СПОСОБ ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТЕРОИДНОМ ОСТЕОПОРОЗЕ Российский патент 2009 года по МПК A61K35/48 A61P19/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано при лечении экспериментального стероидного остеопороза.

Известен способ влияния миакальцика на перестройку структуры костной ткани при экспериментально индуцируемом остеопорозе (Дедух Н.В., Маколинец В.И., Малышкина С.В. Экспериментально-клинические аспекты применения миакальцика в ортопедии и травматологии. - Науч.-практ. журнал «Проблемы остеологии», Киев, Т.4, №1-2, 2001, С.57-58). Исследования проводили на молодых крысах с индуцированным алиментарным остеопорозом. Курс лечения составлял 1 месяц по 1,5 МЕ/кг веса ежедневно. Исследованы под световым микроскопом позвоночные сегменты грудопоясничного отдела крыс и проведен морфометрический анализ анатомических параметров тел позвонков. Увеличение плотности трабекулярной кости отмечалось только после полного курса лечения. Однако восстановление структуры костной ткани проходит медленным темпом и для получения первых положительных результатов (увеличение плотности костной ткани) необходим длительный курс приема миокальцика, кроме того, требуются повторные курсы лечения, а миокальцик является дорогим препаратом.

Известно использование гипербарической оксигенации (ГБО) при лечении переломов (Краснов А.Ф., Давыдкин Н.Ф. Гипербарическая оксигенация при лечении переломов, изд. Саратовский университет, 1991, с.23-25.) и удлинении конечности (Сазонова Н.В. Эффективность гипербарической оксигенации при удлинении конечностей методом чрескостного дистракционного остеосинтеза у детей и подростков. Автореф. дисс. канд. мед. наук, Курган, 2002, с.9-11).

Известен способ изменения структуры костной ткани при экспериментальном остеопорозе, заключающийся в том, что организм опытного животного насыщают кислородом в условиях избыточного барометрического давления в 2 ата, курс лечения составляет 10 ежедневных сеансов (патент RU 2295324, 2007 г.). Способ ускоряет ремоделирование костной ткани при экспериментальном посттравматическом остеопорозе.

Известен способ лечения костных нарушений, характеризующийся тем, что используют наборы, содержащие стандартные дозы бисфосфонатов в количестве, достаточном для использования в течение «ударного» периода, который составляет от 7 до 180 дней, и стандартные дозы бисфосфоната для последующего использования в течение поддерживающего периода, при этом бисфосфонат выбирают из группы, состоящей из ризедроната, алсндроновой кислоты, памидроната, тилудроната, клодроната, цимадроната, ибандроната, золедроната и их солей и сложных эфиров, а стандартные дозы бисфосфоната «ударного» периода от 3 до 6 раз выше, чем стандартные дозы бисфосфоната поддерживающего периода (патент RU 2294203, 2007 г.). Использование наборов бисфосфонатов при указанном соотношении доз «ударного» и поддерживающего периодов обеспечивает увеличение костной массы при остеопорозе различного генеза.

Прототипом изобретения является способ лечения остеопороза, заключающийся во внутривенном капельном введении мезенхимальных стволовых клеток (МСК) от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора, при этом МСК получают из фетального, донорского или аутологичного материала, а в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности (патент RU 2265442, 2005 г.). Изобретение обеспечивает быстрое восстановление плотности костной ткани, положительную динамику биохимических показателей, позволяющих оценить костеобразование, и улучшение двигательной активности пациента. Данный способ является сложным и трудоемким, так как для получения культуры клеток с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего упрощение и сокращение времени методики, ускорение ремоделирования костной ткани.

Технический результат при использовании изобретения - уменьшение диаметра костномозгового канала, увеличение толщины корковой пластинки, повышение объемной плотности костной ткани, восстановление костного дифферона: стволовых, полустволовых клеток, остеобластов и остеоцитов.

Предлагаемый способ изменения структуры костной ткани при экспериментальном остеопорозе осуществляется следующим образом: в костномозговой канал бедренной кости опытного животного однократно вводят 0,5 гомогената эмбриональной ткани сроком 10 дней.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими чертежами: на фиг.1 изображены деструктивные процессы пластинчатой кости на 25 сутки в контрольной группе. Окраска гематоксилин-эозин. Микрофото, ок. 10, об. 40; на фиг.2 - разрастание волокнистой соединительной ткани в межбалочных пространствах позвонка на фоне стероидного остеопороза на 25 сутки. Окраска гематоксилин-эозин. Микрофото, ок. 10, об. 20; на фиг.3 - дифференцировка остеоцитов и увеличение межклеточного вещества в зоне трансплантации стволовых клеток на 25 сутки после трансплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Микрофото, ок. 10, об. 40; на фиг.4 - расширение зоны расположения костной ткани в теле позвонка через 25 дней после трансплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Микрофото, ок. 10, об. 40.

Для получения материала для трансплантации у беременных крыс под эфирным наркозом выделяли эмбрионы на 10 день. Забор гомогената проводили путем набора всей массы эмбриона в шприц.

Для осуществления способа были подготовлены две серии лабораторных крыс со стероидным остеопорозом: контрольная и опытная. Лабораторные крысы мужского пола линии Вистар в возрасте 3-4 месяцев, весом примерно 120-140 г, на которых провели моделирование стероидного остеопороза. Введение преднизолона внутрь осуществлено через желудочный зонд в дозе 50 мг/кг 40 крысам в течение 14 дней по описанной модели (Сравнительное изучение эффективности димефосфона и ксидифона при стероидном остеопорозе у крыс. Л.Е.Зиганшина, З.А.Бурнашова, И.X.Валеева, А.Ю.Галяутдинова, Н.С.Самойлова. - Экспериментальная и клиническая фармакология, 2000, №6, с.39-42). Под эфирным наркозом у опытной группы со стероидным остеопорозом шилом проходили под надколенником в костномозговой канал правого бедра. Далее шприцем вводили 0,5 мл гомогената из клеток эмбриона в костномозговой канал. В контрольной группе животных в костномозговой канал правого бедра введено 0,5 мл физраствора.

Гистологическое исследование проводилось методами световой микроскопии и морфометрии. Для статистической обработки материала эксперимента использовали видеокомплекс «ДиаМорф» (Москва) с программным продуктом "Microson Excel". Для исследования брали фрагменты диафиза верхней и нижней трети бедра, грудопоясничного отдела позвоночника. После необходимой фиксации в 10% формалине взятый материал был обызвествлен в 7% азотной кислоте. Часть срезов была изготовлена в криостате при температуре -20°С, другую часть уплотнили с помощью парафина. Все срезы толщиной 10 мкм окрашивались гематоксилин-эозином.

При сравнительном анализе морфологических изменений костной ткани контрольной серии животных (крысы линии Вистар) с экспериментальным стероидным остеопорозом и опытной серии (после пересадки эмбриональных клеток) выявлено, что у крыс со стероидным остеопорозом нарушается ремоделирование костной ткани с преобладанием резорбтивных процессов: увеличение диаметра костномозгового канала, уменьшение толщины кортикальной пластинки и снижение новообразованной костной ткани (объемная плотность губчатой кости).

У контрольной группы животных трубчатая кость в области диафиза состоит из наружных и внутренних общих пластинок и между ними остеона. Определяется наружная генеральная пластинка, состоящая из костных пластинок и между ними остеоциты, расположенные в костных полостях. К костной пластинке прилегает надкостница, где выделяют внутренний и наружный слои. Во внутреннем слое располагаются малодифференцированные клетки, в том числе остеобласты. К наружному волокнистому слою прикрепляется поперечнополосатая мышечная ткань. Костные пластинки вокруг кровеносных сосудов образуют остеонную систему, состоящую из клеток и межклеточного вещества. Внутренняя общая пластинка с внутренней стороны, со стороны костномозговой полости, покрыта эностом. Кровеносные сосуды костной ткани умеренного кровенаполнения (фиг.1).

При остеопорозе костные перекладины, образованные тонковолокнистой костью, имеют неровные контуры, многие из них разветвлены и сильно истончены. Остеоциты, расположенные в костных полостях, имеют различную форму, многие из них удлиненной, овальной или угловатой формы. Ядра остеоцитов базофильны, хроматин плотный и на этом фоне ядрышки не определяются. Цитоплазма клеток также характеризуется базофильным оттенком. В то же время довольно часто встречаются остеоциты на стадии разрушения, ядра клеток подвергаются кариопикнозу, кариолизису или кариорексису. Большие участки костных перекладин лишены остеоцитов, встречаются участки костной ткани с оссеомукоидом, межклеточное вещество распределяется неравномерно по ходу хаотично распределенных костных пластинок в костных полостях. Часть остеоцитов располагается очень поверхностно в костных перекладинах. Однако среди обызвествленного межклеточного вещества встречаются небольшие участки костной ткани, подвергающиеся деструктивным процессам, при этом в центральной части таких участков межклеточное вещество слабо воспринимает красители, поэтому такие участки в виде светлых островков. Клеточные элементы, расположенные в таких зонах, округлой или овальной формы, они достигают довольно крупных размеров. Ядро таких клеток уплотнено, хроматин плотный, цитоплазма слабо воспринимает красители, однако цитоплазма клеток выявляется четко. Вокруг деструктивно измененных остеоцитов выстраиваются остеоциты с базофильной цитоплазмой. Ядра таких клеток также базофильны. В очаге деструкции происходят два противоположных процесса, в ответ на разрушение костной ткани одновременно идет процесс регенерации. В расширенных межбалочных пространствах начинают появляться фибробластические клетки (фиг.2).

Частичный регресс остеопоротических изменений в кости начинается с 12 дня наблюдения. Трансплантация эмбриональных клеток в костномозговой канал взрослых животных на фоне экспериментального стероидного остеопороза на 25 день обеспечивает восстановление костного дифферона: стволовых, полустволовых клеток, остеобластов и остеоцитов. Одновременно эти клетки вырабатывают межклеточное вещество. Все это способствует устранению патологического процесса костной ткани при остеопорозе.

Использование стволовых клеток у крыс с иммобилизационным остеопорозом обеспечивает ускорение ремоделирования костной ткани. Уже с 12 дня после введения в костномозговой канал гомогената эмбриональной ткани отмечено восстановление костного вещества, что подтверждено дальнейшими сроками наблюдения - 25 дней после процедуры.

Таким образом, трансплантация эмбриональных клеток (0,5 мл гомогената эмбриональной ткани) в костномозговой канал взрослых животных на фоне экспериментального стероидного остеопороза показала, что уже через 12 дней наблюдения начинается ремоделирование костной ткани, снижается интенсивность развития основного патологического процесса: уменьшается диаметр костномозгового канала, увеличивается толщина корковой пластинки, повышается объемная плотность костной ткани. На 25 день обеспечивается восстановление костного дифферона: стволовых, полустволовых клеток, остеобластов и остеоцитов. Одновременно эти клетки вырабатывают межклеточное вещество. Все это способствует устранению патологического процесса костной ткани при остеопорозе (фиг.3 и 4).

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается разработки лечения остеопороза. Для этого в костномозговой канал бедренной кости крысы однократно вводят 0,5 мл гомогената 10-дневного эмбриона крысы. Изобретение обеспечивает сокращение времени лечения за счет улучшения структуры костной ткани, ускорения ее ремоделирования, устранения в ней патологического процесса. 4 ил.

Способ лечения остеопороза в эксперименте путем однократного введения эмбриональной ткани, отличающийся тем, что в костномозговой канал бедренной кости крысы вводят 0,5 мл гомогената 10-дневного эмбриона крысы.