СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/533 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в педиатрии, детской хирургии, реаниматологии, в диагностике гнойно-септических заболеваний у детей.

Ранняя диагностика неонатального сепсиса, как наиболее тяжелого проявления гнойно-септического процесса, и его адекватная терапия является одной из актуальных проблем в отделениях реанимации и интенсивной терапии (Самсыгина Г.А., 2004; Антонов А.Г., 2005; Haque K.N., 2005). Важно уловить ранние симптомы развития сепсиса, чтобы своевременной коррекцией назначений предотвратить манифестацию, так как известно, что сепсис лучше поддается лечению именно на ранних стадиях (Исаков Ю.Ф., Белобородова Н.В., 2001). В силу общей тяжести состояния нередко уже при поступлении на этап отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) новорожденные имеют инфекционный процесс, хотя последний регистрируется лишь на лабораторном уровне и не проявляется клинически в виде формирования гнойно-воспалительных очагов (Исаков Ю.Ф., Белобородова Н.В., 2001). Следовательно, в отсутствии выраженной клинической картины и гнойно-воспалительного очага, ранняя диагностика инфекционного процесса затруднена, а также возможно «смазывание» клинической картины на фоне ранее принимаемых антибактериальных средств. В связи с этим большая часть диагностики возлагается на лабораторные критерии. Последние исследования показали, что количество экспрессированных молекул CD64 нейтрофилов позволяет улучшить диагностику инфекций/сепсиса по сравнению со стандартными диагностическими тестами, применяемыми в современной медицине (Davis ВН, Olsen SH, Ahmad E, Bigelow NC, 2006; JJ. Hoffmann, 2009).

Аналог: Использование современных достижений в области флуоресцентных красителей, развитие лазерных и компьютерных технологий привели к широкому использованию данной технологии в медицинской практике. Не является исключением и инфекционная иммунология. Использование анализа продукции цитокинов при туберкулезе и изменение экспрессии HLA-DR на моноцитах и CD64(+) на гранулоцитах при сепсисе являются важными диагностическими признаками. Проточная цитофлюориметрия предлагает новые подходы к ранней и более быстрой диагностике нарушений иммунной системы при туберкулезе и сепсисе, позволяет более эффективно контролировать развитие этих патологий и оценить эффективность терапии (С.В.Хайдуков, А.В.Зурочка «Возможности проточной цитофлуорометрии в диагностике инфекционных заболеваний.» Инфекция и иммунитет 2011, T.1, с.59-66). Таким образом появление в периферической крови у взрослых костномозгового пула нейтрофилов, несущих CD64(+), является диагностическим маркером сепсиса.

Недостатками метода являются: исследование только одного вида маркеров поверхностной цитоплазматической мембраны гранулоцитов - CD64 и проведение исследований только на взрослых пациентах.

Ближайший аналог: Авторы (Vineet Bhandari et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics. January 2008: 121(1):129-134) пришли к выводу, что индекс CD64(+), оцениваемый методом проточной цитофлуорометрии, - очень чувствительный маркер неонатального сепсиса. То есть появление в периферической крови у новорожденных повышенной концентрации нейтрофилов костномозгового пула, несущих CD64(+), является диагностическим маркером неонатального сепсиса. Но авторы считают, что индекс CD64(+) должен использоваться в комплексе со всеми другими известными клиническими и лабораторными критериями диагностики неонатального сепсиса.

Недостатками способа являются: исследование только одного вида маркеров поверхностной цитоплазматической мембраны гранулоцитов - CD64, а также необходимость использования индекса в комплексе с другими критериями, так как чувствительность бактериологических методов, в частности посев крови, достигает 40-60%, а показатели гемограммы новорожденных, и особенно недоношенных детей, часто остаются в пределах возрастной нормы, проявляя ареактивность иммунной системы.

Задачи: ранняя (первые трое суток от момента госпитализации) диагностика гнойно-септических заболеваний у детей.

Сущность изобретения: определяют одномоментную экспрессию рецепторов CD64(+) CD32(+) CD11b(+) в периферической крови у новорожденных методом проточной цитофлуорометрии. За норму принимают значение 1,63+0,68%, и при условии увеличения значения экспрессии CD64(+) CD32(+) CD11b(+) не менее чем в 5 раз относительно нормы, выявляют наличие гнойно-септического заболевания у ребенка.

Технический результат: ранний метод диагностики гнойно-септических заболеваний у детей.

Под наблюдением находилось 16 младенцев обоего пола (8 мальчиков, 8 девочек), поступивших в отделение реанимации и интенсивной терапии на 1-15 сутки жизни. На основании клинических симптомов и результатов лабораторного исследования пациенты были рандомизированы на 2 группы.

В 1-ю группу (8 детей) вошли новорожденные с системным воспалительным процессом инфекционного генеза (сепсисом), во 2-ю группу (8 детей) - новорожденные с локальным воспалительным процессом инфекционного генеза (пневмонией), 3-я - группа контрольная. В нее были включены 22 новорожденных (10 девочек, 12 мальчиков, в возрасте 3-6 суток, массой 2880-4370 г, гестационный возраст составил 38-41 неделя). В результате исследования контрольной группы, опытным путем, были определены значения возрастной нормы экспрессии CD64(+) CD32(+) CD11b(+) на нейтрофильных гранулоцитах - 1,63±0,68%.

Способ осуществляют следующим образом. Производят забор крови из периферической венозной сети (подкожные вены тыла кисти). Исследуют маркеры поверхностной цитоплазматической мембраны нейтрофильных гранулоцитов (НГ). Тестируют одномоментную экспрессию на мембране НГ молекул CD64(+) CD32(+) CD11b(+) методом проточной цитофлуорометрии на CYTOMICS FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием панели моноклональных антител: CD64(+) - FITC, CD32(+) - РЕ, CD11b(+) - РС5 (фирма Beckman Coulter, США). Оценивают процент НГ (%НГ) одномоментно экспрессирующих CD64(+) CD32(+) CD11b(+). Использование многоцветного цитофлуорометрического исследования позволило одномоментно получить информацию о нескольких антигенах на поверхности клеток. Первое исследование проводят при поступлении в отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), второе - на 7-е-14-е сутки госпитализации при переводе ребенка для дальнейшего лечения в отделение патологии новорожденных. Статистическая обработка полученных данных производилась с использованием программы для IBM PC "BIOSTAT" (Stenton A. Glantz, Ph.D., 1999). Статистически значимыми признавались различия с р<0,05.

Таблица 1. Сопоставительный анализ результатов использования предлагаемого способа Исследуемые маркеры поверхностной цитоплазмати
ческой мембраны нейтрофильных гранулоцитов Контрольная группа Группа с локальными (пневмония) гнойно-септическими заболеваниями - 1-е исследование Группа с локальными (пневмония) гнойно-септическими заболеваниями - 2-е исследование Группа с системными (сепсис) гнойно-септическими заболеваниями - 1-е исследование Группа с системными (сепсис) гнойно-септическими заболеваниями - 2-е исследование CD64(+)           CD32(+) 1,63±0,68% 21,07±0,88% 13,53±0,43% 54,53±0,44 25,78±0,75 CD11b(+)          

Данная таблица дает представление об уровне повышения исследуемых маркеров при гнойно-септических как локальных (пневмония), так и системных (сепсис) заболеваниях у новорожденных детей, а также демонстрирует значимое снижение уровня CD64(+) CD32(+) CD11b(+) на фоне лечения (рациональной антибактериальной и иммунокоррегирующей терапии).

Примеры:

1. Ребенок М. (мальчик), 10 суток, находился в ОРИТ с диагнозом:

Поздний неонатальный сепсис: Врожденная пневмония, тяжелое течение. Синдром системного воспалительного ответа. Врожденный порок развития (ВПР): Атрезия пищевода, трахеопищеводный свищ. Состояние после торакотомии справа, разобщения трахеопищеводного свища, восстановления проходимости пищевода (от 15.11.10.). Перфорация пищевода. Состояние после лапаротомии, гастростомии по Кадеру (от 26.11.10.). Врожденный порок сердца (ВПС): Коарктация аорты, ювенильный тип. Дуктус-зависимая системная циркуляция. Открытый артериальный проток (медикаментозно-поддерживаемая функция). Состояние после реторакотомии справа, пневмолиза, ушивания ран легкого, дренирования правой плевральной полости. Резекции коарктации аорты с расширенным анастомозом конец-в-конец (от 23.11.10.). Локальный пневмоторакс справа, состояние после дренирования (от 23.11.10.). Атриовентрикулярная коммуникация, неполная форма. Недостаточность трикуспидального клапана 2 степени, недостаточность митрального клапана 1 степени. Дефект межпредсердной перегородки первичный большой. Церебральная ишемия 2 степени, синдром церебральной депрессии. Недоношенность 32 недели. Синдром полиорганной недостаточности (СПОН). ДВС синдром, коагулопатия потребления. Первое исследование проведено на 11-е сутки жизни и 2-е сутки госпитализации. Клинически: 1) респираторные нарушения в виде дыхательной недостаточности (ДН) 3 степени (искусственная вентиляция легких (ИВЛ) в режиме высокочастотной осцилляторной искусственной вентиляции легких (ВЧО ИВЛ)), показатели пульсоксиметрии 89-95% (FiO₂ 70%) 2) гемодинамика поддерживается введением кардиотоников и вазопрессоров 3) кожные покровы бледно-серые, мраморные, конечности прохладные, склонность к гипотермии 36,4 по Цельсию (выхаживается в инкубаторе) 4) со стороны ЖКТ - не кормится, из желудка отделяемое с гематином 5) уровень глюкозы крови устойчивый, метаболический ацидоз 6) в неврологическом статусе гипотония, гипорефлексия, гиподинамия. По лабораторным показателям: уровень лейкоцитов 39,9 Г/л, из них гранулоцитов 31,4%, уровень С-РБ 36 мг/л, уровень прокальцитонина >2 нг/мл. Уровень CD64(+) CD32(+) CD11b(+) составил 94,2%, что более чем в 57 раз выше показателей у детей контрольной группы (1,63±0,68%). Ребенок получал комбинированную антибактериальную терапию, иммунокоррегирующую терапию. Повторное исследование произведено на 16-е сутки жизни и 6-е сутки госпитализации. Клинически: 1) респираторные нарушения в виде ДН 3 степени (ИВЛ в режиме ВЧО ИВЛ), показатели пульсоксиметрии 80-88% (FiO₂ 100%) 2) гемодинамика поддерживается введением кардиотоников и вазопрессоров 3) кожные покровы бледно-серые, мраморные, цианотичный оттенок, конечности прохладные, склонность к гипотермии 36,0 по Цельсию (выхаживается в инкубаторе) 4) со стороны ЖКТ - кормления не усваивает 5) уровень глюкозы крови устойчивый, выраженный декомпенсированный метаболический ацидоз 6) в неврологическом статусе атония, арефлексия. По лабораторным показателям: уровень лейкоцитов 12,5 г/л, из них гранулоцитов 29,9%, уровень ЦРБ 6 мг/л. Уровень CD64(+) CD32(+) CD11b(+) составил 30,57%, что более чем в 18 раз выше показателей у детей контрольной группы (1,63±0,68%), что свидетельствовало об уменьшении выраженности септического процесса. Несмотря на регрессию септического процесса ребенок умер на 6-е сутки на фоне декомпенсации ВПС.

2. Ребенок М. (мальчик), 11 суток, находился в ОРИТ с диагнозом: Ранний неонатальный сепсис: врожденная пневмония, синдром системного воспалительного ответа. Вазоспазм артерий кистей. Некроз дистальных фаланг 2 и 5 пальцев левой кисти. Церебральная ишемия 2 степени, синдром церебральной депрессии. Недоношенность 29 недель. Первое исследование проведено на 13-е сутки жизни и 12-е сутки госпитализации. Клинически: 1) респираторные нарушения в виде ДН 3 степени (ИВЛ в режиме PSV), показатели пульсоксиметрии 90-98% (FiO₂ 40%) 2) гемодинамика стабильна 3) кожные покровы бледно-розовые, акроцианоз, серый колорит, конечности прохладные, нормотермия 36,8 по Цельсию (выхаживается в инкубаторе) 4) со стороны ЖКТ - кормится в орогастральный зонд (ОГЗ), усваивает частично 5) уровень глюкозы крови устойчивый, компенсированный метаболический ацидоз 6) в неврологическом статусе гипотония, гипорефлексия, гиподинамия. По лабораторным показателям: уровень лейкоцитов 4,3 Г/л, из них гранулоцитов 50,1%, уровень С-РБ 5 мг/л, уровень прокальцитонина <0,5 нг/мл. Уровень CD64(+) CD32(+) CD11b(+) составил 23,7%, что более чем в 14,5 раз выше нормы (1,63±0,68%). Ребенок получал комбинированную антибактериальную терапию, иммунокоррегирующую терапию. Повторное исследование произведено на 25-е сутки жизни и 24-е сутки госпитализации. Клинически: 1) респираторных нарушений нет, показатели пульсоксиметрии 90-93% (FiO₂ 21%) 2) гемодинамика стабильна 3) кожные покровы бледно-розовые, акроцианоз 4) со стороны ЖКТ - кормления усваивает 5) уровень глюкозы крови устойчивый, по КЩС и газам крови компенсирован 6) в неврологическом статусе гипотония, гипорефлексия. По лабораторным показателям: уровень лейкоцитов 6,2 г/л, из них гранулоцитов 25,4%, уровень ЦРБ 5 мг/л. Не смотря на нормализацию вышеописанных показателей уровень CD64(+) CD32(+) CD11b(+) составил 42,8%, что более чем в 26 раз выше нормы (1,63±0,68%), что в дальнейшем коррелировало с волнообразностью течения септического процесса. Ребенок выписан домой на 52-е сутки жизни и 51-е сутки госпитализации.

3. Ребенок Г. (девочка), 2 суток, находился в ОРИТ с диагнозом: Врожденная пневмония, тяжелое течение. Церебральная ишемия 2 степени, синдром вегето-висцеральных дисфункций. Конъюгационная желтуха. Функционирующее овальное окно. Гиперплазия тимуса. ВПР: правосторонняя врожденная косолапость. Недоношенность 36 недель. Первое исследование проведено на 4-е сутки жизни и 2-е сутки госпитализации. Клинически: 1) респираторные нарушения в виде ДН 3 степени (ИВЛ в режиме PSV), показатели пульсоксиметрии 93-98% (FiO₂ 30%) 2) гемодинамика стабильна 3) кожные покровы бледно-розовые, акроцианоз, субиктеричность, нормотермия 36,9 по Цельсию (выхаживается в инкубаторе) 4) со стороны ЖКТ - кормится в ОГЗ, усваивает 5) уровень глюкозы крови устойчивый, по КЩС и газам крови компенсирован 6) в неврологическом статусе гипотония, гипорефлексия, гиподинамия. По лабораторным показателям: уровень лейкоцитов 17,0 г/л, из них гранулоцитов 77,8%, уровень С-РБ 10 мг/л. Уровень CD64(+) CD32(+) CD11b(+) составил 41,2%, что более чем в 25,2 раз выше нормы (1,63±0,68%). Ребенок получал комбинированную антибактериальную терапию, иммунокоррегирующую терапию. Повторное исследование произведено на 25-е сутки жизни и 21-е сутки госпитализации. Клинически: 1) респираторных нарушений нет, показатели пульсоксиметрии 94-98% (FiO₂ 21%) 2) гемодинамика стабильна 3) кожные покровы бледно-розовые, акроцианоз 4) со стороны ЖКТ - кормления усваивает, кормится молочной смесью через орогастральный зонд. 5) уровень глюкозы крови устойчивый, по КЩС и газам крови компенсирован 6) в неврологическом статусе уровень церебральной активности достаточный. По лабораторным показателям: уровень лейкоцитов 9,9 Г/л, из них гранулоцитов 20,9%, уровень ЦРБ 5 мг/л. Уровень CD64(+) CD32(+) CD11b(+) составил 20,43%, что более чем в 12,5 раз выше нормы (1,63±0,68%), что коррелировало с тяжестью состояния ребенка, улучшением показателей витальных функций и лабораторных показателей. На фоне терапии отмечалось постепенное улучшение состояния, регрессирование септического процесса. Ребенок выписан домой на 25 сутки жизни и 21 сутки госпитализации.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики гнойно-септических заболеваний у новорожденных детей. Для этого определяют одномоментную экспрессию рецепторов CD64(+) CD32(+) CD11b(+) в периферической крови у новорожденных. За норму принимают значение 1,63±0,68%, а при условии увеличения значения экспрессии CD64(+) CD32(+) CD11b(+) не менее чем в 5 раз относительно нормы, выявляют наличие гнойно-септического заболевания у ребенка. Использование данного способа позволяет проводить диагностику гнойно-септических заболеваний у детей на раннем этапе заболевания. 1 табл., 3 пр.

Способ диагностики гнойно-септических заболеваний у новорожденных детей, включающий исследование в периферической крови нейтрофильных гранулоцитов методом проточной цитофлуорометрии, отличающийся тем, что определяют одномоментную экспрессию рецепторов CD64(+) CD32(+) CD11b(+), за норму принимают значение 1,63±0,68%, и при условии увеличения значения не менее, чем в 5 раз относительно нормы, выявляют наличие гнойно-септического заболевания у ребенка.