СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ НЕОНАТАЛЬНОГО СЕПСИСА У НОВОРОЖДЕННЫХ С СИНДРОМОМ ДЫХАТЕЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ И ГИПОКСИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных детей с респираторной патологией и перинатальным поражением центральной нервной системы (ЦНС), находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ).

В современной педиатрии актуальность проблемы сепсиса обусловлена неуклонным ростом числа этой категории больных и стабильно высокой летальностью, составляя от 2% до 50% (Matthew J., Bizzarro et al. Seventy-Five Years of Neonatal Sepsis at Yale: 1928-2003. Pediatrics. September 2005; 116:595-602).

Наиболее актуальной данная проблема является для отделений реанимации и интенсивной терапии, где находятся дети из группы высокого риска, определяемой основным заболеванием, материнским анамнезом, повышенной восприимчивостью к инфекциям.

Значимость наиболее раннего диагностирования неонатального сепсиса связана с возрастанием частоты его развития у новорожденных в критических состояниях, высокой летальностью и значительными материальными затратами на терапию.

Проведенный анализ литературы показал, что вопрос прогнозирования развития бактериальных осложнений у новорожденных детей с тяжелой респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС недостаточно освещен, в связи с этим разработки в данном направлении весьма актуальны.

В настоящее время известны следующие способы прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных.

Наиболее широко используется определение острофазного C-реактивного белка (СРБ). СРБ начинает синтезироваться в период 6-8 ч от начала инфекционного процесса или повреждения тканей. Как диагностический маркер у новорожденных СРБ более чувствительный и специфичный тест по сравнению с показателем лейкоцитов и степенью их незрелости. Однако уровень СРБ повышается очень медленно в начале септической инфекции, чувствительность теста в этот период едва достигает 60% (Ng Р.С., Cheng S.Н., Chui K. et al. // Arch. Dis. Childh. - 1997. - Vol.77. - P.221-227). Наиболее информативен тест в режиме мониторирования в течение 24 или 48 ч, в этом случае чувствительность его достигает 84%. СРБ достаточно чувствительный, но поздний маркер септической инфекции новорожденных.

Прототипом предлагаемого изобретения выбран один из перспективных маркеров сепсиса прокальцитонин, который избирательно реагирует на системные и септические инфекционные процессы и может служить ранним критерием для их диагностики (А.Г.Антонов, Е.Н.Байбарина, Ю.В.Соколовская, Н.В.Евтеева. Объективные диагностические критерии сепсиса у новорожденных. / Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2005, Т.4, №5-6, с.113-115).

Недостатками прототипа являются: 1. Концентрация прокальцитонина широко варьирует в первые дни жизни ребенка (Chiesa С., Panero A., Rossi N. et al. // Clin. Infect. Dis. - 1998. - Vol.26. - P.664-672). 2. Опубликованы работы, в которых приводятся очень высокие ложноположительные значения прокальцитонина у пациентов с респираторным дистресс-синдромом, острыми заболеваниями легких, гемодинамическими повреждениями, тяжелой травмой без бактериального инфицирования (Lapillone A., Basson Е., Monneret G. et al. // Lancet. - 1998. - Vol.351. - P.1211-1212). 3. Низкая специфичность (48%) (Turner D., Hammerman C, Rudenssky В., Schlesinger Y., Schimmel M.S. // Acta paediatr. 2006. Dec; 95(12):1571-6).

Задачей изобретения является разработка более совершенного, высокочувствительного метода раннего прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных детей.

Поставленная задача решается тем, что у новорожденных детей методом иммунофенотипирования на проточном цитометре определяют относительное содержание HLA-DR⁺ на моноцитах крови и осуществляют раннюю диагностику развития неонатального сепсиса при уровне 43,6% и ниже.

Прогнозирование развития неонатального сепсиса позволяет своевременно усилить терапию назначением более эффективных антибактериальных средств, проведением дезинтоксикационной и заместительной терапии препаратами гипериммунной плазмы и иммуноглобулинов.

HLA-DR - белок, принадлежащий к молекулам гистосовместимости II класса. Экспрессируется в основном на антиген-представляющих клетках (АПК) (моноциты, макрофаги, дендритные клетки, В-клетки).

Повышение экспрессии HLA-DR⁺ на лимфоцитах происходит при воспалительных процессах под действием цитокинов. В целом, повышение экспрессии этой молекулы можно ожидать при любых заболеваниях, связанных с воспалением. Однако наиболее информативной является оценка экспрессии HLA-DR⁺ на моноцитах (CD14⁺HLA-DR⁺).

Нашими исследованиями установлено, что моноциты новорожденных с септическими осложнениями в значительно меньшей степени экспрессируют HLA-DR⁺, чем моноциты новорожденных без таковых, и мониторинговое определение относительного содержания HLA-DR⁺ на моноцитах позволяет с высокой степенью вероятности диагностировать развитие неонатального сепсиса у новорожденных детей на доклинической стадии.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример №1.

Ребенок Ч-в, 3-х суток жизни, история болезни №105/5214. Тяжесть состояния ребенка на момент перевода из родильного дома в отделение реанимации была обусловлена дыхательной недостаточностью и перинатальным поражением ЦНС, без клинических признаков бактериальной инфекции (акро- и периоральный цианоз, дыхание с участием вспомогательной мускулатуры, втяжением межреберий, одышка свыше 80\мин, с ослаблением аускультативного дыхания в легких с обеих сторон; выражены симптомы угнетения ЦНС; печень, селезенка не увеличены, общий анализ крови без особенностей, прокальцитонин крови 0,5 нг/мл). Ребенок был переведен на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) и транспортирован в отделение реанимации.

При поступлении у новорожденного взяли 1,5 мл венозной крови, добавили 1 каплю гепарина. Для диагностики использовали моноклональные антитела фирмы Beckman Coulter (США). К 20 мкл моноклональных антител HLA-DR-РЕ и 20 мкл CD14 - FITC добавили 100 мкл гепаринизированной крови, перемешивали на шейкере (1000 об/мин) в течение 3 секунд и инкубировали при комнатной температуре 20 минут. Затем добавили 500 мкл лизирующего раствора Optilyse С фирмы Beckman Coulter и инкубировали до полного лизиса эритроцитов. Далее дважды отмывали в 1 мл РВС (фосфатно-солевой буфер) фирмы Биолот при 1500 об/мин по 3 минуты. К осадку добавляли 1 мл РВС и ресуспендировали. Анализировали образец на проточном цитометре фирмы Beckman Coulter Epics XL.

В результате проведенного исследования были получены следующие результаты относительного содержания HLA-DR⁺ рецепторов на моноцитах: HLA-DR⁺ на моноцитах при поступлении - 43,6%.

Обнаружение цифр относительного содержания HLA-DR⁺ на моноцитах 43,6% у новорожденного свидетельствовало о высоком риске развития неонатального сепсиса. На 4-е сутки терапии у ребенка отмечено повышение температуры тела до 39°С, тахиаритмия свыше 160 мин^-1, в легких с обеих сторон выслушивались крепитирующие хрипы, наблюдалось увеличение размеров печени и селезенки, в общем анализе крови - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом до юных, прокальцитонин крови - 10 нг/мл. Бактериологический посев крови - обнаружен рост Ps. aeruginosa. Пациенту поставлен клинический диагноз неонатального сепсиса. Благодаря своевременному усилению интенсивной и антибактериальной терапии, назначению иммуностимулирующих препаратов пациенту удалось сохранить жизнь. На фоне проводимой интенсивной терапии на 10-е сутки при повторном исследовании относительное содержание HLA-DR⁺ на моноцитах повысилось до 60,5%. На 16-е сутки ребенок был экстубирован и на 20-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения. На момент перевода уровень относительного содержания HLA-DR⁺ на моноцитах составил 80%.

Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение уровня экспрессии HLA-DR⁺ на моноцитах 43,6% свидетельствовало о развитии у пациента неонатального сепсиса в наиболее раннем сроке, до появления клинических и лабораторных признаков тяжелой бактериальной инфекции.

Пример №2.

Ребенок Б-ов, первых суток жизни, история №7261/131. Поступил из родильного дома в отделение реанимации на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности и неврологической симптоматики в возрасте 4 часов жизни. При поступлении реакция на осмотр снижена; отмечалась выраженная бледность кожного покрова, артериальная гипотония, тахиаритмия свыше 160 мин^-1; в легких выслушивались крепитирующие хрипы с обеих сторон, печень +2, селезенка у края реберной дуги, в общем анализе крови анемия, тенденция к нейтропении, прокальцитонин крови 2 нг/мл. Уровень экспрессии HLA-DR⁺ на моноцитах составлял 43,7%, что несмотря на тяжелое состояние позволяло исключить развитие неонатального сепсиса. В реанимационном отделении ребенок получал респираторную терапию, антибактериальную терапию и интенсивную терапию в соответствии с клиническим диагнозом: асфиксия в родах, двухсторонняя пневмония. На 8-е сутки состояние ребенка стабилизировалось. В последующем ребенок был экстубирован и переведен для дальнейшего лечения в отделение для новорожденных.

Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение уровня экспрессии HLA-DR⁺ на моноцитах выше 43,6% свидетельствовало об отсутствии у пациента неонатального сепсиса, что и подтвердилось в последующем.

Пример №3.

Ребенок К-в, 3-х суток жизни, история болезни №211/4214. Тяжесть состояния ребенка на момент перевода из родильного дома в отделение реанимации была обусловлена дыхательной недостаточностью и перинатальным поражением ЦНС, без клинических признаков бактериальной инфекции (акро- и периоральный цианоз, дыхание с участием вспомогательной мускулатуры, втяжением межреберий, одышка свыше 80/мин, с ослаблением аускультативного дыхания в легких с обеих сторон; выражены симптомы угнетения ЦНС; печень, селезенка не увеличены, общий анализ крови без особенностей, прокальцитонин крови 0,4 нг/мл). Ребенок был переведен на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) и транспортирован в отделение реанимации.

В результате проведенного исследования были получены следующие результаты относительного содержания HLA-DR⁺ рецепторов на моноцитах: HLA-DR⁺ на моноцитах при поступлении - 43,5%.

Обнаружение цифр относительного содержания HLA-DR⁺ на моноцитах 43,5% у новорожденного свидетельствовало о высоком риске развития неонатального сепсиса. На 4-е сутки терапии у ребенка отмечено повышение температуры тела до 39,3°С, тахиаритмия свыше 160 мин^-1, в легких с обеих сторон выслушивались крепитирующие хрипы, наблюдалось увеличение размеров печени и селезенки, в общем анализе крови - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом до юных, прокальцитонин крови - 12 нг/мл. Бактериологический посев крови - обнаружен рост Ps. aeruginosa. Пациенту поставлен клинический диагноз неонатального сепсиса. Благодаря своевременному усилению интенсивной и антибактериальной терапии, назначению иммуностимулирующих препаратов пациенту удалось сохранить жизнь. На фоне проводимой интенсивной терапии на 11-е сутки при повторном исследовании относительное содержание HLA-DR⁺ на моноцитах повысилось до 57,5%. На 16-е сутки ребенок был экстубирован и на 20-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения. На момент перевода уровень относительного содержания HLA-DR⁺ на моноцитах составил 85%.

Предлагаемым способом было обследовано 96 новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и перинатальным поражением ЦНС, находящихся на ИВЛ, получавших терапию в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. У 28 детей уровень экспрессии HLA-DR⁺ на моноцитах был ниже 43,6%. У этих пациентов в последующем был диагностирован неонатальный сепсис, подтвержденный клинико-лабораторным и бактериологическим обследованием. Благодаря ранней диагностике развития этого заболевания и своевременного усиления проводимой антибактериальной и интенсивной терапии лишь у 2-х пациентов зарегистрирован летальный исход. При паталогоанатомическом исследовании у всех погибших детей имел место неонатальный сепсис.

У 68 детей уровень экспрессии HLA-DR⁺ на моноцитах был выше 43,6%. Течение основного заболевания у этих пациентов развитием неонатального сепсиса не осложнилось.

Таким образом, исследование относительного содержания HLA-DR⁺ на моноцитах крови у новорожденных с респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС, находящихся на ИВЛ, позволяет говорить о том, что чувствительность заявляемого способа составляет 85,7%, а специфичность - 82%.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных, по сравнению с существующими методами, имеет следующие преимущества:

1. Способ прогнозирует развитие неонатального сепсиса в наиболее ранние сроки, до развития тяжелого симптомокомплекса и полиорганной недостаточности, позволяя своевременно усилить проводимую антибактериальную и интенсивную терапию.

2. Способ относится к экспресс-диагностике (время выполнения 2 часа).

3. Предлагаемый способ является высокотехнологичной методикой, обладает высокой точностью и специфичностью и найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических стационарах.

Предлагаемый способ прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных с дыхательными расстройствами и перинатальным поражением ЦНС может использоваться в неонатологии, педиатрии и реаниматологии, дополняя известные методы лабораторной диагностики, позволяя своевременно и обоснованно назначать патогенетическую терапию, способствуя повышению выживаемости новорожденных и сокращая продолжительность терапии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии. Предложен способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных детей с респираторной патологией и перинатальным поражением центральной нервной системы. У новорожденных детей в пробе венозной крови иммуноцитофлуориметрическим методом определяют относительное содержание HLA-DR⁺ на моноцитах, и при его значении, равном 43,6% и менее, диагностируют септические осложнения. Способ обладает высокой чувствительностью (85,7%) и специфичностью (82%) и позволет своевременно усилить проводимую интенсивную терапию с решением вопроса о возможности проведения иммуностимулирующей терапии.

Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных путем исследования крови, отличающийся тем, что в пробе венозной крови методом иммунофенотипирования на проточном цитометре определяют относительное содержание HLA-DR⁺ на моноцитах, и при его значении, равном 43,6% и менее, диагностируют септические осложнения.