирования иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена соединительного района тяжелой цепи (J_H) антитела в химерной мыши и мыши с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию эндогенного продуцирования антител. Перенос ряда генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека в такую мышь с мутацией в зародышевой линии будет приводить к продуцированию антител человека после стимуляции антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993) и Патенты США с номерами 5591669, 5589369 и 5545807.

Альтернативно, технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) может быть использована для получения антител человека и фрагментов антител in vitro из спектров генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулина из неиммунизированных доноров. Согласно этому способу гены V-домена клонируют в рамке считывания либо в основной, либо в минорный белок оболочки нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и экспонируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку эта нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, отборы на основе функциональных свойств этого антитела также приводят к отбору этого гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Фаговый дисплей может выполняться в различных форматах; в отношении их обзора см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Несколько источников сегментов V-генов могут быть использованы для фагового дисплея. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили многообразный ряд антиоксалоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, происходящих из селезенок иммунизированных мышей. Спектр V-генов из неиммунизированных людей-доноров можно было сконструировать и антитела к многообразному ряду антигенов (в том числе аутоантигенов) можно было выделить с использованием способов, описанных Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См. также патенты США с номерами 5565332 и 5573905.

Антитела человека могут быть также генерированы in vitro активированными В-клетками (см. Патенты США с номерами 5567610 и 5229275).

(v) Фрагменты антител

Были разработаны различные способы для получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты теперь могут быть продуцированы непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно извлечены из E. coli и химически связаны с образованием F(ab')₂-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу, F(ab')₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидными специалистам в данной области. В других вариантах осуществления предпочтительным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; Патент США № 5571894 и Патент США № 5587458. Фрагмент антитела может быть также “линейным антителом”, например, как описано в Патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

(vi) Биспецифические антитела

Биспецифические антитела являются антителами, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов. Примеры биспецифических антител могут связываться с двумя различными эпитопами маркера поверхности В-клеток. Другие подобные антитела могут связывать маркер поверхности В-клеток и дополнительно связывать второй отличающийся маркер поверхности В-клеток. Альтернативно, плечо связывания маркера поверхности В-клеток антитела может быть объединено с плечом, которое связывает молекулу запуска на лейкоците, такую как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD2 или CD3), или Fc-рецепторы для IgG (FcγR), такие как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), таким образом, чтобы сфокусировать защитные механизмы на В-клетке. Биспецифические антитела могут быть также использованы для локализации цитотоксических агентов в В-клетке. Эти антитела имеют плечо связывания маркера поверхности В-клеток и плечо, которое связывает цитотоксический агент (например, сапорин, анти-интерферон-α, винкаалкалоид, цепь рицина А, метотрексат или гаптен с радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител (например, F(ab')₂-биспецифических антител).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, где эти две цепи имеют разные специфичности (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Вследствие случайного ассортимента тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов эти гибридомы (квадромы) образуют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка корректной молекулы, которую обычно выполняют стадиями аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, и выходы продукта являются низкими. Сходные процедуры описаны в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Согласно другому подходу вариабельные домены антитела с желаемыми специфичностями связывания (антитело-антигенсвязывающие сайты) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Это слияние является предпочтительно слиянием с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирного района, СН2- и СН3-районов. Оно предпочтительно имеет первый константный район тяжелой цепи (СН1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулинов и, если желательно, легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессионные векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в приспособлении взаимных пропорций этих трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда неравные соотношения этих трех полипептидных цепей, используемых в конструировании, обеспечивают оптимальные выходы. Однако можно встроить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда эти соотношения не имеют особого значения.

В предпочтительном варианте осуществления этого подхода биспецифические антитела составляют из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридных иммуноглобулинов (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в половине этой биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь отделения. Этот подход описан в WO 94/04690. В отношении дополнительных подробностей получения биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Согласно другому подходу, описанному в Патенте США № 5731168, может быть сконструирована поверхность раздела между парой молекул антител для максимизации процента гетеродимеров, которые извлекают их культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела содержит по меньшей мере часть С_Н3-домена константного домена антитела. В этом способе одну или несколько малых аминокислотных цепей из этой поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют большими боковыми цепями аминокислот (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие «полости» идентичного или сходного размера относительно этих больших боковых цепей создаются на поверхности раздела молекулы второго антитела заменой больших боковых цепей аминокислот меньшими (например, аланином и треонином). Это обеспечивает механизм увеличения выхода гетеродимера относительно нежелательных конечных продуктов, таких как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают в себя сшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в этом гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое - с биотином. Такие антитела были, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (Патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых удобных способов сшивания. Подходящие сшивающие агенты хорошо известны в данной области и описаны в Патенте США № 4676980 вместе с рядом способов сшивания.

Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител также были описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химического образования связей. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела протеолитически расщепляют с образованием F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии дитиолкомплексирующего агента арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных Fab'-TNB превращают обратно в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Были также описаны различные способы получения и выделения биспецифических антител из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с использованием лейциновых молний. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии из белков Fos и Jun связывали с Fab'-частями двух различных антител слиянием генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с образованием мономеров и затем повторно окисляли для образования гетеродимеров антител. Этот способ может быть использован для получения гомодимеров антител. Технология «диател», описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечила альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (V_L) линкером, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены V_H и V_L одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными доменами V_L и V_H другого фрагмента, с образованием посредством этого двух антигенсвязывающих сайтов. Сообщалась также другая стратегия получения биспецифических фрагментов антител с использованием димеров одноцепочечной цепи Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Рассматриваются также антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).

IV. Конъюгаты и другие модификации антитела

Антитело, используемое в способах или включенное в изделия, описанные здесь, необязательно конъюгируют с цитотоксическим агентом. Например, это антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством, как описано в WO 2004/032828.

Химиотерапевтические агенты, применимые в генерировании таких конъюгатов антитело-цитотоксический агент, были описаны выше.

Конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтансин (Патент США № 5208020), трихотен и СС1065, также обсуждаются здесь. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело конъюгировано с одной или несколькими молекулами майтансина (например, приблизительно 1 - приблизительно 10 молекулами майтансина на молекулу антитела). Майтансин может быть, например, превращен в Маy-SS-Ме, который может быть восстановлен в Маy-SH3 и приведен в реакцию с модифицированным антителом (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) для генерирования конъюгата майтансиноид-антитело.

Альтернативно, это антитело может быть конъюгировано с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Семейство антибиотиков калихеамицинов способно продуцировать разрывы двухцепочечных ДНК при субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-ацетил-γ₁ ^I, PSAG и θ₁ ^I (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) и Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают в себя цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября 1993 года.

Далее, данное изобретение рассматривает антитело, конъюгированное с соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

Различные радиоактивные изотопы являются доступными для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают в себя At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², Р³² и радиоактивные изотопы Lu.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием различных бифункциональных связывающих белок агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-(пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глицеральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Углерод-14-меченая 1-изотиоцианатобензоил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатообразующего агента для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO 94/11026. Этот линкер может быть «отщепляемым линкером», облегчающим высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, может быть использован кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметилсодержащий линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

Альтернативно, может быть получен слитый белок, содержащий антитело и цитотоксический агент, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом.

Еще в одном варианте осуществления антитело может быть конъюгировано с “рецептором” (таким как стрептавидин) для использования в предварительном нацеливании на опухоль, где этот конъюгат антитело-рецептор вводят субъекту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием агента клиренса и затем введением “лиганда” (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим агентом (например, радионуклидом).

Антитела по данному изобретению могут быть также конъюгированы с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см. WO81/01145) в активное противораковое средство. См., например, WO 88/07378 и Патент США № 4975278.

Ферментный компонент таких конъюгатов включает в себя любой фермент, способный действовать на пролекарство таким образом, что он превращает пролекарство в его более активную, цитотоксическую форму.

Ферменты, которые применимы в способе по данному изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, применимую для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, применимую для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндеаминазу, применимую для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые применимы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, применимые для превращения пролекарств, которые содержат D-аминокислотные заместители; расщепляющие углеводы ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, применимые для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, применимая для превращения лекарственных средств, дериватизованных с β-лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин V-амидаза или пенициллин G-амидаза, применимые для превращения лекарственных средств, дериватизованных на атомах азота их аминогрупп феноксиацетильной или фенилацетильной группами соответственно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно, антитела с ферментативной активностью, также известные как «абзимы», могут быть использованы для превращения пролекарств по данному изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим могут быть получены, как описано здесь, для доставки абзима в популяцию опухолевых клеток.

Ферменты по данному изобретению могут быть ковалентно связаны с антителом способами, хорошо известными в данной области, такими как применение гетеробифункциональных сшивающих реагентов, обсуждаемых выше. Альтернативно, слитые белки, содержащие по меньшей мере антигенсвязывающий район антитела данного изобретения, связанный по меньшей мере с функционально активной частью фермента по данному изобретению, могут быть сконструированы с использованием способов рекомбинантных ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)).

Здесь обсуждаются и другие модификации антитела. Например, антитело может быть связано с одним из различных небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Фрагменты антител, такие как Fab', связанные с одной или несколькими молекулами ПЭГ, являются особенно предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения.

Антитела, описанные здесь, могут быть также приготовлены в виде липосом. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области, такими как описанные в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Патентах США с номерами 4485045 и 4544545 и WO97/38731, опубликованном 23 октября 1997 года. Липосомы с повышенным временем циркуляции описаны в Патенте США № 5013556.

Особенно применимые липосомы могут быть получены способом обращенно-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-дериватизованный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор для получения липосом желаемого диаметра. Fab'-фрагменты антител по данному изобретению могут быть конъюгированы с этими липосомами, как описано в Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982), посредством реакции дисульфидного обмена. Химиотерапевтический агент необязательно содержится в липосоме. См. Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

Обсуждаются модификации аминокислотной последовательности. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности этого антитела получают введением подходящих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают в себя, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях этого антитела. Производят любую комбинацию делеции, инсерции или замены для получения конечной конструкции при условии, что эта конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Замены аминокислот могут также изменять посттрансляционные процессы антитела, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования.

Применимый способ для идентификации определенных остатков или районов антитела, которые являются предпочтительными местоположениями для мутагенеза, называют “аланинсканирующим мутагенезом”, описанным Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Здесь идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для влияния на взаимодействие этих аминокислот с антигеном. Затем положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к этим заменам, улучшают введением дополнительно этих или других вариантов в этих сайтах замены или вместо этих сайтов замены. Таким образом, хотя сайт для введения вариации аминокислотной последовательности является предварительно заданным, характер мутации per se не является предопределенным. Например, для анализа выполнения мутации в конкретном сайте проводят аланинсканирующий или случайный мутагенез в кодоне-мишени или районе-мишени и экспрессируемые варианты антител подвергают скринингу на желаемую активность.

Инсерции аминокислотной последовательности включают в себя амино- и/или карбоксил-концевые слияния, в диапазоне длин от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции внутри последовательности отдельных или множественных аминокислотных остатков. Примеры концевых инсерций включают в себя антитело с N-концевым остатком метионина или антитело, слитое с цитотоксическим полипептидом. Другие варианты инсерций молекулы антитела включают в себя слияние с N-концом или С-концом антитела фермента или полипептида, который увеличивает полупериод существования в сыворотке этого антитела.

Другим типом варианта является вариант с заменой аминокислот. Эти варианты имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела, замененный другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для заменяющего мутагенеза антитела (антител), включают в себя гипервариабельные районы, но рассматриваются также изменения FR. Консервативные замены показаны в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены”. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то может вводиться больше существенных замен, названных “примерными заменами” в таблице 1 или описанных ниже в ссылках на классы аминокислот, и эти продукты могут быть подвергнуты скринингу.

Таблица 1 Исходный остаток Примерные замены Предпочтительные замены Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp; Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Leu Leu (L) Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин Leu

Существенные модификации в биологических свойствах антитела выполняют выбором замен, которые отличаются значимо в их влиянии на поддержание (а) структуры полипептидного скелета в зоне замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (с) объема боковой цепи. Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии со сходствами в свойствах их боковых цепей (в A.L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) неполярные: Ala(A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M);

(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (С), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q);

(3) кислотные: Asp (D), Glu (E);

(4) основные: Lys (K), Arg (R), His (H).

Альтернативно, природно встречающиеся остатки могут быть разделены на группы на основе общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут за собой замену члена одного класса членом одного из этих других классов.

Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, может быть также заменен, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности этой молекулы и предотвращения отклоняющегося от нормы сшивания. Напротив, связь (связи) цистеина могут быть добавлены антителу для улучшения его стабильности (в частности, когда это антитело является фрагментом антитела, таким как Fv-фрагмент).

Особенно предпочтительный тип замещенного варианта включает в себя замены одного или нескольких остатков гипервариабельного района исходного антитела. Обычно полученный вариант или полученные варианты, отобранные для дальнейшей разработки, будут иметь улучшенные биологические свойства относительно исходного антитела, из которого они были получены. Удобным путем для генерирования таких содержащих замены вариантов является созревание аффинности с использованием фагового диплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельного района (например, 6-7 сайтов) мутируют для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител демонстрируются моновалентным образом из частиц нитчатого фага в виде слияний с продуктом гена III М13, упакованных в каждой частице. Затем эти демонстрируемые фагом варианты подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано здесь. Для идентификации кандидатов сайтов гипервариабельного района для модификации может выполняться аланинсканирующий мутагенез для идентификации остатков гипервариабельного района, способствующих в значительной степени связыванию антигена. Альтернативно или наряду с этим может быть полезным анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами для замены в соответствии с разработанными здесь способами. После генерирования таких вариантов эту панель вариантов подвергают скринингу, как описано здесь, и антитела с лучшими свойствами в одном или нескольких релевантных анализах могут быть отобраны для дополнительной разработки.

Другой тип аминокислотного варианта антитела имеет изменение в исходном распределении гликозилирования антитела. Такое изменение включает в себя делецию одной или нескольких углеводных частей молекулы, обнаруживаемых в этом антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в этом антителе.

Гликозилирование полипептидов является обычно N-связанным или О-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводной части к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х является любой аминокислотой, за исключением пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, к гидроксиаминокислоте, наиболее часто серину или треонину, хотя могут быть также использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно выполнять изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Это изменение может быть также выполнено добавлением, или заменой, одного или нескольких остатков серина или треонина к последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).

Если антитело содержит Fc-район, углевод, присоединенный к нему, может быть изменен. Например, антитела со зрелой углеводной структурой, которые лишены фукозы, присоединенной к Fc-району антитела, описаны в Заявке на патент США с номером US 2003/0157108 А1, Presta, L. См. также Патент США 2004/0093621 А1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) в отношении композиции анти-CD20-антитела. На антитела с разрезанным пополам N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) в углеводе, присоединенном к Fc-району антитела, даются ссылки в WO03/011878, Jean-Mairet et al. и Патенте США № 6602684, Umana et al. Антитела по меньшей мере с одним галактозным остатком в олигосахариде, присоединенном к Fc-району антитела, сообщаются в WO97/30087, Patel et al. См. также WO98/58964 (Raju, S.) и WO99/22764 (Raju, S.) в отношении антител с измененным углеводом, присоединенным к его Fc-району.

Предпочтительный вариант гликозилирования в данном изобретении содержит Fc-район, в котором углеводная структура, присоединенная к Fc-району, лишена фукозы. Такие варианты имели улучшенную функцию ADCC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности). Необязательно, этот Fc-район дополнительно содержит в нем одну или несколько аминокислотных замен, которые дополнительно улучшают ADCC, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-района (Eu-нумерация остатков). Примеры публикаций, относящихся к «дефукозилированным» или «фукоза-недостаточным» антителам, включают в себя: Заявку на патент США с номером US 2003/0157108 А1, Presta, L.; WO 00/61739А1; WO01/29246А1; US2003/0115614А1; US2002/0164328А1; US2004/0093621А1; US2004/0132140А1; US2004/0110704А1; US2004/0110282А1; US2004/0109865А1; WO03/085119А1; WO03/084570А1; WO 2005/035778; WO2005/035586 (описывающий ингибирование РНК (RNAi) фукозилирования); Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, продуцирующих дефукозилированные антитела, включают в себя клетки Lec13 СНО, недостаточные по фукозилированию белков (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Заявка на патент США с номером US 2003/0157108 А1, Presta, L.; и WO2004/056312 А1, Adams et al., в частности, в Примере 11) и линии клеток с нокаутом, такие как клетки СНО с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела, получают различными способами, известными в данной области. Эти способы включают в себя, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотной последовательности) или получение олигонуклеотид-опосредованным (или сайт-направленным) мутагенезом, ПЦР-мутагенезом и кассетным мутагенезом ранее полученной вариантной или невариантной версии антитела.

Может быть желательной модификация антитела по данному изобретению в отношении эффекторной функции, например, таким образом, чтобы усилить антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую (CDC) цитотоксичность антитела. Это может достигаться введением одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-район антитела. Альтернативно или наряду с этим остаток цистеина (остатки цистеина) может быть введен в Fc-район, что делает возможным образование между цепями дисульфидной связи в этом районе. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь улучшенную способность интернализации и/или увеличенное комплемент-опосредованное уничтожение клеток и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). См. Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью могут быть также получены с использованием гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих линкеров, описанных в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные Fc-районы и может посредством этого иметь повышенный лизис комплемента и эффективности ADCC. См. Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

WO00/42072 (Presta L.) описывает антитела с улучшенной функцией ADCC в присутствии эффекторных клеток человека, где эти антитела содержат аминокислотные замены в их Fc-районе. Предпочтительно это антитело с улучшенной ADCC содержит замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-района. Предпочтительно измененным Fc-районом является Fc-район IgG1 человека, содержащий замены в одном, двух или трех из этих положений или состоящий из одного, двух или трех из этих положений.

Антитела с измененным связыванием C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC) описаны в WO99/51642, Патенте США № 6194551В1, Патенте США № 6242195В1, Патенте США № 6528624В1 и Патенте США № 6538124 (Idusogie et al.). Эти антитела содержат аминокислотную замену в одном или нескольких положениях 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 и/или 334 их Fc-района.

Для увеличения полупериода существования в сыворотке антитела можно включать эпитоп реутилизации связывания рецептора в это антитело (в частности, фрагмент антитела), как описано, например, в Патенте США 5739277. В данном контексте «эпитоп реутилизации связывания рецептора» относится к эпитопу Fc-района молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), который является ответственным за увеличение полупериода существования в сыворотке in vivo молекулы IgG. Антитела с заменами в их Fc-районе и увеличенными полупериодами существования в сыворотке описаны также в WO00/42072 (Presta, L.).

Рассматриваются также сконструированные антитела с тремя или несколькими (предпочтительно четырьмя) функциональными сайтами связывания антигена (Заявка на патент США US2002/0004587 А1, Miller et al.).

V. Фармацевтические препараты

Терапевтические препараты антител, используемые в соответствии с данным изобретением, готовят для хранения смешиванием антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают в себя буферы, например фосфатный, цитратный и содержащий другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты, такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как ТWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Примеры препаратов анти-CD20-антител описаны в WO98/56418. Эта публикация описывает жидкий многодозовый препарат, содержащий 40 мг/мл Ритуксимаба, 25 мМ ацетат, 150 мМ трегалозу, 0,9% бензиловый спирт, 0,02% полисорбат 20 при рН 5,0, который имеет минимальный срок хранения два года при 2-8^оС. Другой представляющий интерес препарат анти-CD20-антител содержит 10 мг/мл Ритуксимаба в 9,0 мг/мл хлориде натрия, 7,35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбат 80 и стерильную воду для инъекции, рН 6,5.

Лиофилизированные препараты, адаптированные для подкожного введения, описаны в Патенте США № 6267958 (Andya et al.). Такие лиофилизированные препараты могут быть восстановлены подходящим растворителем до высокой концентрации белка, и этот восстановленный препарат может вводиться подкожно млекопитающему, которое должно лечиться им.

Обсуждаются также кристаллизованные формы антитела или антител. См., например, US 2002/0136719 А1 (Shenoy et al.).

Описанный здесь препарат может также содержать более чем одно активное соединение, необходимое для конкретного подлежащего лечению состояния, предпочтительно соединения с дополняющими активностями, которые не оказывают неблагоприятного эффекта друг на друга. Например, может быть желательным дополнительное обеспечение цитотоксического агента; химиотерапевтического агента; иммуносупрессивного агента; цитокина; антагониста цитокина или антитела против цитокина; фактора роста; гормона; интегрина; антагониста интегрина или антитела против интегрина (например, антитела против LFA-1, такого как эфализумаб/RAPTIVA, коммерчески доступного от Genentech, или антитела против альфа-4-интегрина, такого как натализумаб/TYSABRI®), доступного от Biogen); лекарственного средства класса интерферонов, такого как IFN-β-1а (REBIF® и AVONEX®) или IFN-β-1b (BETASERON®); олигопептида, такого как глатирамерацетат (COPAXONE®); цитотоксического агента, такого как митоксантрон (NOVANTRONE®), метотрексата, циклофосфамида, хлорамбуцила или азатиоприна; внутривенного иммуноглобулина (гамма-глобулина); истощающего лимфоциты лекарственного средства (например, митоксантрона, циклофосфамида, Кампата, анти-CD4, кладрибина); не истощающего лимфоциты иммуносупрессивного лекарственного средства (например, микофенолат-мофетила (MMF) или циклоспорина); лекарственного средства из класса «статинов», понижающего холестерин; эстрадиола; тестостерона; средства для гормональной заместительной терапии; лекарственного средства, которое лечит симптомы, вторичные или родственные относительно МС (например, мышечную спастичность, недержание, боль, усталость); ингибитора TNF; антиревматического лекарственного средства, модифицирующего заболевание (DMARD); нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID); кортикостероида (например, метилпреднизолона, преднизона, дексаметазона или глюкортикоида); левотироксина; циклоспорина А; аналога соматостатина; антагониста цитокина; антиметаболита; иммуносупрессивного агента; антагониста интегрина или антитела против интегрина (например, антитела против LFA-1, такого как эфализумаб, или антитела против альфа-4-интегрина, такого как натализумаб); или антагониста/антитела против маркера поверхности В-клеток; и т.д. в этом препарате. Тип и эффективные количества таких других агентов зависят, например, от количества антитела, присутствующего в препарате, типа рассеянного склероза, подлежащего лечению, и клинических параметров субъектов. Их обычно используют в тех же самых дозах и с теми же самыми способами введения, которые использовались ранее, или при приблизительно 1-99% используемых ранее доз.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидальных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть приготовлены препараты пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают в себя полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем эти матриксы находятся в форме сформованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают в себя сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды (Патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Препараты для использования для введения in vivo должны быть стерильными. Это легко выполняется фильтрованием через мембраны стерильного фильтрования.

IV. Изделия

В другом варианте осуществления обеспечено изделие, содержащее вещества, применимые для лечения рассеянного склероза, описанные выше. Предпочтительно это изделие содержит: (а) контейнер, содержащий композицию, содержащую антитело, которое связывается с маркером поверхности В-клеток (например, антитело против CD20) и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в контейнере; и (b) вкладыш упаковки с инструкциями в отношении введения этой композиции субъекту, страдающему от рассеянного склероза, для обеспечения начального воздействия антитела приблизительно 0,5-4 г с последующим вторым воздействием антитела приблизительно 0,5-4 г, причем это второе воздействие не предоставляют до приблизительно 16-60 недель от начального воздействия; или инструкции в отношении введения этой композиции субъекту, страдающему от PPMS.

Это изделие содержит контейнер и ярлык или вкладыш упаковки на контейнере или прилагаемый к контейнеру. Подходящие контейнеры включают в себя, например, склянки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер удерживает и содержит композицию, которая является эффективной для лечения рассеянного склероза, и может иметь стерильное отверстие доступа (например, этот контейнер может быть мешком для внутривенного раствора или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для гиподермальной инъекции). По меньшей мере один активный агент в этой композиции является антителом. Ярлык или вкладыш упаковки указывает, что композиция используется для лечения рассеянного склероза в субъекте, страдающем от него, с особым руководством в отношении количеств доз и интервалов антитела и любого другого обеспеченного лекарственного средства. Это изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель, буфер, например бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Это изделие может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Необязательно описанное здесь изделие дополнительно содержит контейнер, содержащий агент, другой, чем антитело, для лечения и дополнительно содержащий инструкции по лечению млекопитающего таким агентом, причем такой агент предпочтительно является химиотерапевтическим агентом или иммуносупрессивным агентом, интерфероном, таким как IFN-бета-1а (REBIF® и AVONEX®) или IFN-бета-1b (BETASERON®); олигопептидом, таким как глатирамерацетат (COPAXONE®); цитотоксическим агентом, таким как митоксантрон (NOVANTRONE®), метотрексатом, циклофосфамидом, хлорамбуцилом или азатиоприном; внутривенным иммуноглобулином (гамма-глобулином); лимфоцит-истощающим терапевтическим средством (например, митоксантроном, циклофосфамидом, Кампатом, анти-CD4, кладрибином); не истощающим лимфоциты иммуносупрессивным лекарственным средством (например, микофенолат-мофетилом (MMF) или циклоспорином); лекарственным средством из класса «статинов», понижающим холестерин; эстрадиолом; средством для гормональной заместительной терапией; лекарственным средством, которое лечит симптомы, вторичные или связанные с МС (например, мышечную спастичность, недержание, боль, усталость); ингибитором TNF; модифицирующим заболевание антиревматическим лекарственным средством (DMARD); нестероидным противовоспалительным лекарственным средством (NSAID); кортикостероидом (например, метилпреднизолоном, преднизоном, дексаметазоном или глюкортикоидом); левотироксином; циклоспорином А; аналогом соматостатина; цитокином или антагонистом рецептора цитокина; антиметаболитом; иммуносупрессивным агентом; антагонистом интегрина или антителом против интегрина (например, антителом против LFA-1, таким как эфализумаб, или антителом против альфа-4-интегрина, таким как натализумаб) и антителом против маркера поверхности В-клеток и т.д.

Далее, подробности данного изобретения иллюстрируются следующими неограничивающими Примерами. Все цитирования в этом описании специально включены здесь в качестве ссылки.

ПРИМЕР 1

Лечение первичного прогрессирующего рассеянного склероза (PPMS)

Субъекта с диагнозом PPMS, определенного McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001), лечат анти-CD20-антителом в этом примере.

Ритуксимаб, коммерчески доступный из Genentech, готовят для IV-введения в виде стерильного продукта в 9,0 мг/мл хлориде натрия, 0,7 мг/мл полисорбате 80, 7,35 мг/мл дегидрате цитрата натрия и Стерильной Воде для Инъекции (рН 6,5).

Первый курс лечения будет состоять из дозы 1 г внутривенного (IV) Ритуксимаба, вводимого в каждый из дней 1 и 15. Субъекты будут получать ацетаминофен (1 г) и дифенгидрамин-HCl (50 мг), или эквивалент, за 30-60 минут перед началом каждой инфузии.

Последующие курсы лечения будут проводиться, начинаясь при неделе 24 (день 169), неделе 48 (день 337) и неделе 72 (день 505). Вторая инфузия этих последующих курсов лечения будет выполняться спустя 14+1 дней после первой инфузии.

Субъекты, которые испытывают первый рецидив, могут получать вспомогательное лечение с использованием IV или перорального введения кортикостероидов. Системные кортикостероиды могут вводиться с использованием схемы введения, которая не превышает воздействие или продолжительность лечения, подходящее для рецидива МС. Рецидив определяется как присутствие всего следующего:

- острое появление неврологического отклонения от нормы, которое держится в течение по меньшей мере 24 часов;

- изменение, которое нельзя отнести к лихорадке, инфекции, травме, действию сопутствующих лекарственных средств или другой этиологии;

- событие объективного изменения при испытании обследующего вслепую исследователя, в том числе минимального изменения 1 пункта (точки) на одной из следующих шкал FS: пирамидальное, краниальные нервы, мозжечковое, сенсорное, изменение зрения или походки.

Может быть использована следующая схема введения кортикостероидов: 1 г IV метилпреднизолона один раз в день в течение 3 дней, затем 60 мг преднизона один раз в день в течение 5 дней и уменьшение на 10 мг каждый день после этого. Если IV-метилпреднизолон является недоступным, то его можно заменить 150 мг IV дексаметазона один раз в день в течение 3 дней. Для обострения должен вводиться только один курс кортикостероидов. Последующие иммунологические исследования и MRI-сканы должны быть получены спустя по меньшей мере 4 недели после завершения схемы введения кортикостероида. Могут быть использованы кортикостероидные ингаляторы (для перорального и назального введения) или внутрисуставные инъекции.

Дополнительные схемы лечения, необязательно комбинируемые с анти-СО20-антителом, включают в себя IFN-β, глатирамерацетат, метотрексат, циклофосфамид или митоксантрон.

Первичным критерием результата эффективности является время до подтвержденного прогрессирования заболевания. Прогрессирование заболевания определяется как увеличение ≥1,0 пункта (точки) от фона Шкалы Статуса Развившейся Нетрудоспособности (EDSS) (Kurtzke J. Neurology 33 (11): 1444-52 (1983)), если фон EDSS равен ≥5,5 пунктов (точек) (включительно), для которого изменение не может быть отнесено к другой этиологии (например, лихорадке, сопутствующему заболеванию, рецидиву или обострению МС или действию сопутствующего лекарственного средства). Подтверждение прогрессирования заболевания может происходить при регулярном запланированном визите, который осуществляется по меньшей мере при 12 неделях (84 днях) после начального прогрессирования.

Вторичные критерии результата эффективности включают в себя следующее.

- Изменение от фона до недели 96 в общем объеме Т2-повреждений на магнитно-резонансных томограммах головного мозга.

- Изменение от фона до недели 96 объема головного мозга на магнитно-резонансных томограммах MRI.

Необязательно улучшение в любом одном или нескольких из следующих параметров.

- Функциональной Композиционной Шкалы Рассеянного Склероза (MSFCS).

- EDSS (Шкалы Статуса Развившейся Нетрудоспособности).

- Доли субъектов с подтвержденным прогрессированием заболевания при неделе 96, определенной с использованием EDSS.

- Функции верхних конечностей, измеренной по 9-Hole Peg-тесту (подшкале MSFCS).

- Способности передвигаться, измеренной по Timed 25-Foot Walk (рассчитанной по времени ходьбе 25 футов) (подшкале MSFCS).

- Познания, измеренного по Paced Auditory Serial Addition Test (только 3 секунды; подшкале MSFCS).

- Общего объема Т2-повреждений головного мозга на магнитно-резонансных томограммах (недели 48 и 122).

- Общего объема Т1-повреждений головного мозга на магнитно-резонансных томограммах.

- Площади поперечного сечения цервикального спинного мозга на магнитно-резонансных томограммах.

- Объема головного мозга на магнитно-резонансных томограммах (недели 48 и 122).

Субъект, лечившийся Ритуксимабом, как описано здесь, будет обнаруживать улучшение в признаках, симптомах или других показателях PPMS в соответствии с любым одним или несколькими из вышеуказанных критериев результата.

ПРИМЕР 2

Лечение рецидивирующего-ремиттирующего рассеянного склероза субъекта с диагнозом RRMS, определенного McDonald et al. Ann Neurol 50: 121-7 (2001), лечат анти-СD20-антителом в этом примере, где воздействие антителом осуществляют с интервалом приблизительно 6 месяцев.

Ритуксимаб, коммерчески доступный от Genentech, готовят для IV-введения в виде стерильного продукта в 9,0 мг/мл хлориде натрия, 0,7 мг/мл полисорбате 80, 7,35 мг/мл дегидрате цитрата натрия и Стерильной Воде для Инъекций (рН 6,5).

Первый курс лечения будет состоять из дозы 1 г внутривенного (IV) Ритуксимаба, вводимого в каждый из дней 1 и 15. Субъекты будут получать ацетаминофен (1 г) и дифенгидрамин-HCl (50 мг), или эквивалент, за 30-60 минут перед началом каждой инфузии.

Последующие курсы лечения будут проводиться, начинаясь при неделе 24 (день 169), неделе 48 (день 337) и неделе 72 (день 505). Вторая инфузия этих последующих курсов лечения будет выполняться спустя 14±1 дней после первой инфузии.

Предпочтительно Ритуксимаб является единственным агентом, вводимым для лечения RRMS. Однако субъекты могут необязательно получать IV или перорально кортикостероиды, IFN-β, глатирамерацетат, метотрексат, циклофосфамид или митоксантрон.

Субъекты, которые испытывают первый рецидив, могут получать вспомогательное лечение с использованием IV или перорального введения кортикостероидов. Системные кортикостероиды могут вводиться с использованием схемы введения, которая не превышает воздействие или продолжительность лечения, подходящее для рецидива МС. Рецидив определяется в этом Примере как появление новых или рецидивирующих неврологических симптомов, согласующихся с МС, длящихся в течение более чем 48 часов, в субъекте, который был в относительно стабильном или улучшающемся неврологическом состоянии в течение по меньшей мере 30 дней. Изменение неврологических симптомов должно сопровождаться объективным неврологическим ухудшением, согласующимся с увеличением по меньшей мере половины стадии на EDSS, или 2 пункта (точки) на одном из подходящих баллов функциональной системы (FSS), или 1 пункт (1 точка) на двух или более подходящих FSS. Это изменение должно быть подтверждено обследующим исследователем и должно влиять на выбранные шкалы FS (т.е. пирамидальное, походки, мозжечковое, ствола головного мозга, сенсорное или связанное со зрением). Симптомы должны сохраняться в течение ≥ 24 часов и должны быть симптомами, которые не могут быть отнесены к запутывающим клиническим факторам (например, лихорадке, инфекции, повреждению, неблагоприятным реакциям сопутствующих лекарственных средств). Единственный приступ пароксизмального симптома (например, тонический спазм) не является рецидивом, но новое наступление множественных случаев пароксизмального симптома на протяжении по меньшей мере 24 часов может быть рецидивом, если оно сопровождается новыми, соответствующими объективными манифестациями. Сенсорные симптомы без изменения при клиническом обследовании, усталость, изменения настроения или позывы мочевого пузыря или кишечника или недержание, будут недостаточными для установления рецидива.

Первичным критерием результата эффективности является конечная точка MRI гадолиний-повышающих повреждений, или время до подтвержденного прогрессирования заболевания, определяемое как увеличение ≥1,0 пункта (точки) от фона Шкалы Статуса Развившейся Нетрудоспособности (EDSS) (Kurtzke J. Neurology 33(11): 1444-52 (1983)). Первичной конечной точкой эффективности может быть общее количество гадолиний-повышающих Т1-повреждений, наблюдаемых на серийных магнитно-резонансных томограммах головного мозга при неделях 12, 16, 20 и 24.

Вторичные критерии результата эффективности включают в себя частоту рецидивов; изменение от фона до недели 96 в общем объеме Т2-повреждений на магнитно-резонансных томограммах головного мозга (например, изменение общего объема Т2-повреждений на магнитно-резонансных томограммах головного мозга из скрининга до недель 24 и 36); изменение от фона до недели 96 объема головного мозга на магнитно-резонансных томограммах головного мозга; Функциональной Композиционной Шкале Рассеянного Склероза (MSFCS) и ее подшкалах; функции верхних конечностей, измеренной по 9-Hole Peg-тесту (подшкале MSFCS); способности передвигаться, измеренной по Timed 25-Foot Walk (рассчитанной по времени ходьбе 25 футов) (подшкале MSFCS); познании, измеренном по Paced Auditory Serial Addition Test (подшкале MSFCS); опросника Качества Жизни при Рассеянном Склерозе-54 (MSQOL-54); общего объема Т1-повреждений головного мозга на магнитно-резонансных томограммах (например, общего количества гадолиний-повышающих Т1-повреждений, наблюдаемых на серийных магнитно-резонансных томограммах головного мозга при неделях 20, 28 и 36); площади поперечного сечения цервикального спинного мозга на магнитно-резонансных томограммах; доли субъектов, рецидивирующих при неделе 24 (т.е. между неделей 0 и неделей 24) и 36 (т.е. между неделей 0 и неделей 36); критерия Объединенной Уникальной Активности при неделе 24 и 36.

Пациент, лечившийся Ритуксимабом, как описано выше, будет обнаруживать улучшение в любом одном из вышеописанных критериев результата.

ПРИМЕР 3

Лечение рецидивирующего-ремиттирующего рассеянного склероза

Субъекта с диагнозом RRMS, определенного McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001), лечат анти-CD20-антителом. В этом примере воздействия антителом осуществляют с интервалом приблизительно 1 год.

Ритуксимаб, коммерчески доступный от Genentech, готовят для IV-введения в виде стерильного продукта в 9,0 мг/мл хлориде натрия, 0,7 мг/мл полисорбате 80, 7,35 мг/мл дегидрате цитрата натрия и Стерильной Воде для Инъекции (рН 6,5).

Первый курс лечения будет состоять из дозы 1 г внутривенного (IV) Ритуксимаба, вводимого в каждый из дней 1 и 15. Субъекты будут получать ацетаминофен (1 г) и дифенгидрамин-HCl (50 мг), или эквивалент, за 30-60 минут перед началом каждой инфузии.

Последующие курсы лечения будут проводиться, начинаясь при неделе 48, неделе 96. Вторая инфузия этих последующих курсов лечения будет выполняться спустя 14±1 дней после первой инфузии.

Предпочтительно Ритуксимаб является единственным агентом, вводимым для лечения RRMS. Однако субъекты могут необязательно получать IV или перорально кортикостероиды, IFN-β, глатирамерацетат, метотрексат, циклофосфамид или митоксантрон.

Субъекты, которые испытывают первый рецидив, могут получать вспомогательное лечение с использованием IV или перорального введения кортикостероидов. Системные кортикостероиды могут вводиться с использованием схемы введения, которая не превышает воздействие или продолжительность лечения, подходящее для рецидива МС. Рецидив определяется в этом Примере как появление новых или рецидивирующих неврологических симптомов, согласующихся с МС, длящихся в течение более чем 48 часов, в субъекте, который был в относительно стабильном или улучшающемся неврологическом состоянии в течение по меньшей мере 30 дней. Изменение неврологических симптомов должно сопровождаться объективным неврологическим ухудшением, согласующимся с увеличением по меньшей мере половины стадии на EDSS, или 2 пункта (точки) на одном из подходящих баллов функциональной системы (FSS), или 1 пункт (1 точка) на двух или более подходящих FSS. Это изменение должно быть подтверждено обследующим исследователем и должно влиять на выбранные шкалы FS (т.е. пирамидальное, походки, мозжечковое, ствола головного мозга, сенсорное или связанное со зрением). Симптомы должны сохраняться в течение ≥24 часов и должны быть симптомами, которые не могут быть отнесены к запутывающим клиническим факторам (например, лихорадке, инфекции, повреждению, неблагоприятным реакциям сопутствующих лекарственных средств). Единственный приступ пароксизмального симптома (например, тонический спазм) не является рецидивом, но новое наступление множественных случаев пароксизмального симптома на протяжении по меньшей мере 24 часов может быть рецидивом, если оно сопровождается новыми, соответствующими объективными манифестациями. Сенсорные симптомы без изменения при клиническом обследовании, усталость, изменения настроения или позывы мочевого пузыря или кишечника или недержание, будут недостаточными для установления рецидива.

Первичным критерием результата эффективности является конечная точка MRI гадолиний-повышающих повреждений, или время до подтвержденного прогрессирования заболевания, определяемое как увеличение ≥1,0 пункта (точки) от фона Шкалы Статуса Развившейся Нетрудоспособности (EDSS) (Kurtzke J. Neurology 33(11): 1444-52 (1983)). Первичной конечной точкой эффективности может быть общее количество гадолиний-повышающих Т1-повреждений, наблюдаемых на серийных магнитно-резонансных томограммах головного мозга при неделях 12, 16, 20 и 24.

Вторичные критерии результата эффективности включают в себя частоту рецидивов; изменение от фона до недели 96 в общем объеме Т2-повреждений на магнитно-резонансных томограммах головного мозга (например, изменение общего объема Т2-повреждений на магнитно-резонансных томограммах головного мозга из скрининга до недель 24 и 36); изменение от фона до недели 96 объема головного мозга на магнитно-резонансных томограммах головного мозга; Функциональной Композиционной Шкале Рассеянного Склероза (MSFCS) и ее подшкалах; функции верхних конечностей, измеренной по 9-Hole Peg-тесту (подшкале MSFCS); способности передвигаться, измеренной по Timed 25-Foot Walk (рассчитанной по времени ходьбе 25 футов) (подшкале MSFCS); познании, измеренном по Paced Auditory Serial Addition Test (подшкале MSFCS); опросника Качества Жизни при Рассеянном Склерозе-54 (MSQOL-54); общего объема Т1-повреждений головного мозга на магнитно-резонансных томограммах (например, общего количества гадолиний-повышающих Т1-повреждений, наблюдаемых на серийных магнитно-резонансных томограммах головного мозга при неделях 20, 28 и 36); площади поперечного сечения цервикального спинного мозга на магнитно-резонансных томограммах; доли субъектов, рецидивирующих при неделе 24 (т.е. между неделей 0 и неделей 24) и 36 (т.е. между неделей 0 и неделей 36); критерия Объединенной Уникальной Активности при неделе 24 и 36.

Пациент, лечившийся Ритуксимабом, как описано выше, будет обнаруживать улучшение в любом одном из вышеописанных критериев результата.

ПРИМЕР 4

Гуманизированные варианты 2Н7

Этот пример описывает гуманизированные варианты антитела 2Н7 для применения в описанных здесь способах. Гуманизированное антитело 2Н7 предпочтительно содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть из следующих CDR-последовательностей.

CDR L1-последовательность RASSSVSYXH, где Х обозначает M или L (SEQ ID NO:18), например SEQ ID NO:4 (фиг. 1А),

CDR L2-последовательность SEQ ID NO:5 (фиг. 1А),

CDR L3-последовательность QQWXFNPPT, где Х обозначает S или А (SEQ ID NO:19), например SEQ ID NO:6 (фиг. 1А),

CDR Н1-последовательность SEQ ID NO:10 (фиг. 1В),

CDR Н2-последовательность AIYPGNGXTSYNQKFKG, где Х обозначает D или А (SEQ ID NO:20), например SEQ ID NO:11 (фиг. 1В), и

CDR Н3-последовательность VVYYSXXYWYFDV, где Х в положении 6 обозначает N, A, W или D, а Х в положении 7 обозначает S или R (SEQ ID NO:21), например, SEQ ID NO:12 (фиг. 1В).

Приведенные выше CDR-последовательности обычно присутствуют в вариабельных легких и вариабельных тяжелых каркасных последовательностях человека, таких как по существу консенсусные FR-остатки человека легкой цепи подгруппы каппа (V_L6I) человека и по существу консенсусные FR-остатки человека тяжелой цепи подгруппы III (V_HIII) человека. См. также WO 2004/056312 (Lowman et al.).

Вариабельный район тяжелой цепи может быть присоединен к константному району IgG человека, где этот район может быть, например, IgG1 или IgG3, включающим в себя природную последовательность и вариантные константные районы.

В предпочтительном варианте осуществления такое антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:8 (v16, показанную на фиг. 1В), необязательно содержит также последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:2 (v16, показанную на фиг. 1А), и это антитело необязательно содержит одну или несколько аминокислотных замен в положениях 56, 100 и/или 100а, например D56A, N100A или N100Y и/или S100аR, в вариабельном домене тяжелой цепи и одну или несколько аминокислотных замен в положениях 32 и/или 92, например M32L и/или S92A, в вариабельном домене легкой цепи. Предпочтительно это антитело является интактным антителом, содержащим аминокислотные последовательности легкой цепи SEQ ID NO:13 или 16 и аминокислотные последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO:14, 15, 17, 22 или 25.

Предпочтительным гуманизированным антителом 2Н7 является окрелизумаб (Genentech).

Описанное здесь антитело может дополнительно содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-районе, которая улучшает активность ADCC, например, таким образом, что аминокислотные замены находятся в положениях 298, 333 и 334, предпочтительно S298A, E333A и K334A, с использованием Eu-нумерации остатков тяжелой цепи. См. также Патент США № 6737056В1, Presta.

Любое из этих антител может содержать по меньшей мере одну замену в Fc-районе, которая улучшает FcRn-связывание или полупериод существования в сыворотке, например замену в положении 434 тяжелой цепи, такую как N434W. См. также Патент США № 6737056В1, Presta.

Любые из этих антител могут дополнительно содержать по меньшей мере одну замену в Fc-районе, которая улучшает активность CDC, например, по меньшей мере замену в положении 326, предпочтительно K326A или К326W. См. также Патент США № 6528624В1 (Idusogie et al.).

Некоторые предпочтительные гуманизированные варианты 2Н7 являются вариантами, содержащими вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO:2 и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO:8, в том числе вариантами с заменами или без замен в Fc-районе (если он присутствует), и вариантами, содержащими вариабельный домен тяжелой цепи с изменениями N100A; или D56A и N100A; или D56A, N100Y и S100aR; в SEQ ID NO:8, и вариабельный домен легкой цепи с изменениями M32L; или S92A; или N32L и S92A; в SEQ ID NO:2.

М34 в вариабельном домене тяжелой цепи 2Н7.v16 был идентифицирован как потенциальный источник стабильности антитела и является другим потенциальным кандидатом для замены.

В суммировании некоторых различных предпочтительных вариантов данного изобретения вариабельный район вариантов на основе 2Н7.v16 содержит аминокислотные последовательности v16, за исключением положений аминокислотных замен, которые показаны в таблице ниже. Если нет других указаний, эти варианты 2Н7 будут иметь ту же самую легкую цепь, что и легкая цепь v16.

Примеры вариантов гуманизированного антитела 2Н7 Версия 2Н7 Изменения тяжелой цепи (V_H) Изменения легкой цепи (V_L) Изменения Fc 16 для ссылки     - 31 - - S298A, E333A, K334A 73 N100A M32L   75 N100A M32L S298A, E333A, K334A 96 D56A, N100A S92A   114 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A 115 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, E356D, M358L 116 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E334A, K322A 138 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A 477 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A, N434W 375 - - K334L 588 - - S298A, E333A, K334A, K326A 511 D56A, N100Y, S100aR M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A

Одно предпочтительное гуманизированное антитело 2Н7 содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи 2Н7.v16:

и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 2Н7.v16:

Когда гуманизированное антитело 2Н7.v16 является интактным антителом, оно может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи:

и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:14 или

Другое предпочтительное гуманизированное антитело 2Н7 содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи 2Н7.v511:

и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 2Н7.v511:

Когда гуманизированное антитело 2Н7.v511 является интактным антителом, оно может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи:

и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:17 или:

Группа изобретений, включающая способ и изделие, относится к медицине, предназначена для лечения рассеянного склероза. Вводят анти-CD20 антитела в количестве 0,5-4,0 г. Через 16-60 недель повторяют введение. Проводится до 4 и более воздействий антитела. Каждое из воздействий - в виде одной или двух доз антитела. Антитело может вводиться внутривенно, подкожно или подоболочечно. При этом может использоваться второе лекарственное средство. Изделие, содержащее инструкцию и контейнер с 0,5-4,0 г антитела. Дополнительно изделие может содержать контейнер со вторым лекарственным средством и инструкцию по его применению. Изобретения позволяют увеличить время до подтвержденного прогрессирования заболевания, уменьшить частоту рецидивов. 2 н. и 36 з.п.ф-лы, 3 табл., 6 ил.

1. Способ лечения рассеянного склероза у субъекта, предусматривающий введение эффективного количества антитела против CD20 этому субъекту для проведения начального воздействия антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма с последующим вторым воздействием антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма, причем это второе воздействие не проводят до приблизительно 16-60 недель после начального воздействия, и каждое из этих воздействий антител проводят субъекту в виде одной или двух доз антитела.

2. Способ по п.1, где второе воздействие не проводят до приблизительно 20-30 недель после начального воздействия.

3. Способ по п.1, где начальное и второе воздействия антитела, каждое, проводят в количествах приблизительно 1,5-2,5 грамма.

4. Способ по п.2, дополнительно предусматривающий введение этому субъекту эффективного количества антитела против CD20 для проведения третьего воздействия антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма, причем третье воздействие не проводят до приблизительно 46-60 недель после начального воздействия.

5. Способ по п.4, где третье воздействие антитела проводят в количестве приблизительно 1,5-2,5 грамма.

6. Способ по п.4, где третье воздействие не проводят до приблизительно 46-54 недель после начального воздействия.

7. Способ по п.4, где дополнительное воздействие антитела не проводят до по меньшей мере приблизительно 70-75 недель после начального воздействия.

8. Способ по п.1, где второе воздействие не проводят до приблизительно 46-60 недель после начального воздействия.

9. Способ по п.1, где каждое из воздействий антитела проводят субъекту в виде одной дозы антитела.

10. Способ по п.1, где каждое из воздействий антитела проводят субъекту в виде двух доз антитела, где эти две дозы составляют первую дозу и вторую дозу.

11. Способ по п.10, где вторую дозу вводят в период приблизительно 3-17 дней после введения первой дозы.

12. Способ по п.11, где вторую дозу вводят в период приблизительно 6-16 дней после введения первой дозы.

13. Способ по п.12, где вторую дозу вводят в период приблизительно 13-16 дней после введения первой дозы.

14. Способ по п.10, где первая и вторая доза антитела, каждая, равны приблизительно 0,5-1,5 грамма.

15. Способ по п.10, где первая и вторая доза антитела, каждая, равны приблизительно 0,75-1,3 грамма.

16. Способ по п.1, где субъекту проводят три или более воздействий антитела.

17. Способ по п.1, где субъекту проводят четыре или более воздействий антитела.

18. Способ по любому из пп.1-17, где второе лекарственное средство вводят с начальным воздействием или более поздними воздействиями, причем антитело против CD20 является первым лекарственным средством.

19. Способ по п.18, где второе лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из интерферона, глатирамерацетата, цитотоксического агента, химиотерапевтического агента, митоксантрона, метотрексата, циклофосфамида, хлорамбуцила, азатиоприна, гамма-глобулина, Кампата, анти-CD4, кладрибина, кортикостероида, микофенолат-мофетила (MMF), циклоспорина, лекарственного средства из класса статинов, понижающего холестерин, эстрадиола, тестостерона, лекарственного средства заместительной гормональной терапии, ингибитора TNF, модифицирующего заболевание антиревматического средства (DMARD), нестероидного противовоспалительного средства (NSAID), левотироксина, циклоспорина А, аналога соматостатина, цитокина или антагониста рецептора цитокина, антиметаболита, иммуносупрессивного агента, антагониста интегрина или антитела против интегрина, антитела против LFA-1, эфализумаба, антитела против альфа-4-интегрина, натализумаба и антитела против другого маркера поверхности В-клеток.

20. Способ по любому из пп.1-17, где рассеянный склероз является рецидивирующим-ремиттирующим рассеянным склерозом (RRMS).

21. Способ по любому из пп.1-17, где рассеянный склероз является первичным прогрессирующим рассеянным склерозом (PPMS).

22. Способ по любому из пп.1-17, где субъект никогда ранее не лечился антителом против CD20.

23. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело является несвязанным антителом.

24. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело конъюгировано с другой молекулой.

25. Способ по п.24, где другой молекулой является цитотоксический агент.

26. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело вводят внутривенно.

27. Способ по п.26, где это антитело вводят внутривенно для каждого воздействия антитела.

28. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело вводят подкожно.

29. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело вводят внутриоболочечно.

30. Способ по любому из пп.1-17, где антитело против CD20 является единственным лекарственным средством, вводимым субъекту для лечения рассеянного склероза.

31. Способ по любому из пп.1-17, где этим антителом является ритуксимаб.

32. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело является гуманизированным 2Н7, содержащим последовательности вариабельного домена, представленные в SEQ ID NO: 2 и 8.

33. Способ по любому из пп.1-17, где это антитело является гуманизированным 2Н7, содержащим последовательности вариабельного домена, представленные в SEQ ID NO: 23 и 24.

34. Способ по любому из пп.1-17, где этот субъект имеет повышенный уровень (повышенные уровни) антитела против миелинового основного белка (МВР), антитела против миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG), антитела против ганглиозида и/или антитела против нейрофиламента.

35. Способ по любому из пп.1-17, где повышенные уровни В-клеток присутствуют в цереброспинальной жидкости (CSF), повреждении, обусловленном рассеянным склерозом, или в сыворотке субъекта.

36. Изделие, содержащее:
(a) контейнер, содержащий антитело против CD20; и
(b) вкладыш упаковки с инструкциями в отношении лечения рассеянного склероза у субъекта, где эти инструкции указывают, что субъекту вводят количество антитела, которое является эффективным для обеспечения начального воздействия антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма с последующим вторым воздействием антитела в количестве приблизительно 0,5-4 грамма, причем это второе воздействие антитела не проводят до приблизительно 16-60 недель после начального воздействия, и каждое из воздействий антитела проводят субъекту в виде одной или двух доз антитела.

37. Изделие по п.36, дополнительно содержащее контейнер, содержащий второе лекарственное средство, где антитело против CD20 является первым лекарственным средством, и дополнительно содержащий инструкции на вкладыше упаковки в отношении лечения субъекта вторым лекарственным средством.

38. Изделие по п.37, где второе лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из интерферона, глатирамерацетата, цитотоксического агента, химиотерапевтического агента, митоксантрона, метотрексата, циклофосфамида, хлорамбуцила, азатиоприна, гамма-глобулина, Кампата, анти-CD4, кладрибина, кортикостероида, микофенолат-мофетила (MMF), циклоспорина, лекарственного средства из класса статинов, понижающего холестерин, эстрадиола, тестостерона, лекарственного средства заместительной гормональной терапии, ингибитора TNF, модифицирующего заболевание антиревматического средства (DMARD), нестероидного противовоспалительного средства (NSAID), левотироксина, циклоспорина А, аналога соматостатина, цитокина или антагониста рецептора цитокина, антиметаболита, иммуносупрессивного агента и антитела против другого маркера поверхности В-клеток.