ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ПАЦИЕНТА С НЕАДЕКВАТНЫМ ОТВЕТОМ НА ИНГИБИТОР TNF-АЛЬФА Российский патент 2013 года по МПК A61K39/395 A61P37/02 

Область техники

Настоящее изобретение касается терапии антагонистами, которые связываются с поверхностными маркерами B-клеток. В частности, настоящее изобретение относится к использованию такого рода антагонистов для лечения аутоиммунных заболеваний у млекопитающих, которые обнаруживают неадекватный ответ на ингибитор TNF-альфа.

Предпосылки создания изобретения

Лимфоциты - это один из множества типов белых клеток крови, которые образуются в костном мозге в процессе гемопоэза. Существуют две основные популяции лимфоцитов: B-лимфоциты (B-клетки) и T-лимфоциты (T-клетки). Наибольший интерес представляют B-клетки.

B-клетки созревают в костном мозге и покидают его, экспрессируя на своей поверхности антигенсвязывающее антитело. Когда нативная B-клетка впервые встречается с антигеном, по отношению к которому экспрессируемое на ее поверхности антитело является специфичным, она начинает быстро делиться и ее потомство дифференцируется в B-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые "плазматическими клетками". B-клетки памяти имеют большее время жизни и продолжают экспрессировать связанное с мембраной антитело той же специфичности, что и родительские клетки. Плазматические клетки не продуцируют связанного с мембраной антитела, но вместо этого синтезируют антитело в секретируемой форме. Секреторные антитела являются основными эффекторными молекулами гуморального иммунитета.

CD20-антиген (также называемый рестриктивным дифференцировочным антигеном B-лимфоцитов человека, Bp35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой приблизительно 35 kD, экспрессируемый пре-В и зрелыми B-лифмоцитами (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989); и Einfeld et al., EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). Указанный антиген также экспрессируется более, чем 90% B-клеток неходжкинских лимфом (NHL) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), но не обнаруживается на поверхности гемопоэтических стволовых клеток, про-B-клеток, нормальных плазматических клеток или других клеток здоровых тканей (Tedder et al., J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). CD20 регулирует ранний(ранние) этап(ы) процесса активации инициации клеточного цикла и дифференцировки (Tedder et al., supra) и, возможно, функционирует как кальциевый ионный канал (Tedder et al J,. Cell Biochem. 14D: 195 (1990)).

Установленная экспрессия CD20 B-клетками лимфом позволяет рассматривать этот антиген как потенциальную "мишень" для воздействия на соответствующие лимфомы. В принципе, это можно представить следующим образом: пациенту вводят антитела, специфичные по отношению к поверхностному антигену B-клеток CD20. Эти анти-CD20-антитела специфично связываются с CD20 антигеном, скорее всего, как нормальных, так и злокачественных B-клеток; антитело, связавшееся с поверхностным CD20 антигеном, может обеспечивать разрушение и уменьшение числа неопластических B-клеток. Кроме того, химические агенты или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, могут быть конъюгированы с анти-CD20-антителом таким образом, что агент целенаправленно "доставляется" непосредственно к неопластическим B-клеткам. В независимости от подхода, основной целью является разрушение опухоли; специфический подход может заключаться в применении определенного анти-CD20 антитела, и, следовательно, возможные подходы для воздействия на CD20 антиген могут значительно различаться.

CD19 представляет собой другой поверхностный антиген, который экспрессируется B-клетками. Как и CD20, CD19 обнаруживается на поверхности B-клеток на всех этапах их дифференцировки, начиная от стволовой клетки и заканчивая клеткой, непосредственно предшествующей конечной стадии дифференцировки в плазматические клетки (Nadler, L., Типирование лимфоцитов II, 2:3-37 и Приложение; Renling et al,. eds. (1986), Springer Verlag). В отличие от CD20, антитело, связывающееся с CD19, вызывает интернализацию CD19 антигена. CD19 антиген среди прочих распознается антителом HD237-CD19 (также называемым "B4" антителом) (Kiesel et al., Исследование лейкоза II, 12:1119 (1987)). Антиген CD19 обнаруживается у 4-8% мононуклеарных клеток периферической крови и более чем у 90% B-клеток, выделенных из периферической крови, селезенки, лимфатического узла или миндалины. CD19 не определяется у T-клеток периферической крови, моноцитов или гранулоцитов. Практически все T-клеточные острые лимфобластные лейкозы (ALL), B-клеточные хронические лимфоцитарные лейкозы (CLL) и B-клеточные лимфомы экспрессируют CD19, распознаваемый B4 антителом (Nadler et al., J. Immunol. 131:244 (1983), а также Nadler et al. в работе "Прогресс в гематологии" Vol.XII pp.187-206. Brown, E. ed. (1981), Grune & Stratton, Inc.).

Кроме того, выделены дополнительные антитела, которые распознают антигены, специфичные для каждого этапа дифференцировки B-клеточной линии. Среди них можно указать на антитело B2 к антигену CD21; антитело B3 к антигену CD22 и антитело J5 к антигену CD10 (также называемому CALLA). См. патент US No.5595721 от 21 января 1997 г. (Kaminski et al).

Ритуксимаб (RITUXAN®) представляет собой генно-инженерное химерное моноклональное антитело типа "человек/мышь", направленное против антигена CD20. В патенте US No.5,736,137 от 7 апреля 1998 г. (Anderson et al.) ритуксимаб фигурирует под названием "С2В8". RITUXAN® предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или резистентной низкодифференцированной или фолликулярной CD20 позитивной B-клеточной неходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro показали, что RITUXAN® связывается с системой комплемента человека и разрушает лимфоидные B-клеточные линии посредством комплемент-опосредованной цитотоксичности (CDC, от англ. Complement-Dependent Cytotoxicity) (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)). Кроме того, он обладает значительной активностью в исследованиях антитело зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC, от англ. Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity). Недавно в экспериментах по включению клетками меченного тритием тимидина было показано, что RITUXAN® имеет анти-пролиферативный эффект и способен непосредственно вызывать апоптоз клеток, в то время как другие анти-CD19 и анти-CD20 антитела этими свойствами не обладают (Maloney et al., Blood 88(10): 637a (1996)). Также экспериментально был установлен синергизм в действии RITUXAN®, препаратов для химиотерапии и токсинов. В частности, RITUXAN® сенсибилизирует лекарственно-устойчивые B-клеточные линии лимфом к цитотоксическому эффекту доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al., Химиотерапия и радиофармацевтика раковых заболеваний 12(3): 177-186 (1997)). Преклинические исследования in vivo показали, что RITUXAN® способствует исчезновению B-клеток из периферической крови, лимфатических узлов и костного мозга у обезьян циномолгус, по-видимому, с помощью опосредованных комплементом и антителами процессов (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)).

Патенты и заявки на патенты, касающиеся антител к CD20, включают патенты US 5776456, 5736137, 6399061 и 5843439, а также заявки на патент US US 2002/0197255 A1 и US 2003/0021781 A1 (Anderson et al.); патент US No.6455043B1 и заявку WO 00/09160 (Grillo-Lopez. A.); заявку WO 00/27428 (Grillo-Lopez and White); заявку WO 00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); заявку WO 00/44788 (Braslawsky et al.); заявку WO O1/10462 (Rastetter, W.); заявку WO 01/10461 (Rastetter and White); заявку WO 01/10460 (White and Grillo-Lopez); заявку на патент US US 2002/0006404 A1 и заявку WO 02/04021 (Hanna and Hariharan); заявку на патент US US 2002/0012665 A1 и заявку WO 01/74388 (Hanna, N.); заявку на патент US US 2002/0009444 A1 и заявку WO 01/80884 (Grillo-Lopez, А.); заявку WO 01/97858 (White, С.); заявку на патент US US 2002/0128488 A1 и заявку WO 02/34790 (Reff, M.); заявку WO 02/060955 (Braslawsky et al.); заявку WO 02/096948 (Braslawsky et al.); заявку WO 02/079255 (Reff and Davies); патент US No.6171586 B1 и заявку WO 98/56418 (Lam et al.); заявку WO 98/58964 (Raju, S.); заявку WO 99/22764 (Raju, S.); заявку WO 99/51642 и патенты US No.6194551 B1, 6242195 B1, 6528624 B1, 6538124 B1 (Idusogie et al.); заявку WO 00/42072 (Presta, L.); заявку WO 00/67796 (Curd et al.); заявку WO O1/03734 (Grillo-Lopez et al.); заявку на патент US US 2002/0004587 A1 и заявку WO 01/77342 (Miller and Presta); заявку на патент US US 2002/0197256 A1 (Grewal, I.); патенты US No.6090365 B1, 6287537 B1, 6015542 B1, 5843398 B1 и 5595721 B1 (Kaminski et al.); патенты US No.5500362 B1, 5677180 B1, 5721108 B1 и 6120767 B1 (Robinson et al.); патент US No.6410391 B1 (Raubitschek et al.); патент US No.6244866 B1 и заявку WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); заявку WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); заявку WO 00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg и Hansen); заявку WO 00/76542 (Golay et al.); заявку WO 01/72333 (Wolin и Rosenblatt); патент US No.6368596 B1 (Ghetie et al.); заявку на патент US No. US 2002/0041847 A1 (Goldenberg, D.); заявку на патент US No. US 2003/0026801 A1 (Weiner и Hartmann); заявку WO 02/102312 (Engleman, E.), которые приведены здесь в качестве ссылок. См. также патент US No.5849898 и заявку EP No.330191 (Seed et al.); патент US No.4861579 и заявку EP 332865 A2 (Meyer и Weiss) и заявку WO 95/03770 (Bhat et al.).

К опубликованным источникам информации, в которых раскрыта терапия при использовании ритуксимаба, относятся следующие: Perotta и Abuel "Ответ у больных с хронически рецидивирующей идиопатической тромбоцитопенической пурпурой на ритуксимаб в течение 10 лет его применения" Реферат #3360, Blood 10(1) (часть 1-2): стр.88В; Stashi et al,. "Лечение взрослых больных с хронической идиопатической тромбоцитопенической пурпурой при использовании химерного моноклонального антитела к CD20 (ритуксимаба)" Blood 98(4): 952-957 (2001); Matthews, R., "Медицинские еретики" New Scientist (7 Апреля; 2001); Leandro et al,. "Клинический результат терапии с истощением B-лимфоцитов у 22 больных ревматоидным артритом" Ann Rheum Dis 61: 833-888 (2002); Leandro et al., "Истощение лимфоцитов при ревматоидном артрите: безопасность, эффективность и дозовый ответ" Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al., "Открытое исследование истощения B-лимфоцитов при системной красной волчанке" Arthritis and Rheumatism 46(1): 2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge, "Длительное улучшение при ревматоидном артрите при использовании методики истощения B-лимфоцитов" Rhematology 40: 2050211 (2001); Edwards et al., "Терапия, основанная на истощении B-лимфоцитов, при ревматоидном артрите и других аутоиммунных заболеваниях" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards et al., "Эффективность и безопасность ритуксимаба, химерного моноклонального антитела, направленного к B-клеткам: рандомизированные, контролируемые с помощью плацебо исследования больных ревматоидным артритом" Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine и Pestronk, "Связанные с IgM-антителами полинейропатии: химиотерапия, основанная на истощении B-клеток, при использовании ритуксимаба" Neurology 52: 1701-1704 (1999); De Vita et al., "Эффективность избирательной блокады B-клеток при терапии ревматоидного артрита" Arthritis and Rheumatism 46: 2029-2033 (2002); Hidashida et al.," Лечение DMARD-рефрактерного ревматоидного артрита ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Октябрь 24-29; Новый Орлеан, LA 2002; Tuscano, J., "Успешное лечение инфликсимаб-рефрактерного ревматоидного артрита ритуксимабом" Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Октябрь 24-29; Новый Орлеан, LA 2002.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии. У большинства пациентов, страдающих хроническим РА, даже при надлежащей терапии, могут происходить прогрессивное разрушение суставов, их деформация, нарушение многих функций и даже преждевременная смерть. Более девяти миллионов больных ревматоидным артритом посещают врачей и более 250000 пациентов ежегодно подвергаются госпитализации. Задачи терапии РА заключаются в предотвращении или контролировании повреждений сустав, предотвращении утраты их функции и уменьшении боли. Первоначальная терапия РА обычно включает применение одного или более следующих лекарственных средств: нестероидных противовоспалительных препаратов (NSAIDs), глюкокортикоидов (внутрисуставные инъекции) и преднизолона в низких дозах. См. "Руководство по лечению ревматоидного артрита" Arthritis and Rheumatism 46(2): 328-346 (Февраль 2002). К большей части пациентов с заново диагностированным РА применяется модифицирующая заболевание антиревматическая лекарственная (DMARD) терапия в течение трех месяцев с момента постановки диагноза. Во время DMARD-терапии РА обычно используют гидроксихлороквин, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномид, этанерсепт, инфликсимаб (совместно с перорально и подкожно вводимым метотрексатом), азатиоприн, D-пеницилламин, Gold (перорально), Gold (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин, иммуноадсорбированный белок A стафилококков.

Поскольку при заболевании РА в организме больного синтезируется фактор некроза опухолей альфа (TNFα), ингибиторы TNFα используются для лечения указанного заболевания.

Этанерсепт (ENBREL®) представляет собой инъекционный лекарственный препарат, который разрешен в US для лечения активной формы РА. Этанерсепт связывается с TNFα и удаляет его большую часть из суставов и крови, тем самым, предотвращая развитие воспаления и других симптомов РА, обусловленное TNFα. Этанерсепт является иммуноадгезивным белком слияния, состоящим из внеклеточного участка рецептора фактора некроза опухолей человека (TNFR) мол. массы 75 kD (р75), связывающего лиганд, соединенного с Fc-участком IgG1 человека. Этот лекарственный препарат обладает рядом побочных эффектов, в том числе может вызывать серьезные инфекции и сепсис, расстройства нервной системы, такие, как рассеянный склероз (МС). См., например, www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html

Инфликсимаб поступающий в продажу под торговым наименованием REMICADE®, представляет собой иммуносупрессорный лекарственный препарат, предназначенный для лечения РА и болезни Крона. Инфликсимаб представляет собой химерное моноклональное антитело, которое целенаправленно связывается с TNFα. в организме больного и уменьшает обусловленное TNFα. воспаление. Показана взаимосвязь инфликсимаба с летальными процессами, например, сердечной недостаточностью и инфекционными заболеваниями, в том числе туберкулезом, а также демиелинизацией, приводящей к МС.

В декабре 2002 г. компания Abbott Laboratories получила разрешение FDA на выпуск препарата адалимумаб (HUMIRA™), до этого известного под названием D2E7. Адалимумаб представляет собой моноклональное антитело человека, связывающееся с TNFα, для которого было показано, что оно способно снижать проявления и симптомы, а также замедлять прогрессивное развитие структурных изменений у взрослых людей, больных РА от средней до тяжелой формы, которые обнаруживают недостаточную отвечаемость на традиционную терапию DMARD.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, в первую очередь, относится к способу лечения аутоиммунных заболеваний у млекопитающего с неадекватным ответом на ингибитор TNFα, заключающемуся во введении такому млекопитающему терапевтически эффективного количества антагониста, который связывается с поверхностным маркером B-клеток.

Например, настоящее изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего с неадекватным ответом на ингибитор TNFα, заключающемуся во введении такому млекопитающему эффективного терапевтического количества антитела, которое связывается с CD20.

Кроме того, настоящее изобретение касается способа снижения риска развития негативных побочных эффектов, включая инфекции, сердечную недостаточность и демиелинизацию, заключающемуся во введении млекопитающему с аутоиммунным заболеванием терапевтически эффективного количества антагониста, который связывается с поверхностным маркером B-клеток.

Детальное описание изобретения

I. Определения

Термин "фактор некроза опухолей альфа (TNFα)", используемый в настоящем описании, относится к молекуле TNFα человека, имеющей аминокислотную последовательность, описанную Pennica et al., Nature 312:721 (1984) или Aggarwal et al., JBC 260:2345 (1985).

Термин "ингибитор TNFα", используемый в настоящем описании, относится к агенту, который в некоторой степени ингибирует биологическую функцию TNFα, главным образом, путем связывания с TNFα и нейтрализации его активности. Примерами ингибиторов TNFα, которые специальным образом рассматриваются здесь, являются этанерсепт (ENBREL®), инфликсимаб (REMICADE®) и адалимумаб (HUMIRA™).

Термин "неадекватный ответ на ингибитор TNFα" означает неадекватный ответ на предшествующее или текущее лечение ингибитором TNFα, связанное с токсичностью лекарственных препаратов и/или с недостаточной эффективностью лечения. Неадекватный ответ может быть определен лечащим врачом, имеющим определенный опыт в данной области.

Млекопитающими, у которых во время предшествующего или текущего лечения ингибитор TNFα проявлял или проявляет "токсичность", являются такие млекопитающие, у которых наблюдались или наблюдаются один или более нежелательных побочных эффектов, таких, как инфекции (главным образом, тяжелые инфекции), застойная сердечная недостаточность, демиелинизация (приводящая к развитию МС), гиперчувствительность, неврологическая симптоматика, аутоиммунизация, неходжкинская лимфома, туберкулез (ТВ), образование аутоантител, и т.д.

У млекопитающих с "неадекватной эффективностью" сохранялись проявления активной формы заболевания по время предшествующего или текущего лечения ингибитором TNFα. Например, у пациента может сохраняться активный процесс после одного или трех месяцев лечения ингибитором TNFα.

Под термином "снижение риска развития негативных побочных эффектов" подразумевается снижение риска развития побочных эффектов, возникающих в результате лечения антагонистом, который связывается с поверхностным маркером B-клеток, до уровня ниже того, который наблюдается при лечении ингибитором TNFα. Такие побочные эффекты включают инфекции (главным образом, тяжелые инфекции), сердечную недостаточность и демиелинизацию (рассеянный склероз) и т.д.

Термин "поверхностный маркер B-клеток", используемый в настоящем описании, относится к антигену, экспрессируемому на поверхности B-клеток, являющемуся "мишенью" для действия антагониста, который с ним связывается. Примерами поверхностных маркеров B-клеток могут служить CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, Cd79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 лейкоцитарные поверхностные маркеры. Поверхностным маркером B-клеток, представляющим особый интерес, является такой маркер, который экспрессируется преимущественно B-клетками по сравнению с другими не-B-клеточными тканями млекопитающих, причем как предшественниками B-клеток, так и зрелыми B-клетками. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, маркером является CD20 или CD19, обнаруживаемый на поверхности B-клеток на всех этапах их дифференцировки, начиная со стволовой клетки вплоть до клетки, непосредственно предшествующей конечной стадии дифференцировки в плазматические клетки. Предпочтительным поверхностным маркером B-клеток является CD20.

Антиген "CD20" - это негликозилированный фосфопротеин с молекулярным весом ~35 kDa, обнаруживаемый на поверхности более, чем 90% B-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 экспрессируется ранними предшественниками B-клеток и сохраняется вплоть до конечной стадии дифференцировки в плазматические клетки. CD20 выявляется на поверхности как нормальных, так и злокачественных B-клеток. Другими названиями CD20, которые встречаются в литературе, являются "B-лимфоцитарный рестриктивный антиген" и "Bp35". Антиген CD20 описан, например, Clark et al., PNAS (USA) 82:1766 (1985).

Термин "аутоиммунное заболевание", используемый в настоящем описании, относится к заболеванию или патологическому состоянию, возникающему в собственных тканях организма, и направленному против них. Примерами аутоиммунных заболеваний или патологических состояний являются (без ограничений указанными) артрит (ревматоидный артрит, болезнь Стилла, остеоартрит, псориатический артрит), псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, системная склеродермия и системный склероз, иммунные ответы, связанные с воспалительными заболеваниями кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS, от англ. Adult Respiratory Distress Syndrome), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзема, астма, состояния, сопровождающиеся T-клеточной инфильтрацией и хроническим воспалительным ответом, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, системная красная волчанка (SLE, от англ. System Lupus Erythematosus), ювенильный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, иммунные ответы, связанные с реакцией гиперчувствительности немедленного и замедленного типов, опосредованной цитокинами и T-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, грануломатоз, включая грануломатоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (включая ANCA), апластическая анемия, анемия Дайемонда-Блекфэна, иммунная гемолитическая анемия, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA, от англ. Autoimmune Hemolytic Anemia), пернициозная анемия, истинная эритроцитарная аплазия (PRCA, от англ. Pure Red Cell Aplasia), недостаточность фактора VIII, гемофилия A, аутоиммунная нейтропения, панцитопения, лейкопения, заболевания, ассоциированные с диапедезом лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (CNS, от англ. Central Nervous System), синдром множественного поражения органов, миастения гравис, заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, заболевания, связанные с образованием антигломерулярных антител в базальной мембране, антифосфолипидный синдром, аллергический нейрит, болезнь Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, Синром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, реакция отторжения трансплантата, реакция "трансплантат против хозяина" (GVHD, от англ. Graft Versus Host Desease), пузырчатка буллезная, пузырчатка, аутоиммунные полиэндокринопатии, синдром Рейтера, синдром "деревянного человека", гигантоклеточный артериит, иммунокомплексный нефрит, IgA нефропатия, IgM полинейропатии или опосредованные IgM нейропатии, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP, от англ. Idiopathic Thrombocytopenic Purpura), тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР, от англ. Thrombotic Thrombocytopenic Purpura), аутоиммунная тромбоцитопения, аутоиммунные заболевания яичек и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоидизм, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоидизм, болезнь Аддисона, болезнь Грейвса, аутоиммунный полигландулярный синдром (или синдромы полигландулярной эндокринопатии), диабет I типа, также называемый инсулинзависимым сахарным диабетом (IDDM, от англ. Insulin-Dependent Diabetes Mellitus) и синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (HIV), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантационный) в противоположность NSIP, синдром Гиейна-Барре, васкулиты крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (болезнь Такаясу), васкулиты сосудов среднего диаметра (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), анкилозирующий спондилит, болезнь Бергера (IgA нефропатия), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный билиарный цирроз, целиакия (глютеновая энтеропатия), криоглобулинемия, боковой амиотрофический склероз (ALS, от англ. Amyotrophic Lateral Sclerosis), ишемическая болезнь сердца и др.

Термин "антагонист" обозначает молекулу, которая при связывании с поверхностным маркером B-клеток, разрушает B-клетки или снижает их количество в организме млекопитающих и/или препятствует реализации одной или нескольких функций B-клеток, например, путем предотвращения или снижения уровня гуморального иммунного ответа, обеспечиваемого B-клетками. Предпочтительно, антагонист обладает способностью истощать пул B-клеток (т.е. снижать уровень циркулирующих B-клеток) у млекопитающих, получающих его в качестве лекарственного средства. Такое снижение может быть достигнуто посредством осуществления нескольких механизмов, таких, как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) и/или комплементопосредованная цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации B-клеток и/или индуцирование гибели B-клеток (например, путем апоптоза). К антагонистам, рассматриваемым в рамках настоящего изобретения, относятся антитела, синтетические или нативные пептидные последовательности и небольшие молекулы антагонистов, которые связываются с поверхностным маркером B-клеток, необязательно конъюгированные или слитые с цитотоксическим агентом. Предпочтительным антагонистом является антитело. Термины "антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" означают опосредуемую клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие рецепторы Fc (FcRs) [например, натуральные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги], распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем лизируют такую клетку-мишень. Основные клетки, опосредующие ADCC, а именно натуральные киллеры, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcRIII. Экспрессия FcR гемопоэтическими клетками обобщена в Таблице 3 на стр.464 в работе Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки активности интересующей молекулы в отношении ADCC можно осуществить анализ ADCC in vitro, как описано в патенте US No.5500362 или 5821337. Подходящими эффекторными клетками для такого анализа являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и натуральные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно оценка активности представляющей интерес молекулы в отношении ADCC может быть осуществлена in vivo, например, на модельном животном, как это описано Clynes et al.,. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

"Эффекторные клетки человека" - это лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcRs и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют, по крайней мере, FcRIII и выполняют эффекторную функцию в отношении ADCC. Примерами лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, являются мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), натуральные киллеры (NK), моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы; наиболее предпочтительными являются PBMCs и NK.

Термин "Fc рецептор" или "FcR" используется для описания рецептора, который связывается с Fc-участком молекулы антитела. Предпочтительным FcR является нативная последовательность FcR антитела человека. Кроме того, предпочтительным FcR является такой рецептор, который связывается с антителом IgG (гамма рецептор). К указанному FcR относятся рецепторы FcγRI, FcγRII и FcγRIII подклассов, в том числе их аллельные варианты и рецепторы, полученные в результате альтернативного сплайсинга. FcγRII рецепторы включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, различающиеся, главным образом, только в цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторную, основанную на тирозине активирующую структуру (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторную, основанную на тирозине ингибирующую структуру (ITIM). (см. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs описаны Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcRs, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, здесь объединены общим термином "FcR". Этот термин также относится к неонатальному рецептору FcRn, который отвечает за передачу материнского IgGs плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

"Комплементопосредованная цитотоксичность" или "CDC" означает способность молекулы лизировать "мишень" в присутствии комплемента. Каскад реакций активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с распознаваемым антигеном. Для оценки активности комплемента можно осуществить анализ CDC, например, как описано Gazzano-Santoro et al,. J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

К антагонистам, "ингибирующим рост", относятся антагонисты, которые предотвращают или снижают пролиферацию клеток, экспрессирующих антиген, с которым связываются эти антагонисты. Например, антагонист может предотвращать или снижать пролиферацию B-клеток in vitro и/или in vivo.

К антагонистам, "индуцирующим апоптоз", относятся такие антагонисты, которые индуцируют запрограммированную клеточную гибель, например, гибель B-клеток, что определяется в стандартных исследованиях апоптоза, таких, как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сморщивание клеток, дилатация эндоплазматического ретикулума, клеточная фрагментация и/или формирование мембранных везикул (называемых также тельцами апоптоза).

Термин "антитело", используемый в настоящем описании, имеет очень широкое значение, и специальным образом относится к интактным моноклональным антителам, поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), сконструированным, по крайней мере, на основе двух интактных антител, и фрагментам антител при условии, что они обладают необходимой биологической активностью.

Термин "фрагменты антител" относится к участкам интактных антител, предпочтительно, содержащим антигенсвязывающую область. Примерами фрагментов антител являются Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, сконструированные из антительных фрагментов.

Термин "нативные антитела" обычно используется по отношению к гетеротетрамерным гликопротеинам с молекулярной массой около 150000 Дальтон, состоящим из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых цепей (H). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством ковалентной дисульфидной связи, при этом число дисульфидных связей в тяжелых цепях варьирует в зависимости от идиотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет симметрично расположенные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь на одном конце имеет вариабельный домен (V_H), за которым следуют несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (V_L) на одном конце и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи расположен на одной линии с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи находится на одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что контакт между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей обеспечивается определенными аминокислотными остатками.

Термин "вариабельный" означает то, что последовательности определенных участков вариабельных доменов разных антител значительно различаются между собой и обеспечивают специфичность связывания каждого антитела со своим определенным антигеном. Однако вариабельность не распределена случайным образом среди вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, расположенных в вариабельных доменах, как легких, так и тяжелых цепей. Наиболее консервативные участки вариабельных доменов называются каркасными участками (FRs). Все вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей имеют четыре FRs, которые обеспечивают β-складчатую структуру и связаны тремя гипервариабельными участками, формирующими петли, и, в некоторых случаях, часть β-складчатой структуры. Гипервариабельные участки в каждой цепи тесно связаны между собой посредством FRs, а также с гипервариабельными участками другой цепи и участвуют в формировании антигенсвязывающей области антитела (см. Kabat et al., Последовательности иммунологически важных белков, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие, как обеспечение антитело зависимой цитотоксичности (ADCC).

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагментами, каждый из которых содержит одну антигенсвязывающую область, и остаточного "Fc"-фрагмента, наименование которого отражает его способность к быстрой кристаллизации. Обработка пепсином приводит к получению F(ab')₂-фрагмента, который имеет две антигенсвязывающие области и все еще обладает способностью к перекрестному связыванию антигена.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который включает полноразмерные антиген распознающую и антигенсвязывающую области. Этот участок представляет собой димер одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в тесной нековалентной взаимосвязи. Его конфигурация такова, что три гипервариабельных участка каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающей области на поверхности V_H-V_L димера. Все вместе шесть гипервариабельных участка обеспечивают специфичность связывания антитела с антигеном. Однако, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных участка, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем полноразмерный связывающий участок.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они на карбокси-концевом участке CH1 домена тяжелой цепи имеют несколько дополнительных аминокислотных остатков, включая один или более остатков цистеина из шарнирного участка антитела. Fab'-SH в данном тексте обозначает Fab'-фрагмент, в котором остатки цистеина константного домена имеют по крайней мере одну свободную тиоловую группу. F(ab')₂-фрагменты антител первоначально были получены как спаренные Fab'-фрагменты, между которыми расположены шарнирные остатки цистеина. Кроме того, известны другие структуры, представленные соединенными между собой фрагментами антител.

"Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) любых позвоночных животных могут быть отнесены к одному из двух существующих типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ), что основано на аминокислотной последовательности константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константных доменов тяжелых цепей антитела могут быть разделены на различные классы. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем некоторые из них, в свою очередь, также могут быть разделены на подклассы (идиотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам антител, обозначаются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Кроме того, хорошо изучены структура отдельных субъединиц и три возможные пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов.

"Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антител включают V_H и V_L домены антител, при этом указанные домены находятся в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, Fv полипептиды также имеют полипептидный линкер между V_H и V_L доменами, который обеспечивает формирование необходимой для связывания антигена конфигурации scFv. Для более детального ознакомления см. Plückthun, Фармакология моноклональных антител vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими областями, включающим вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же полипептидной цепи (V_H-V_L). Поскольку линкер является слишком коротким для того, чтобы обеспечить образование пары между двумя доменами в одной цепи, домены объединяются в пару при помощи комплементарных доменов другой цепи и образуют две антигенсвязывающие области. Диатела подробно описаны, например, в европейском патенте EP 404097; международной заявке WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Термин "моноклональное антитело", используемый в настоящем описании, относится к антителу, выделенному из популяции практически полностью гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, образующие популяцию, являются идентичными, за исключением того, что они могут иметь небольшое число природных мутаций. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной антигенной детерминанты. Помимо своей высокой специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они синтезируются гибридомной культурой, "незагрязненной" другими антителами. Прилагательное "моноклональный" означает, что антитело получено из полностью гомогенной популяции антител и не может быть получено способом, который применяется для получения обычных антител. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью гибридомного метода, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены с помощью метода рекомбинантных ДНК (см, например патент US No.4816567). "Моноклональные антитела" могут быть также выделены из фаговых антительных библиотек с использованием методик, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, полученных от определенного вида животных или же принадлежащих к определенному классу или подклассу, в то время как оставшиеся участки цепи (цепей) идентичны или гомологичны соответствующей последовательности антител, полученных от других видов животных или же принадлежащих к другому классу или подклассу, так же, как и фрагменты таких антител, если они обладают соответствующей биологической активностью (патент US No.4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес в соответствии с настоящим изобретением, включают "приматизированные" антитела, имеющие антигенсвязывающие последовательности вариабельных доменов, происходящие из антител приматов, не являющихся человеком (например, обезьян "старого света", таких, как бабуин, макака резус или обезьяна циномолгус), и константные участки антител человека (патент US No.5693780).

"Гуманизированные" формы антител различных видов животных, за исключением человека (например, антител мыши), представляют собой химерные антитела, которые включают минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулинов различных видов животных, за исключением человека. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитела реципиента), в которых аминокислотные остатки гипервариабельного участка замещены остатками гипервариабельного участка антител других видов животных, за исключением человека (антитела донора), например, мыши, крысы, кролика или примата, которые обладают желаемыми специфичностью, аффинностью и свойствами. В некоторых случаях, аминокислотные остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими аминокислотными остатками антител других видов животных, за исключением человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются в антителах реципиента или в антителах донора. Эти модификации осуществляются для дополнительного улучшения функции антител. В целом, гуманизированное антитело будет включать, по крайней мере, один, а, как правило, два вариабельных домена, в которых все, или практически все, гипервариабельные петли соответствуют таковым иммуноглобулина других видов, за исключением человека, и все, или практически все, FRs соответствуют последовательностям иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также включать, по крайней мере, часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Для более точной информации см. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986): Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2: 593-596 (1992).

Термин "гипервариабельный участок", используемый в настоящем описании, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельные участки содержат аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR" [например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Последовательности иммунологически важных белков, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и остатки 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). "Каркасные" или "FR" остатки - это такие остатки вариабельного домена, которые отличаются от аминокислотных остатков гипервариабельного участка, как определено в тексте.

Антагонист, "который связывается" с антигеном, представляющим интерес, например, с поверхностным маркером B-клеток, представляет собой такой антагонист, который способен связывать антиген с достаточной аффинностью и/или авидностью таким образом, что его можно использовать в качестве лекарственного средства, направленного против клеток-мишеней, экспрессирующих антиген.

Примерами антител, которые связываются с антигеном CD20, являются: "C2B8", которое в настоящее время известно под названием "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (см. патент US No.5736137, приведенный здесь в качестве ссылки); меченное иттрием-[90] антитело 2B8 мыши, обозначаемое как "Y2B8" (см. патент US No.5736137, приведенный здесь также в качестве ссылки); IgG2a "B1" мыши, при необходимости меченное ¹³¹I с получением антитела "¹³¹I-В1" (BEXXAR™) (см. патент US No.5595721, приведенный здесь в качестве ссылки); моноклональное антитело мыши "1F5" (Press et al,. Blood 69(2): 584-591 (1987)); "химерное антитело 2H7" (см. патент US No.5677180, приведенный здесь в качестве ссылки); "гуманизированное антитело 2H7 v16" (см. ниже); huMax-CD20 (Genmab, Denmark); АМЕ-133 (Applied Molecular Evolution), а также моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 или NU-B2, доступные в международной лаборатории по типированию лейкоцитов (Valentine et al., в книге: Типирование лейкоцитов III (McMichael, Ed., р.440, Oxford University Press (1987)).

Примерами антител, которые связываются с антигеном CD19, являются анти-CD19 антитела, описанные Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32: 364-372 (1991) и Vlasveld et al., Cancer Immunol Immunother. 40: 37-47 (1995), и антитело B4, описанное Kiesel et al,. Leukemia Research II, 12:1119 (1987).

Термины "ритуксимаб" или "RITUXAN®", используемые в настоящем описании, относятся к полученному с помощью генной инженерии химерному моноклональному антителу типа "мышь/человек", направленному против антигена CD20 и обозначаемому как "C2B8" в патенте US No.5736137, приведенном здесь в качестве ссылки. Это антитело относится к изотипу IgG₁ с легкими каппа-цепями и содержит вариабельные последовательности легких и тяжелых цепей антитела мыши и константные последовательности антитела человека. Аффинность связывания ритуксимаба с антигеном CD20 составляет приблизительно 8.0 нМ.

Исключительно для целей настоящего изобретения ниже приводятся вариабельные последовательности легких и тяжелых цепей "гуманизированного антитела 2H7 v16".

"Изолированный" антагонист представляет собой такой антагонист, который был идентифицирован и выделен и/или получен из компонентов окружающей его природной среды. Загрязняющие компоненты природной среды антагониста - это материалы, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому использованию антагониста и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые соединения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист очищают (1) до степени чистоты, составляющей более 95% (по весу), что определяют методом Лоури и, более предпочтительно, более 99% (по весу); (2) до уровня, достаточного для получения по крайней мере 15 остатков N-концевой или внутренней последовательности при использовании вращающегося чашечного секвенатора или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси голубого или, предпочтительно, серебряного окрашивания. Изолированный антагонист включает антагонист in situ внутри рекомбинантных клеток до тех пор, пока по крайней мере один из компонентов, составляющих естественное окружение этого антагониста, не будет удален. Однако обычно изолированный антагонист получают только после одного этапа очищения.

Термин "млекопитающие", используемый в соответствии с настоящим изобретением, относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, животных зоопарков, спортивных животных, а также домашних питомцев, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.п. Предпочтительно, млекопитающим является человек.

Термин "лечение" относится как к терапевтическим, так и к превентивным или профилактическим мерам. К тем, кто нуждается в лечении относятся индивидуумы, уже имеющие заболевание или патологическое состояние, а также те, кто нуждается в профилактике развития заболевания или патологического состояния. Следовательно, у млекопитающего уже может быть диагностировано заболевание или патологическое состояние или же оно может быть предрасположено к развитию заболевания.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает такое количество антагониста, которое является эффективным для предотвращения, улучшения течения или лечения аутоиммунного заболевания, о котором идет речь.

Термин "иммуносупрессивный агент", используемый здесь при описании терапевтических подходов, относится к соединению, которое подавляет или экранирует иммунную систему млекопитающего, подвергаемого лечению. Это относится к соединениям, которые ингибируют продукцию цитокинов, подавляют самоэкспрессию антигена или маскируют MHC антигены. Примерами таких агентов являются 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. патент US No.4665077, приведенный здесь в качестве ссылки); нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs); азатиоприн; циклофосфамид; бромокриптин; даназол; дапсон; глутаральдегид (который маскирует антигены MHC, как описано в патенте US No.4120649); анти-идиотипические антитела к MHC антигенам и MHC фрагментам; циклоспорин А; стероды, такие, как глюкокортикоиды, например, преднизолон, метилпреднизолон и дексаметазон; метотрексат (для перорального или подкожного введения); гидроксихлорохин; сульфасалазин; лефлуномид; антагонисты цитокинов или их рецепторов, включая антитела к интерферону γ, β или α, антитела к фактору некроза опухолей а (инфликсимаб или адалимумаб), анти-TNFα иммуноадгезин (этанерсепт), антитела к TNFβ, антитела к интерлейкину 2 и к рецептору IL-2; анти-LFA-1-антитела, включая анти-CD11a и анти-CD18 антитела; анти-L3T4 антитела; гетерологичный антилимфоцитарный иммуноглобулин; пан-T антитела, предпочтительно, анти-CD3- или анти CD4/CD4a антитела; растворимый пептид, имеющий LFA-3-связывающий домен (WO 90/08187 от 7/26/90); стрептокиназа; TGF-β; стрептодорназа; РНК или ДНК хозяина; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалин; рапамицин; T-клеточный рецептор (Cohen et al., патент US No.5114721); фрагменты T-клеточного рецептора (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature 341:482 (1989); WO 91/01133) и антитела к T-клеточному рецептору (EP 340109), такие, как T10B9.

Термин "цитотоксический агент", используемый в настоящем описании, относится в соединению, которое ингибирует или препятствует функционированию клеток и/или вызывает их разрушение. Этот термин объединяет радиоактивные изотопы (например, Ar²¹¹, I₁₃₁, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты и токсины, такие, как низкомолекулярные токсины или токсины с ферментативной активностью бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, а также их фрагменты.

"Химиотерапевтический агент" представляет собой химическое соединение, которое используется для лечения рака. Примерами химиотерапевтических агентов являются алкилирующие агенты, такие, как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие, как бисульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие, как бензодопа, карбохион, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, тритиленфосфорамид, триэтилентиофосфаорамид и триметилоломеламин; нитроиприты, такие, как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, иприт урацила; производные нитрозомочевины, такие, как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие, как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие, как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие, как деноптерин, метотрексат, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие, как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие, как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; препараты, подавляющие гиперфункцию надпочечников, такие, как аминоглютетимид, митотан, трилостан; производное фолиевой кислоты, такое, как формилтетрагидрофолиевая кислота; ацеглатон; алдофосфамида глюкозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихион; элфорнитин; ацетат эллиптина; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митокстантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тениазоновая кислота; триазихион; 2,2,2'-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhŏone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие, как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин, а также любые фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные соединений, перечисленных выше. Кроме того, к химиотерапевтическим агентам относятся противогормональные агенты, которые регулируют или ингибируют гормональную активность опухолей, такие, как антиэстрогены, включая тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); антиандрогены, такие, как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные указанных соединений.

Термин "цитокин" относится к белкам, синтезируемым одной клеточной популяцией, которые воздействуют на другие клетки и выполняют функцию межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные пептидные гормоны. К цитокинам относятся гормон роста, в частности, человеческий гормон роста; N-метионилированный человеческий гормон роста и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие, как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолей-α и -β; фактор, ингибирующий мюллеров проток; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие, как NGF-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGFs), такие, как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие, как интерферон -α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSFs), такие, как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный CSF (G-CSF); интерлейкины (ILs), такие, как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некроза опухолей, такой, как TNF-α или TNF-β, а также другие полипептидные факторы, включая LIF и KL. В данном описании термин цитокин относится к белкам природного происхождения или полученным с помощью рекомбинантной клеточной линии, а также к биологически активным эквивалентам природных цитокинов.

Термин "пролекарство", используемый в настоящем описании, относится к предшественнику или производному фармацевтически активного соединения, которое является менее цитотоксичным по отношению к опухолевым клеткам, чем исходное лекарственное средство и может быть активировано ферментативно или превращено в более активную исходную форму. См, например, Wilman, "Пролекарства в химиотерапии рака" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615^th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Пролекарства: химический подход к целенаправленной доставке лекарственных препаратов" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). К пролекарствам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, относятся (без ограничений указанными) фосфат-содержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, пролекарства на основе модифицированных D-аминокислот, гликозилированные пролекарства, β-лактам-содержащие пролекарства, факультативно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или факультативно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, пролекарства 5-фторурацила и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активные свободные цитотоксические соединения. Примерами цитотоксических агентов, которые могут быть превращены в форму пролекарства для использования в соответствии с настоящим изобретением, являются (без ограничений указанными) все перечисленные выше химиотерапевтические соединения.

"Липосома" представляет собой небольшую везикулу, сформированную из разных типов липидов, фосфолипидов и/или сурфактанта, которая используется для доставки лекарственных средств (таких, как антагонисты, раскрытые в настоящем описании, и, возможно, химиотерапевтические агенты) в организм млекопитающих. Компоненты липосомы обычно организованы в виде двухслойной структуры, аналогично тому, как располагаются липиды в биологических мембранах.

II. Получение антагонистов

Настоящее изобретение также относится к способам и условиям получения антагонистов, взаимодействующих с поверхностным маркером B-клеток, которые описаны ниже.

Поверхностный маркер B-клеток, используемый для получения и скрининга антагониста(ов), может быть, например, представлен растворимой формой антигена или его участка, содержащими нужный эпитоп. Альтернативно или дополнительно, B-клетки, экспрессирующие поверхностный маркер, могут быть использованы для получения и скрининга антагониста(ов). Другие формы поверхностного маркера B-клеток, используемые для получения антагонистов, очевидны для специалиста в данной области знаний. Предпочтительно, поверхностный маркер B-клеток представляет собой антиген CD20.

В том случае, если предпочтительный антагонист является антителом, другие антагонисты, отличные от антител, рассматриваются здесь особо. Например, антагонист может представлять собой небольшую молекулу, слитую или конъюгированную с цитотоксическим агентом (таким, как раскрытые в данном описании цитотоксические агенты). Библиотеки небольших молекул могут быть проскринированы по отношению к представляющему интерес поверхностному маркеру B-клеток с целью выявления небольшой молекулы, связывающейся с антигеном. Далее небольшая молекула может подвергнуться скринингу на антагонистические свойства и/или конъюгированию с цитотоксическим агентом.

Антагонист также может представлять собой пептид, полученный путем конструирования или фагово-дисплейного метода (см., например, WO 98/35036, опубл. 13 августа 1998 г.). Согласно одному варианту, антагонист может представлять собой молекулу, имитирующую CDR, или аналог антитела, содержащий CDRs заданного антитела. Помимо того, что такие пептиды могут быть антагонистами сами по себе, они могут быть конъюгированы с цитотоксическими агентами, которые влияют на антагонистические свойства пептидов или усиливают их.

Ниже приведены примеры способов получения антител, обладающих антагонистической активностью, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

(i) Поликлональные антитела

Поликлональные антитела преимущественно получают путем множественной подкожной или интраперитонеальной иммунизации животных соответствующим антигеном и адъювантом. Кроме того, указанный антиген может быть конъюгирован с белком, который является иммуногенным по отношению к тем видам животных, которые подвергаются иммунизации, например, с гемоцианином моллюска фиссуреллы, сывороточным альбумином, тиреоглобулином крупного рогатого скота или ингибитором трипсина соевых бобов при использовании бифункционального или дериватизирующего агента, такого, как сложный эфир малеимидобензоил сульфосукцинимида (конъюгация происходит посредством цистеиновых остатков), N-гидроксисукцинимид (конъюгация происходит посредством остатков лизина), глутаральдегид, ангидрид янтарной кислоты, SOCl₂, R¹N=C=NR, где R и R¹ являются различными алкильными группами.

Животных иммунизируют антигеном, иммуногенными конъюгатами или их производными, объединяя, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с тремя объемами полного адъюванта Фрейнда и осуществляя инъекции полученного раствора внутрикожно в различные участки. Через один месяц животных бустируют 1/5-1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожными инъекциями в различные участки. Через 7-14 дней осуществляют сбор крови у животных и определяют титр антител в полученной сыворотке. Животных бустируют до тех пор, пока титр антител не установится. Предпочтительно, животных бустируют конъюгатом того же самого антигена, но конъюгированного с другим белком и/или с тем же самым, но при использовании другого перекрестносвязывающего агента. Конъюгаты также могут быть получены с помощью культуры рекомбинантных клеток в форме белков слияния. Кроме того, для усиления иммунного ответа могут быть использованы агенты, способствующие агрегации, например, алюминиевые квасцы.

(ii) Моноклональные антитела

Моноклональные антитела представляют собой популяцию по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением антител, имеющих возможные природные мутации, которые могут составлять незначительную часть популяции. Таким образом, понятие моноклональные" указывает на то, что антитела не являются смесью дискретных антител.

Например, моноклональные антитела могут быть получены при использовании гибридомного метода, впервые разработанного Келером и др. [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)], или же с помощью технологии рекомбинантных ДНК (патент US 44816567).

Согласно гибридомному методу мышей или других подходящих животных, например, хомяков, иммунизируют, как описано выше, для того, чтобы вызвать генерацию лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые специфическим образом связываются с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы при использовании подходящего агента для слияния, такого, как полиэтиленгликоль, с получением клеток гибридомы (Goding, "Моноклональные антитела: принципы и применение", стр.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более соединений, ингибирующих рост и выживаемость неслитых, родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы утратили способность синтеза фермента гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), в культуральную среду для роста гибридомных клеток обычно добавляют гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые препятствуют росту клеток, дефицитных по HGPRT.

Предпочтительными миеломными клетками являются такие клетки, которые подлежат эффективному слиянию, поддерживают стабильно высокий уровень синтеза антител отобранными для слияния антителопродуцирующими клетками и чувствительны к среде HAT. Среди таких клеток предпочтительными являются клетки миеломы мыши, например, происходящие из опухолей МОРС-21 и МРС-11, которые могут быть получены в Клеточном центре Солковского института, Сан Диего, Калифорния, US, и клетки линий SP-2 и X63-Ag8-653, которые можно получить в Американской коллекции типовых клеточных культур, Роквилл, Мэриленд, US. Кроме того, для получения моноклональных антител человека могут использоваться миеломные клетки человека и гетеромиеломные клеточные линии человека и мыши [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., "Способы и получение моноклональных антител", pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

Культуральную среду, в которой выращивались гибридомные клетки, исследуют на наличие моноклональных антител, направленных к антигену. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют иммунопреципитацией или исследованием связывания in vitro, например, радиоиммунологическим анализом (РИА) или иммуноадсорбцией (ELISA).

Аффинность связывания антител с антигеном может быть определена, например, методом Скэтчарда, описанным Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После того как идентифицируют гибридомные клетки, продуцирующие антитела нужной специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы методом лимитирующих разведений, и выращены при использовании стандартных методов [Goding, "Моноклональные антитела.принципы и практика", pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. Подходящая для этих целей среда включает, например, D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в форме асцитных опухолей в организме животных.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки подходящими методами иммунологической очистки, например, с использованием протеин А-сефарозы, гидроксилапатитной хроматографией, гель-электрофорезом, диализом или аффинной хроматографией.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, выделяют и секвенируют с помощью стандартных методов (например, при использовании олигонуклеотидных проб, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые или легкие цепи антител мыши). Гибридомные клетки служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК встраивают в вектор экспрессии, которым затем трансформируют клетки-хозяева, такие, как Е.coli, COS, СНО (клетки яичника китайского хомячка) или миеломные клетки, которые не продуцируют иммуноглобулинов, для получения моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзор публикаций, посвященных рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитела, включает обзоры Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5: 256-262 (1993) Plückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).

В другом случае антитела или их фрагменты могут быть выделены из антительных фаговых библиотек, полученных способами, описанными McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), соответственно, описывают выделение антител мыши и человека при использовании фаговых библиотек. В последующих публикациях раскрывается получение антител человека высокой аффинности (уровень нМ) путем перестановки цепей [Marks et al., Boi/Technology, 10: 779-783 (192)], а также комбинаториальным инфицированием и рекомбинацией in vivo с конструированием объемных фаговых библиотек [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)]. Таким образом, указанные методики являются альтернативными традиционным способам получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии.

Кроме того, кодирующая антитела ДНК может быть модифицирована, например, замещением гомологичных последовательностей антитела мыши на кодирующие последовательности константных доменов тяжелых и легких цепей антитела человека [патент US 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)] или ковалентным связыванием последовательности, кодирующей иммуноглобулин, со всей или частью последовательности, кодирующей полипептид неиммуноглобулиновой природы.

Обычно такими полипептидами неиммуноглобулиновой природы замещают константные домены антитела или вариабельные домены антигенсвязывающей области антитела с целью получения химерных бивалентных антител, содержащих одну антигенсвязывающую область, обладающую высокой специфичностью по отношению к одному антигену, и другую антигенсвязывающую область, обладающую высокой специфичностью по отношению к другому антигену.

(iii) Гуманизированные антитела

Способы гуманизирования антител нечеловеческого происхождения описаны в предшествующем уровне техники. Предпочтительно, гуманизированные антитела имеют один или более аминокислотных остатков антитела нечеловеческого происхождения, встроенных в антитело человека. Указанные аминокислотные остатки антитела нечеловеческого происхождения часто называют "импортными" остатками, которые обычно получают из "импортного" вариабельного домена. Гуманизирование, главным образом, осуществляют при использовании метода, разработанного Winter с соавторами [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], путем замещения последовательностей гипервариабельных участков антитела человека соответствующими последовательностями гипервариабельных участков нечеловеческого происхождения. По существу, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент US 4816567) и обычно представляют собой антитела человека, в которых аминокислотные остатки гипервариабельных участков и, возможно, некоторые остатки каркасных областей замещены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов, как легких, так и тяжелых цепей антител человека, которые будут использованы для получения гуманизированных антител, является чрезвычайно важным для снижения их антигенности. В соответствии с так называемым методом "наилучшей подгонки" последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют против целой библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов антител человека. Последовательность антитела человека, которая наиболее близка к последовательности антитела грызуна по структуре, затем используют в качестве каркасного участка для гуманизирования антител [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Med. Biol., 196:901 (1987)]. Другой метод подразумевает использование определенного каркасного участка, происходящего из консенсусной последовательности всех антител человека с определенным типом легких и тяжелых цепей. Одна и та же каркасная последовательность может использоваться для получения различных гуманизированных антител [Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)].

Кроме того, представляется важным, что гуманизированные антитела сохраняют высокую активность связывания с антигеном и обладают другими ценными биологическими свойствами. Для достижения указанной цели, согласно предпочтительному способу, гуманизированные антитела получают, анализируя последовательности родительских антител и различные концептуальные продукты гуманизирования при использовании метода трехмерного моделирования родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и хорошо известными специалисту в данной области. Компьютерные программы, демонстрирующие возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов, также общедоступны. Анализ указанных изображений позволяет оценить вклад различных аминокислотных остатков в функциональные свойства выбранной последовательности иммуноглобулина, т.е. тех остатков, которые влияют на его способность связываться с соответствующим антигеном. С помощью указанного подхода остатки каркасных областей могут быть отобраны и скомбинированы с реципиентными и "импортными" последовательностями с получением антител, обладающих нужными свойствами, такими, как повышенная аффинность связывания с антигеном-мишенью. В целом, аминокислотные остатки гипервариабельных участков непосредственным образом и наиболее значимым образом вовлекаются в изменение ангигенсвязывающей активности.

(iv) Антитела человека

Как альтернатива гуманизированию, могут быть получены антитела человека. Например, в настоящее время это возможно при использовании трансгенных животных (например, мышей), в организме которых в результате иммунизации синтезируется полный спектр антител человека при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулинов. Например, известно, что гомозиготная делеция гена, кодирующего фрагмент, соединяющий участки тяжелых цепей антитела (J_H), в клетках зародышевой линии у химерных и мутантных мышей приводит к полному ингибированию эндогенной продукции антител. Перенос гена клеток зародышевой линии, кодирующего иммуноглобулин человека, в клетки таких мутантных мышей приводит к синтезу антител человека в организме указанных животных при соответствующей иммунизации антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993), а также патенты US 5591669, 5589369 и 5545807.

Кроме того, для получения антител человека и фрагментов антител in vitro может быть использована фагово-дисплейная технология (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990), основанная на создании библиотеки генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов иммунизированных доноров. В соответствии с этой технологией гены V-домена антитела клонируют в единой рамке считывания с генами большого и малого белков оболочки нитчатого бактериофага, например, М13 или fd, и функциональные фрагменты антител экспонируются на поверхности фаговой частицы. Поскольку фаговая частица содержит одноцепочечную копию фагового генома, отбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, обладающее такими свойствами. Таким образом, бактериофаг имитирует некоторые свойства B-клеток. Фагово-дисплейный метод может применяться различным образом; см., например, обзор Johnson, Kevin S. и Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Для осуществления фагово-дисплейного метода могут использоваться различные источники сегментов V-генов. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) выделил панель разнообразных антител к оксазолону из небольшой рандомизированной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированной мыши. Может быть сконструирован набор V-генов иммунизированных людей (доноров), на основе которого с помощью технологии, описанной Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). возможно получение антител, направленных к разным антигенам, в том числе аутоантигенам. См. также патенты US 5565332 и 5573905.

Антитела человека также могут быть получены in vitro с помощью активированных B-клеток (см. патенты US 5567 и 5229275).

(v) Фрагменты антител

Для получения фрагментов антител могут применяться различные технологии. Обычно такие фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител [см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]. Однако фрагменты антител в настоящее время могут быть получены прямым образом при использовании рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител выделяют из антительных фаговых библиотек, описанных выше. Альтернативно, Fab^'-SH фрагменты могут быть выделены из клеток Е. coli и химическим путем соединены между собой с образованием F(ab')₂-фрагментов [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. В соответствии с другим подходом F(ab')₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методики получения фрагментов антител должны быть понятны специалисту в данной области. В иных случаях нужным фрагментом антитела является одноцепочечный Fv фрагмент (scFv). См. WO 93/16185 и патенты US 5571894 и 5587458. Фрагмент антитела может быть и "линейным антителом", например, описанным в патенте US 5641870. Такие фрагменты могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

(vi) Биспецифические антитела

Биспецифические антитела - это антитела, которые специфичны по крайней мере к двум различным эпитопам. Например, такие антитела могут связывать два различных эпитопа поверхностного маркера B-клеток. Другим примером могут служить антитела, которые связывают первый B-клеточный маркер и второй B-клеточный маркер. Альтернативно, участок антитела, связывающий B-клеточный маркер, может быть скомбинирован с участком, который связывает молекулу-активатор, скажем, поверхностный рецептор лейкоцитов, такой, как T-клеточный рецептор (например, CD2 или CD3) или Fc- рецепторы Ig (FcγR), например, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16) так, чтобы усилить защитные механизмы B-клеток. Биспецифические антитела могут быть также использованы для локализации цитотоксических агентов на B-клетках. Такие антитела содержат участок, связывающий B-клеточный маркер, и участок, связывающий цитотоксический агент (например, сапорин, антиинтерферон альфа, алкалоид барвинка, А цепь рицина, метотрексат или меченный радиоизотопом гаптен). Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или антительных фрагментов (например, F(ab^')₂ биспецифических фрагментов).

Способы получения биспецифических антител известны из уровня техники. Обычная методика получения полноразмерных биспецифических антител основана на совместной экспрессии пар тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, имеющих различную специфичность [Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)]. Поскольку происходит выборочная сборка тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, такие гибридомы (квадромы) продуцируют смесь из 10 различных антительных молекул, из которых только одна будет иметь нужную биспецифическую структуру. Очистка указанных антител, которая обычно осуществляется с помощью аффинной хроматографии, значительно более сложная и выход продукта низкий. Аналогичные методики описаны в заявке WO 93/08829, а также в работе Trauncker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Согласно другому подходу вариабельные домены антител с нужной специфичностью (антигенсвязывающие области) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Слияние предпочтительно осуществляют с константными доменами тяжелых цепей, содержащими по крайней мере часть шарнирного участка, CH2 и CH3 участки. Желательно получить первый константный участок тяжелой цепи (CH1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи, по крайней мере в одном из продуктов слияния. ДНК, кодирующую слитую тяжелую цепь иммуноглобулина, и, если это необходимо, легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в отдельные векторы экспрессии, которыми совместно трансфицируют подходящий организм-хозяин. Это создает более широкие возможности для обеспечения должного соотношения между тремя полипептидными фрагментами в том случае, когда при конструировании с достижением оптимального выхода конечного продукта используются неравные соотношения трех полипептидных цепей. Однако возможно встраивать кодирующие последовательности двух или все трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, когда экспрессируются по крайней мере две полипептидные цепи в эквивалентном соотношении с высоким выходом или когда соотношения не имеют существенного значения.

В предпочтительном варианте осуществления указанного подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, обладающей специфической способностью к связыванию первого антигена на одном плече, и гибридной пары легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина (обладающей специфической способностью к связыванию второго антигена) на другом плече. Обнаружено, что такая асимметричная структура обеспечивает более легкое отделение нужной биспецифической конструкции от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, если легкая цепь иммуноглобулина составляет только половину от биспецифических молекул. Соответствующий подход раскрыт в заявке WO 94/04690. Для более детального ознакомления с методами получения биспецифических антител см., например, Suresh et al., Методы в энзимологии, 121:210 (1986).

В соответствии с другой методикой, описанной в патенте US №5731168, поверхность раздела между парой антительных молекул может быть создана для получения наибольшего процента гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела включает, по крайней мере, часть С_н3-домена константного участка антитела. Согласно данному методу одну или более аминокислот первого антитела с небольшими боковыми цепями, создающих поверхность раздела, заменяют аминокислотами, имеющими боковые цепи большего размера (например, тирозином и триптофаном). Равноценные полости идентичного или сходного размера, образуемые боковыми цепями большей величины, создают на поверхности раздела со стороны молекулы второго антитела замещением аминокислот с указанными боковыми цепями на аминокислоты с боковыми цепями меньшего размера (например, на аланин или треонин). Это позволяет увеличить выход гетеродимеров по отношению к выходу нежелательных конечных продуктов, представляющих собой гомодимеры.

К биспецифическим антителам относятся и перекрестно-связанные гетероконъюгаты антител. Например, одно антитело в таком гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое - с биотином. Такие антитела, например, направляют клетки иммунной системы на нежелательные клетки (патент US 4676980) и могут использоваться для лечения СПИДа (WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089). Гетероконъюгаты антител могут быть получены при использовании подходящих методов перекрестного связывания. Подходящие агенты для перекрестного связывания хорошо известны из уровня техники и раскрыты в патенте US 4676980 наряду с методиками перекрестного связывания.

В литературе также описаны способы получения биспецифических антител из фрагментов антител. Например, биспецифические антитела могут быть получены путем химического связывания. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описывают способ, согласно которому интактные антитела расщепляют протеолитически с получением F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии связывающего дитиол агента арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Далее Fab'-фрагменты переводят в производные тионитробензоата (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем обратно переводят в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством производного Fab'-TNB с получением биспецифического антитела. Полученные таким образом биспецифические антитела могут использоваться в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Успехи современной биотехнологии обеспечили возможность непосредственного выделения Fab'-SH фрагментов из Е.coli, которые могут быть химическим образом связаны с образованием биспецифических антител. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описывают способ получения полностью гуманизированных биспецифических антительных F(ab')₂ молекул. Каждый Fab'-фрагмент отдельно выделяют из Е. coli и подвергают прямому химическому связыванию in vitro с получением биспецифических антител. Полученные таким образом биспецифические антитела способны связываться с клетками, сверхэкспрессирующими Erb2-рецепторы, и нормальными T-клетками, инициируя литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека в отношении опухолевых клеток рака груди.

Известны также различные способы получения и выделения биспецифических антительных фрагментов непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела могут быть получены при использовании «лейциновых молний» [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)]. «Лейциновые зипперные пептиды» из Fos и Jun белков связывают с Fab'-участками двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител затем восстанавливают в шарнирном участке с получением мономеров и далее повторно окисляют до антительных гетеродимеров. Эта методика может использоваться и для получения гомодимеров антител. Технология «диател», описанная Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), предусматривает альтернативный подход к получению биспецифических фрагментов антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) с помощью линкера, который является настолько коротким, что обеспечивает взаимосвязь между двумя доменами одной и той же цепи. Соответственно, (V_H) и (V_L) домены одного фрагмента образуют пару с комплементарными (V_H) и (V_L) доменами другого фрагмента, формируя антигенсвязывающие области. Известна и другая методика получения фрагментов биспецифических антител при использовании одноцепочечных F_v(sF_v) димеров [см. Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)].

Известны также поливалентные антитела. Например, могут быть получены триспецифические антитела [Trutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

III. Конъюгаты и другие модификации антагонистов

Антагонисты, используемые в заявленных способах, или входящие в состав заявленных средств, могут быть конъюгированы с цитотоксическим агентом.

Химиотерапевтические агенты, полезные для получения такого рода конъюгатов антагониста и цитотоксического вещества, описаны выше.

Конъюгаты антагониста и одной или более небольших молекул токсинов, например, калихеамицина, мэйтанзина (патент US 5208020), трихотена и СС1065 также охватываются настоящим описанием. Согласно одному варианту осуществления изобретения антагонист конъюгируют с одной или более молекулами мэйтанзина (например, от около 1 до около 10 молекул мэйтанзина на молекулу антагониста). Мэйтанзин, например, может быть переведен в форму May-SS-Me, которая может быть восстановлена в форму May-SH3 и введен в реакцию с модифицированным антагонистом [Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)] для получения конъюгата мэйтанзиноид-антагонист.

Альтернативно, антагонист конъюгируют с одной или более молекулами калихеамицина. Антибиотики ряда калихеамицина способны генерировать повреждения двуцепочечной молекулы ДНК в субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы на практике, включают, без ограничений указанными, γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-ацетил-γ₁ ^I, PSAG и θ₁ ^I [Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) и Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)].

Энзиматически активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы на практике, включают А цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А цепь экзотоксина (Pseudomonas aerations), А цепь рицина, А цепь барина, А цепь модеццина, альфа-саркин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРН и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубл. 28 октября 1993 г.

Настоящее изобретение также относится к антагонистам, конъюгированным с соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой, как дезоксирибонуклеаза, ДНКаза).

Для получения антагонистов, конъюгированных с радиоактивными соединениями, могут использоваться многочисленные радиоактивные изотопы. Примерами таких изотопов могут служить At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu.

Конъюгаты антагониста и цитотоксического агента могут быть получены с помощью различных агентов, связывающих бифункциональные белки, таких, как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол) пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (такие, как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие, как глутаровый альдегид), бис-азидо соединения [такие, как бис(p-азидобензоил)-гександиамин], производные бис-диазония [такие, как бис (p-диазоний бензоил)-этилендиамин], диизоцианаты (такие, как толуол 2,6-диизоцианат) и биоактивные соединения фтора (такие, как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано Vitetta et al. Science 238:1098 (1987). Примером хелатирующего агента, используемого для конъюгирования радионуклеотида с антагонистом, может служить меченная С¹⁴ 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триаминпентауксусная кислота (MX-DTPA). См., например, WO 94/11026. Линкер может быть расщепляемым и обеспечивать высвобождение цитотоксического лекарственного препарата в клетку. Например, может быть использован чувствительный к кислоте линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992).

Альтернативно, могут быть получены белки слияния, содержащие антагонист и цитотоксический агент, например, с помощью рекомбинантной технологии или пептидным синтезом.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения антагонист может быть конъюгирован с рецептором (таким, как стрептавидин) для использования в целях предварительного нацеливания на опухоль, когда конъюгат антагониста с рецептором вводят пациенту, удаляют несвязавшийся конъюгат из циркуляции с помощью специального агента и затем вводят лиганд (например, авидин), который конъюгирован с цитотоксическим агентом (например, радионуклеотидом).

В соответствии с настоящим изобретением антагонисты могут быть конъюгированы с ферментом, активирующим пролекарство, который превращает пролекарство (например, пептидил химиотерапевтический агент, см. WO 81/01145) в активное лекарство против злокачественных опухолей. См, например, WO 88/07378 и патент US 4975278.

Фермент, входящий в состав таких конъюгатов, может быть представлен ферментом, способным воздействовать на пролекарство таким образом, чтобы превращать его в более активную, цитотоксическую форму.

Ферменты, которые могут быть использованы в заявленном способе, включают, без ограничений указанными, алкалинфосфатазу, способную превращать фосфат-содержащие пролекарства в свободные лекарства; арилсульфатазу, способную превращать сульфатсодержащие пролекарства в свободные лекарства; цитозиндезаминазу, способную превращать нетоксичный 5-фторцитозин в противораковое лекарство 5-фторурацил; протеазы, такие, как претеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие, как катепсины В и L), которые превращают пептидсодержащие пролекарства в свободные лекарства; D-аланилкарбоксипептидазы, конвертирующие пролекарства, содержащие D-аминокислотные заместители; ферменты, расщепляющие углеводы, такие, как бета-галактозидаза и нейраминидаза, расщепляющие гликозилированные пролекарства с образованием свободных лекарств; бета-лактамаза, расщепляющая лекарства, модифицированные с помощью бета-лактамов, в свободные лекарства; пенициллинамидазы, такие, как пенициллин V амидаза или пенициллин G амидаза, превращающие лекарства, модифицированные по аминогруппам с помощью феноксиацетиловых или фенилацетиловых групп, соответственно, в свободные лекарства. Альтернативно, антитела с энзиматической активностью, известные из уровня техники как «абзимы», могут использоваться для превращения пролекарств, заявленных в соответствии с изобретением, в свободные активные лекарства [см., например, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)]. Конъюгаты антагониста с абзимами, используемые для доставки абзима к популяции опухолевых клеток, могут быть получены, как раскрыто в настоящем описании.

Ферменты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть ковалентно связаны с антагонистом с помощью методик, хорошо известных из уровня техники, например, при использовании гетеробифункциональных перекрестно-связывающих реагентов, описанных выше. Альтернативно, с помощью хорошо известной технологии рекомбинантных ДНК могут быть получены белки слияния, содержащие по крайней мере антигенсвязывающую область заявленного в соответствии с настоящим изобретением антагониста, соединенную по крайней мере с функционально активным участком фермента, заявленного в соответствии с настоящим изобретением [см., например, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)].

Другие модификации антагониста раскрыты в настоящем описании. Например, антагонист может быть связан с одним из многочисленных полимеров небелковой природы, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

Раскрытые в настоящем описании антагонисты могут быть заключены в липосомы. Содержащие антагонист липосомы могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, описанными Epstein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980), а также в патентах US 4485045 и 4544545 и заявке WO 97/38731, опубл. 23 октября 1997 г. Липосомы с увеличенным временем циркуляции в крови раскрыты в патенте US 5013556.

Особенно предпочтительные липосомы могут быть получены методом обратно-фазового выпаривания и сформированы композицией липидов, включающей фосфатидилхолин, холестерол и фосфатидилэтаноламин, модифицированный полиэтиленгликолем (PEG-РЕ). Липосомы пропускают через фильтры с заданным размером пор для получения липосом нужного диаметра. Fab'-фрагменты антитела, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, могут быть конъюгированы с липосомами, как описано Martin et al., J. Biol Chem. 257: 286-288 (1982) в реакции образования межцепочечных дисульфидных связей.

С лиосомами может быть конъюгирован химиотерапевтический агент. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

Настоящим изобретением охватываются также модификации аминокислотных последовательностей белковых или пептидных антагонистов. Например, при необходимости могут быть улучшены связывающая аффинность и/или другие биологические свойства антагониста. Варианты аминокислотных последовательностей антагониста получают введением соответствующих нуклеотидных замен в последовательность нуклеотидов, кодирующую антагонист, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены аминокислотных остатков в белковой или пептидной последовательности антагониста. Для получения антагонистов, обладающих необходимыми свойствами, могут быть использованы любые комбинации аминокислотных делеций, инсерций и замен. Аминокислотные замены могут изменять пост-трансляционную модификацию антагониста, например, изменять число или положение сайтов гликозилирования.

Полезным методом идентификации определенных аминокислотных остатков или участков молекулы антагониста, которые являются предпочтительными для мутагенеза, является "аланинсканирующий метагенез". Указанный метод описания Cunningham и Wells, Science 244: 1081-1085 (1989). Согласно данному методу идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие, как arg, asp, his, lys и glu) и замещают их нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (наиболее предпочтительно, аланином или полиаланином) с достижением взаимодействия аминокислот с антигеном. Такие положения аминокислот, обнаруживающие функциональную чувствительность к заменам, далее модифицируют введением указанных аминокислот или других вариантов. Таким образом, в то время как сайт введения вариантов аминокислотной последовательности предетерминирован, природа мутации per se не обязательно может быть предетерминированной. Например, для анализа осуществления мутации в данном сайте аланин-сканирующий или выборочный мутагенез проводят в кодоне-мишени и участке-мишени и экспрессируемые варианты антагонистов подвергают скринингу на заданную активность.

Вставки аминокислотных последовательностей включают амино- и карбокси-концевые слитые участки, варьирующие по длине от одного остатка до полипептида, содержащего сто или более аминокислотных остатков, а также участки из одной или нескольких аминокислотных остатков, находящихся внутри последовательностей. Примерами концевых вставок являются антагонисты с N-концевым остатком метионина или антагонисты, слитые с цитотоксическим полипептидом. Другие инсерционные варианты антагонистов включают антагонисты, слитые по N- и C-концевым участкам с молекулами ферментов или полипептидов, усиливающих время полужизни антагонистов в сыворотке крови.

К другому типу вариантов антагонистов относятся варианты, основанные на замещении аминокислотных остатков. В этих вариантах по крайней мере один аминокислотный остаток в молекуле антагониста замещен на другой остаток. Сайты, наиболее предпочтительные для осуществления замещающего мутагенеза в молекуле антитела, включают гипервариабельные участки, но каркасные области также могут быть задействованы. Консервативные замены приведены в Таблице 1 под заголовком "Предпочтительные замены". Если такие замены изменяют биологическую активность, то они являются наиболее предпочтительными и приведены в Таблице 1 под заголовком "Наиболее предпочтительные замены" или раскрываются ниже со ссылкой на классы аминокислот.Такие замены вводят в молекулы антагонистов и полученные 5 продукты подвергают скринингу.

Существенные модификации биологических свойств антагонистов сопровождаются избирательными заменами, которые значительно различаются по способности поддерживать (а) структуру полипептидного остова в области замены, например, складчатую или спиральную конформацию, (б) заряд или гидрофобность молекулы в сайте-мишени и (в) размеры боковой цепи. Природные остатки подразделяются на группы в зависимости от общих свойств боковых цепей:

гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;

нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;

кислые: asp, glu;

основные: asn, gin, his, lys, arg;

остатки, которые влияют на ориентацию цепей: gly, pro и

ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замены включают замены аминокислотных остатков одного класса на аминокислотные остатки другого класса.

Цистеиновые остатки, которые не вовлечены в поддержание должной конформации антагониста, также могут быть замещены, в основном, серином, для усиления устойчивости молекулы к окислению и предотвращения нежелательного перекрестного связывания. Напротив, цистеиновые связи могут быть введены в молекулу антагониста для улучшения ее стабильности (особенно в тех случаях, когда антагонист представляет собой фрагмент антитела, такой, как Fv фрагмент).

Особенно предпочтительные варианты антагонистов, основанные на замещении аминокислот, включают варианты, в которых замещения сделаны в гипервариабельных участках исходного антитела. В основном, такие варианты, отобранные для дальнейшей модификации, имеют улучшенные биологические свойства по отношению к исходному антителу, из которого они получены. Подходящим способом получения таких вариантов является аффинное созревание при использовании фагово-дисплейной методики. Коротко говоря, несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) подвергают мутагенезу с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антитела далее выявляют в моновалентной форме на поверхности частиц нитчатого бактериофага в форме их слияния с продуктом гена III бактериофага М13, упакованного в фаговую частицу. Фагово-дисплейные варианты затем скринируют на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в настоящей заявке. Для того, чтобы идентифицировать возможные сайты модификации гипервариабельных участков, можно осуществить аланин-сканирующий мутагенез, позволяющий идентифицировать остатки гипервариабельных участков, которые в значительной степени обеспечивают связывание антигена. Альтернативно или дополнительно может оказаться полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для того, чтобы идентифицировать точки контакта между антигеном и антителом. Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются потенциальными мишенями для замещения, согласно методикам, представленным в настоящем описании. После создания таких вариантов, их подвергают скринингу, как описано в настоящей заявке, и антитела с улучшенными свойствами, как это устанавливается в одном ли нескольких соответствующих исследованиях, отбирают для дальнейшей модификации.

Другим аминокислотным вариантом антагониста является такой, при котором изменяется первоначальный профиль гликозилирования антагониста. Под изменением подразумевается делеция одной или более углеводной молекулы антагониста, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют у антагониста.

Гликозилирование полипептидов обычно является N-связанным или O-связанным. N-связанное гликозилирование представляет собой присоединение углеводной молекулы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, являются последовательностями для ферментативного присоединения углеводной молекулы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие трипептидных последовательностей в составе полипептида создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование заключается в прикреплении одного из Сахаров, к которым относятся N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиаминокислоте, большей частью серину или треонину, хотя 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин также могут быть использованы.

Добавление сайтов гликозилирования к антагонисту сопровождается изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она включает один или более описанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть сделано добавлением, замещением одного или более остатков серина или треонина в аминокислотной последовательности исходного антагониста (сайты O-связанного гликозилирования).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антагониста, получают с помощью разнообразных способов, хорошо известных специалистам в данной области. К таким способам относятся (без ограничений указанными) выделение нуклеиновой кислоты из природных источников (в случае наличия природных вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью опосредованного олигонуклеотидами (или сайт-специфического) мутагенеза, мутагенеза с помощью ПЦР, а также с помощью кассетного мутагенеза ранее полученных вариантных или невариантных версий антагониста.

Может оказаться желательным модифицировать заявленный в соответствии с изобретением антагонист с целью придания ему эффекторных функций, например, усилить ADCC и/или CDC антагониста. Это может быть достигнуто введением одной или более аминокислотных замен в Fc-участок антитела, являющегося антагонистом. Альтернативно или дополнительно в Fc-участок можно ввести один или более цистеиновых остатков, тем самым, обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этом участке. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь улучшенную способность к интернализации и/или повышенную опосредованную комплементом киллерную активность и повышенную ADCC. См. Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) Shopes, В., J. Immunol. 148: 2918:2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью могут быть получены при использовании гетеробифункциональных перекрестно-связывающих линкеров, описанных Wolf et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Альтернативно, может быть получено антитело, имеющее два Fc-участка и, соответственно, повышенную способность к комплементопосредованному лизису и повышенную ADCC. См. Stevenson et al. Anticancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Для увеличения времени полужизни антагониста в сыворотке крови в него может быть введен эпитоп, связывающий "спасающий рецептор" (в особенности, антительный фрагмент), как описано, например, в патенте US 5739277. Используемый здесь термин "эпитоп, связывающий спасающий рецептор", относится к эпитопу на Fc-участке молекулы Ig (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение времени полужизни молекулы Ig в сыворотке крови in vivo.

IV. Фармацевтические композиции

Терапевтически активные композиции антагониста, используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают смешиванием антагониста с необходимой степенью чистоты и необязательных[фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или стабилизаторов [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-ое издание, под ред. Osol, А. (1980)] и хранят в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Подходящие носители, наполнители или стабилизаторы, которые нетоксичны для пациента в используемых дозах и концентрациях, включают буферы, такие, как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты, такие, как октадецилдиметилбензил хлорид аммония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутил или бензиловый спирт, алкил-парабены, например, метил- или пропил-парабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и m-крезол); пептиды низкой молекулярной массы (менее 10 аминокислотных остатков); белки, такие, как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие, как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие, как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстраны; хелатирующие агенты, такие, как EDTA; сахара, такие, как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; образующие соли противоионы; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы) и/или неионные сурфактанты, такие, как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Примеры композиций на основе антител к CD-20 описаны в заявке WO 98/56418, включенной в настоящее описание исключительно в качестве ссылки. В указанной заявке раскрываются жидкие мультидозовые композиции, содержащие 40 мг/мл ритуксимаба, 25 мМ ацетата, 150 мМ трегалозы, 0.9% бензилового спирта, 0.02% полисорбата при pH 5.0, которая имеет время хранения два года при 2-8°C. Другие представляющие интерес фармацевтические композиции на основе антител к CD-20 содержат 10 мг/мл ритуксимаба в 9.0 мг/мл хлорида натрия, 7.35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0.7 мг/мл полисорбата 80 и стерильную воду для инъекций при pH 6.5.

Лиофилизированные композиции, пригодные для подкожного введения, описаны в заявке WO 97/04801. Такие лиофилизированные композиции могут быть восстановлены для применения с помощью подходящего растворителя с достижением высокой концентрации белка и далее введены подкожно млекопитающему, нуждающемуся в лечении.

Фармацевтические композиции могут содержать более одного активного соединения, если это необходимо для лечения определенного заболевания, предпочтительно, с комплементарными активностями, которые не оказывают неблагоприятного влияния друг на друга. Например, может оказаться желательным ввести в состав композиции цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, цитокин или иммуносупрессор (например, действующий на T-клетки, такой, как циклоспорин или антитело, связывающее T-клетки, скажем, взаимодействующее с LFA-1). Эффективное количество таких ингредиентов зависит от количества антагониста, содержащегося в композиции, характера заболевания или нарушения, которые подлежат лечению, и других факторов, описанных выше. Обычно такие компоненты используются в тех же самых дозах и вводятся тем же самым путем, как описано выше, или же их количество составляет около 1-99% указанных доз.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, которые получают, например, методом коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы или поли-метилметацилатные микрокапсулы, соответственно, а также в коллоидные системы доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и монокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-ое издание, под ред. Osol, А. (1980).

Могут быть получены препараты с поддерживаемым высвобождением. Примерами таких препаратов служат полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист, которые имеют определенные параметры, например, находятся в виде пленки или микрокапсул. Примеры матриц с поддерживаемым высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат или поливиниловый спирт], полилактиды (патент US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и у этил-L-глутамата, нераспадающийся этиленвинилацетат, распадающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие, как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, содержащие сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетат) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Композиции, используемые in vivo, должны быть стерильными, что обеспечивается фильтрованием через стерилизующие мембранные фильтры.

V. Терапия антагонистами

Настоящее изобретение относится к терапии субпопуляции млекопитающих, в особенности, людей, страдающих от аутоиммунного заболевания или предрасположенных к нему, у которых обнаруживается неадекватный ответ на предшествующее или текущее лечение ингибитором TNF-альфа. В целом, млекопитающее, подлежащее терапии согласно заявленному изобретению, идентифицируют в процессе одного или более курсов лечения одним или более ингибиторами TNF-альфа, такими, как этанерсепт (ENBREL®), инфликсимаб (REMICADE®) или адалимумаб (HUMIRA™), на основании выявления у него неадекватного ответа на предшествующее или текущее лечение ингибитором TNF-альфа, поскольку оно оказывается токсичным и/или недостаточно эффективно. Однако изобретение не ограничивается оценкой предшествующей стадии терапии с использованием ингибитора TNF-альфа, например, пациент может считаться имеющим склонность к проявлению токсичности, например, кардиологической, по отношению к ингибитору TNF-альфа до того, как начато лечение, или же пациент может быть выбран, как нежелательным образом отвечающий на терапию ингибитором TNF-альфа.

Аутоиммунные заболевания, которые подлежат лечению в соответствии с настоящим изобретением, приведены выше в разделе "Определения". Предпочтительными заболеваниями являются ревматоидный артрит, псориатический артрит или болезнь Крона.

В целом, млекопитающее, которое подлежит лечению в соответствии с заявленным изобретением, не имеет злокачественной B-клеточной патологии.

Согласно одному варианту осуществления заявленное изобретение относится к способу терапии, направленному на снижение побочных эффектов (например, инфекций, сердечной недостаточности и демиелинизации), сопровождающих лечение с помощью ингибитора TNF-альфа.

Композиции, содержащие антагонист, который связывается с поверхностным маркером B-клеток, могут быть приготовлены, дозированы и введены в соответствии с существующей медицинской практикой. В контексте настоящего описания значащими факторами применительно к используемой терапии являются природа заболевания или нарушения, подлежащего лечению, вид млекопитающего, клиническое состояние пациента, тяжесть заболевания или нарушения, участок, в который необходимо доставить действующее вещество, способ введения лекарственного средства, схема лечения и другие факторы, известные в медицинской практике. Терапевтически эффективное количество антагониста, который необходимо ввести пациенту, подбирается в зависимости от указанных факторов.

В целом, терапевтически эффективное количество антагониста, вводимое парентерально, варьирует от около 0.1 до около 20 мг на кг массы тела пациента в расчете на день, причем обычная первоначальная доза антагониста составляет около 2-10 мг/кг.

Предпочтительным антагонистом является антитело, например, такое, как RITUXAN®, которое не конъюгировано с цитотоксическим агентом. Подходящими дозами неконъюгированного антитела, являются, например, такие дозы, как от около 20 мг/м² поверхности тела до около 1000 мг/м² поверхности тела. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения доза антитела отличается от таковой, в настоящее время рекомендуемой для RITUXAN®. Например, можно вводить пациенту одну или более доз антитела, значительно меньших, чем 375 мг/м² поверхности тела, например доза может варьировать от около 20 мг/м² поверхности тела до около 250 мг/м поверхности тела, в том числе от около 50 мг/м² до около 200 мг/м².

Примеры дозовых режимов включают 375 мг/м² поверхности тела еженедельно в течение четырех недель или 1000 мг/м² поверхности тела дважды, например, в день 1 и 15.

Более того, можно вводить одну или более первоначальных доз антитела и далее одну или более последующих доз, причем последующая доза антитела в мг в расчете на м² поверхности тела превышает предыдущую. Например, первоначальная доза может составлять от около 20 мг/м² поверхности тела до около 250 мг/м² поверхности тела, в том числе от около 50 мг/м² до около 200 мг/м², а последующая от около 250 мг/м² поверхности тела до около 1000 мг/м² поверхности тела.

Как отмечалось выше, указанные предполагаемые количества антагониста в значительной степени зависят от конкретной ситуации и подбираются с осторожностью. Ключевым фактором выбора дозы и схемы ее введения является тот конечный результат, которого хотят достигнуть. Например, относительно высокие дозы могут быть необходимы первоначально для лечения постоянно развивающегося заболевания и острого заболевания. Для достижения максимальной эффективности в зависимости от заболевания или нарушения антагонист вводят как можно раньше по отношению к первому симптому, проявлению или обнаружению заболевания или нарушения или к постановке диагноза, а также во время ремиссии заболевания или нарушения.

Антагонист может вводиться любым подходящим способом, например, парентеральным, подкожным, интраперитонеальным, внутрилегочным и интраназальным, а также, если это желательно, проводят местное иммуносупрессивное лечение, применяя антагонист непосредственно в зоне повреждения. Парентеральные способы введения включают в том числе внутримышечный, внутривенный и внутриартериальный. Кроме того, антагонист может вводиться пульсовой инфузией, например, с понижением дозы. Доза, вводимая путем инъекций, наиболее предпочтительно, внутривенных или подкожных, зависит отчасти от того, является ли введением краткосрочным или постоянным.

Совместно с антагонистом могут вводиться другие соединения, такие, как цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, иммуносупрессивные агенты и/или цитокины. Комбинированное введение включает совместное введение при использовании отдельных препаратов или одной фармацевтической композиции и последовательное введение в определенном порядке, причем существует период времени, когда два (или все) активных агента одновременно проявляют свою биологическую активность. Для ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний антагонист (например, антитело к CD20) может быть объединено с одним или более DMARDs, таких, как гидроксихлороквин, сульфазалазин, метотрексат, лефлуномид, азатиоприн, D-пеницилламин, Gold (перорально), Gold (внутримышечно) миноциклин, циклоспорин, иммуноадсорбент белок A стафилококка, внутривенный иммуноглобулин (IVIG), нестероидные противовоспалительные средства, глюкокортикоиды (например, внутрисуставной инъекцией), кортикостероиды (например, метилпреднизолон и/или преднизолон), фолат и др. Предпочтительно, ингибитор TNF-альфа не вводят млекопитающему во время лечения антагонистом CD 20.

Помимо использования белкового антагониста, вводимого пациенту в терапевтических целях, настоящее изобретение относится к применению антагониста для генной терапии. Такое применение основано на использовании нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтически эффективное количество антагониста. См., например, заявку WO 96/07321, опубл. 14 марта 1996 г., которая касается генной терапии, обеспечивающей синтез внутриклеточных антител.

Существуют два основных подхода введения нуклеиновой кислоты (необязательно встроенной в вектор) в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки нуклеиновой кислоты in vivo ее непосредственным образом инъецируют пациенту, обычно в тот участок, где требуется воздействие антагониста. Для терапии ex vivo выделяют клетки пациента, вводят в них нуклеиновую кислоту и таким образом модифицированные клетки обратно вводят пациенту как непосредственным образом или инкапсулируют в пористые мембраны, которые имплантируют в организм пациента (см., например, патенты US 4892538 и 5283187). Для введения нуклеиновой кислоты в живые клетки существуют разнообразные методы. Их выбор зависит от того, вводится ли нуклеиновая кислота в культивируемые клетки in vitro или же in vivo в клетки выбранного хозяина. Методика, подходящая для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включает применение липосом, электропорацию, микроинъекции, слияние клеток, а также DEAE-декстрановый и кальцийфосфатпреципитирующий методы и многие другие. Обычным вектором, используемым для доставки нужного гена в клетки in vivo, является ретровирусный вектор.

Используемые в настоящее время предпочтительные технологии переноса нуклеиновых кислот in vivo включают трансфекцию с помощью вирусных векторов (таких, как аденовирусные, аденоассоциированные и векторы на основе вируса простого герпеса типа I) и систем, основанных на липидах (полезными липидами для липидопосредованной трансфекции генов являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых случаях желательно связать нуклеиновую кислоту с агентом, обеспечивающим ее нацеливание на нужные клетки-мишени, например, с антителом, специфическим по отношению к поверхностному мембранному клеточному белку на клетках-мишенях, лигандом, связывающим рецептор на клетках-мишенях и т.д. При использовании липосом для нацеливания и/или обеспечения захвата нуклеиновой кислоты могут быть применены белки, которые связываются с поверхностным мембранным белком, ассоциированным с эндоцитозом, например, капсидные белки или их фрагменты, обладающие тропностью по отношению к определенному типу клеток, антитела к белкам, которые подвергаются интернализации в процессе клеточного цикла, а также белки, которые нацеливают нуклеиновую кислоту на внутриклеточную локализацию и увеличивают ее период полужизни в клетках. Методика опосредованного рецепторами эндоцитоза описана, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987) и Wagner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990). Для ознакомления с современными методиками маркировки генов и генной терапии см. обзор Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992), заявку WO 93/25673 и приведенные в ней источники информации.

Пример 1

Пациенту с активным ревматоидным артритом, у которого наблюдается неадекватный ответ на один или несколько ингибиторов TNFα, проводится лечение антителом, которое связывается с поверхностным антигеном B-клеток CD20.

Кандидатами для такой терапии, согласно данному примеру, являются пациенты, у которых наблюдался неадекватный ответ на предшествующую или текущую терапию этанерсептом, инфликсимабом и/или адалимумабом, связанный с токсичностью или недостаточной эффективностью (этанерсепт ≥3 месяцев в дозе 25 мг два раза в неделю или по крайней мере 4 инфузии инфликсимаба ≥3 мг/кг) этих препаратов.

Пациенты при скрининге и рандомизированных исследованиях могут иметь значение показателя припухлости суставов (SJC)≥8 (исследовали 66 суставов) и показателя болезненности суставов (TJC) ≥8 (исследовали 68 суставов), а также значения С-реактивного белка ≥1.5 мг/дл (15 мг/л) или СОЭ ≥28 мм/ч, и/или же рентгенологические признаки поражения по крайней мере одного сустава в виде эрозий суставной поверхности, что специфично для ревматоидного артрита и определяется в основных суставах, которые поражаются при ревматоидном артрите (можно учитывать изменения в любых суставах кисти, запястья и стоп, за исключением дистальных межфаланговых суставов кисти).

Для терапии можно использовать антитело к CD20, а именно ритуксимаб (коммерчески доступный препарат компании Genentech, Inc.) или гуманизированное антитело 2Н7 v16.

Пациентам вводят терапевтически эффективные дозы антитела к CD20, например, 1000 мг внутривенно в дни 1 и 15, или 375 мг/м² внутривенно еженедельно в течение 4 недель.

Пациенты также могут получать сопутствующую терапию МТХ (10-25 мг/в неделю перорально или парентерально) совместно с кортикостероидами, включая метилпреднизолон в дозе 100 мг внутривенно в течение 30 минут перед введением антитела к CD20 и преднизолон в дозе 60 мг перорально в дни лечения 2-7 и в дозе 30 мг перорально в дни лечения 8-14 с возвращением к основной дозе с 16-го дня. Пациенты также могут получать фолат (5 мг в неделю) в однократной дозе или разделенной на несколько приемов. В течение периода лечения пациенты могут продолжать получать базовую терапию кортикостероидами (≤10 мг преднизолона в день или его эквивалента).

Первичным конечным результатом может быть пропорция числа пациентов с ACR20-ответом на 24-ой неделе, которая устанавливается при сравнении групповых различий пациентов с использованием теста Кохрана-Мантеля-Хэнзеля (СМИ) в отношении ревматоидного фактора.

Возможные вторичные конечные результаты включают:

1. Пропорцию пациентов с ACR50 и ACR70 ответами на 24-ой неделе. Эти пациенты могут быть исследованы, как и в случае первичного конечного результата.

2. Изменение показателя активности заболевания (DAS) от начала скрининга до 24-ой недели. Это может быть сделано при использовании компьютерной модели ANOVA с базовой линией DAS, ревматоидным фактором и обработкой данных, как это предусмотрено разработчиком модели.

3. Пациенты с безусловным DAS (EULAR-ответ) на 24-ой неделе. Такие пациенты могут быть выявлены при использовании теста СМИ в отношении ревматоидного фактора.

4. Изменения при скрининге основных показателей ACR (SJC, TJC, общая оценка пациентами и их врачами, HAQ, боль, C-реактивный белок, СОЭ). Для этих параметров может быть использована описательная статистика.

5. Изменения при скрининге с помощью методики SF-36. Описательная статистика может быть применена для оценки 8 доменов и ментальных и физических компонентов. Кроме того, оценка ментальных и физических компонентов далее может быть категоризована и подвергнута анализу.

6. Изменение общего радиографического показателя в модификации Шарпа, оценка эрозии, оценка близлежащей области к суставу. Эти показатели могут быть проанализированы при использовании методики длительного наблюдения и категоризации, как общепринято.

Диагностические конечные результаты и анализы могут включать:

ACR (20/50/70 и ACR n) и изменение DAS на неделе 8, 12, 16, 20, 24 и далее могут быть оценены при использовании бинарной модели или модели, основанной на постоянно повторяющихся измерениях, как общепринято. Диагностический радиографический анализ, включающий определение пропорции пациентов, не имеющих прогрессивного развития эрозий, может быть проведен на 24-ой неделе и далее.

Другие диагностические конечные результаты (например, полный клинический ответ, период отсутствия заболевания) могут быть проанализированы с помощью описательной статистики как составляющей части исследований во время продленного периода наблюдения.

Изменения при скрининге утомления (методика FACIT-F) могут быть проанализированы с помощью описательной статистики.

Терапия РА антителом к CD20 применительно к пациентам с неадекватным ответом на ингибитор TNFα, описанная выше, может привести к улучшенному клиническому состоянию в соответствии с одним или более показателями конечных результатов, раскрытыми ранее в настоящей заявке.

Настоящее изобретение относится к терапии ритуксимабом, который связывается с поверхностными маркерами В-клеток, например CD20. Подробнее изобретение касается применения ритуксимаба для лечения ревматоидного артрита у млекопитающего с неадекватным ответом на ингибитор TNF-альфа. Изобретение обеспечивает уменьшение повреждения сустава у пациентов. 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Применение ритуксимаба для лечения ревматоидного артрита для достижения благоприятного клинического ответа у пациента с неадекватным ответом на ингибитор TNFα, которое предусматривает введение ритуксимаба в виде двух доз по 1000 мг, где первая доза ритуксимаба вводится на 1 день лечения и вторая доза только на 15 день, причем пациент также получает метотрексат, и где благоприятный клинический ответ проявляется в ACR50 ответе, или ACR70 ответе, или в отсутствии развития эрозий на 24-й неделе после 1 дня.

2. Применение ритуксимаба по п.1, при котором пациент дополнительно лечится кортикостероидным режимом.

3. Применение ритуксимаба по п.2, при котором кортикостероидный режим включает метилпреднизолон и преднизон.

4. Применение ритуксимаб по любому из пп.1-3, при котором благоприятный клинический ответ проявляется в ACR50 ответе.

5. Применение ритуксимаба по любому из пп.1-3, при котором благоприятный клинический ответ проявляется в ACR70 ответе.

6. Применение ритуксимаба по любому из пп.1-3, в котором благоприятный клинический ответ проявляется в отсутствии развития эрозий на 24-й неделе.