Способ прогнозирования развития неонатального сепсиса, основанный на определении CD10 на мембране нейтрофилов Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/49 G01N33/577 

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования развития неонатального сепсиса.

Сепсис является угрожающей жизни органной дисфункцией, вызванной дисрегуляцией иммунного ответа на инфекцию. При несвоевременном выявлении сепсис развивается в септический шок и полиорганную недостаточность, которые приводят к гибели новорожденного. Ежегодно в мире выявляют до 3 млн. новых случаев развития неонатального сепсиса, общая летальность при сепсисе среди новорожденных составляет до 30%.

Прогнозирование развития септического процесса у новорожденных часто осложнено ввиду неспецифического характера выявляемых симптомов, отсутствия универсальных диагностических маркеров и высокого процента ложноотрицательных результатов при обследовании новорожденных, а также влияния временного фактора от момента взятия пробы крови до получения результатов анализа гемокультуры. В связи с этим особенно актуальной становится необходимость поиска новых ранних биомаркеров неонатального сепсиса.

Определение у новорожденного риска развития сепсиса крайне важно для принятия максимально быстрых и эффективных терапевтических мер.

Основными методами исследования при выявлении неонатального сепсиса являются микробиологические (посев крови на стерильность), лабораторные (клинический анализ крови с определением ряда гематологических показателей - количество лейкоцитов, нейтрофилов периферической крови, подсчет нейтрофильного индекса, а также определение белков острой фазы воспаления - СРБ, ПКТ, пресепсин) и инструментальные (рентгенологическое исследование органов грудной полости). Но эти методы не всегда информативны при прогнозировании развития данного заболевания.

Известен способ прогнозирования развития неонатального сепсиса путем определения в периферической крови у новорожденных повышенной экспрессии на мембране нейтрофильных гранулоцитов (НГ) молекул CD64 методом проточной цитометрии (Bhandari V, Wang С, Rinder С, Rinder Н. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics. 2008; 121(1):129-134. doi: 10.1542/peds.2007-1308. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18166566/).

Известен также способ диагностики гнойно-септических заболеваний у новорожденных (неонатального сепсиса), при котором в периферической крови определяют одномоментную экспрессию на мембране НГ молекул CD64, CD32 и CD11b. За норму принимают значение 1,63±0,68%, а при условии увеличения значения экспрессии молекул CD64, CD32 и CD11b не менее чем в 5 раз относительно нормы выявляют наличие гнойно-септического заболевания у ребенка. (Патент РФ №2484479, МПК G01N 33/533, опубл. 10.06.2013 г., Бюл. 16). Недостатком данного способа является низкая чувствительность и специфичность вследствие нескольких причин, а именно:

1) Экспрессия на мембране НГ молекул CD64 не является удовлетворительным маркером для прогнозирования или диагностики неонатального сепсиса из-за относительно низкой чувствительности и специфичности (Shi J, Tang J, Chen D. Meta-analysis of diagnostic accuracy of neutrophil CD64 for neonatal sepsis. Ital J Pediatr. 2016; 42(1):57. Published 2016 Jun 7. doi:10.1186/s13052-016-0268-1 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27268050V Поэтому к экспрессии на мембране НГ молекул CD64, используемой при прогнозировании неонатального сепсиса, следует относиться с осторожностью.

2) CD32 также не является надежным биомаркером сепсиса, поскольку его уровень при инфекционно-септических осложнениях меняется непредсказуемо. Так, согласно Hsu КН, Chan МС, Wang JM, Lin LY, Wu CL. Comparison of Fey receptor expression on neutrophils with procalcitonin for the diagnosis of sepsis in critically ill patients. Respirology. 2011; 16(1): 152-160. doi:10.1111/j.l440-1843.2010.01876.x, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20946336A он оставался неизменным у пациентов с синдромом системного воспалительного ответа, тяжелым сепсисом и септическим шоком.

3) Использование двух ненадежных биомаркеров CD64 и CD32 одновременно с CD11b снижает его диагностическую точность, хотя сама по себе эта молекула обладает определенной прогностической ценностью по данным некоторых авторов (Qiu X, Li J, Yang X, et al. Is neutrophil CD1 lb a special marker for the early diagnosis of sepsis in neonates? A systematic review and meta-analysis. BMJ Open. 2019; 9(4):e025222. Published 2019 May 1. doi:10.1136/bmjopen-2018-025222. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31048432/),

К недостаткам данного способа относится также необходимость одновременного определения трех поверхностных молекул на мембране НГ, что делает выполнение способа более дорогостоящим. Кроме того, оценка трех биомаркеров требует использования как минимум трех каналов детекции проточного цитометра, что затрудняет одновременную оценку других аналитов.

Задачей изобретения является разработка более чувствительного и специфичного способа прогнозирования развития неонатального сепсиса, основанного на определении CD 10 на мембране нейтрофилов, с низкой себестоимостью, простого в исполнении и с отсутствием необходимости задействования нескольких каналов детекции при анализе методом проточной цитометрии, позволяющего на доклинической стадии определить риск развития заболевания для своевременного назначения эффективной терапии.

Технический результат заключается в повышении чувствительности и специфичности способа.

Технический результат достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования развития неонатального сепсиса, согласно изобретению, определяют экспрессию CD10 на зрелых нейтрофилах периферической крови методом проточной цитометрии и при значении экспрессии CD10 ниже 6,29 тыс. ед. фл. прогнозируют развитие неонатального сепсиса.

Повышение чувствительности и специфичности достигается за счет использования CD 10 (неприлизин) в качестве показателя зрелых нейтрофилов, содержание которых снижается при сепсисе. Биомаркер оценивается методом проточной цитометрии с задействованием только одного канала детекции. Оценка одного биомаркера предусматривает окрашивание только одним типом конъюгированных моноклональных антител вместо трех, что сокращает себестоимость исполнения способа почти в три раза.

Осуществление способа.

У новорожденного при поступлении в отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) производят забор крови из центральной или периферической вены. Определяют методом проточной цитометрии экспрессию на мембране нейтрофильных гранулоцитов молекул CD 10. Развитие неонатального сепсиса прогнозируют при падении экспрессии молекул CD 10 до значений ниже, чем 105% от медианы показателя в совокупности здоровых индивидов.

Для оценки прогностической ценности биомаркера сепсиса CD10, были обследованы 287 новорожденных в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), среди которых 96 условно здоровых, 95 с инфекционным очагом и 70 с течением сепсиса. Пациенты с полиорганной недостаточностью неинфекционной природы были исключены из исследования.

Проанализированы показатели, полученные в 1-й день после поступления. Оценивали экспрессию CD10 (на всех нейтрофилах) методом проточной цитометрии. Статистическая обработка результатов выполнена в пакете IBM SPSS 21 (IBM, США).

Экспрессия CD10 нейтрофилами у новорожденных в контрольной группе составила 3,56 - 10,3 тыс. ед. фл. (медиана 5,98 тыс. ед. фл.), у пациентов с инфекционным очагом - 5,27 - 15,0 тыс. ед. фл. (медиана 8,30 тыс. ед. фл.), а у детей с течением сепсиса - 1,69 - 8,43 тыс. ед. фл. (медиана 3,79 тыс. ед. фл.), р<0,05.

Проанализировали показатели, связанные с неблагоприятными исходами вследствие генерализации инфекции у пациентов в ОРИТ (всего 19 случаев). К неблагоприятным исходам относили гибель и перевод пациента в паллиативное отделение. Выявлено достоверное снижение CD10 в случаях с неблагоприятными исходами: у выздоровевших детей уровень CD10 находился в диапазоне 3,05 - 10,4 тыс. ед. фл. по сравнению с 1,13-3,56 тыс. ед. фл. (р<0,05). При помощи ROC анализа построены точки отсечения, падение уровня показателей ниже которых свидетельствует о вероятности неблагоприятного исхода. Точка отсечения для CD10 составила 3,63 тыс. ед. фл., площадь под ROC кривой (AUC) - 0,823 (95% доверительный интервал 0,470-1,175), чувствительность 0,645 (0,513-0,763), специфичность 1,000 (1,000-1,000).

Для дальнейшего ROC анализа вся совокупность обследованных больных была разделена на две группы: с течением сепсиса и без него. С помощью этой группировки вычислены точки отсечения для CD10, определяющие вероятность течения сепсиса у пациента. Значения показателей в точках отсечения составили для CD10 - 6,29 тыс. ед. фл., AUC 0,703 (0,609-0,797), чувствительность 0,629 (0,520-0,729), специфичность 0,740 (0,597-0,854).

На следующем этапе анализа всю совокупность обследованных новорожденных разделили на группы с нормальными или пониженными значениями показателей в соответствии с найденными точками отсечения. При помощи анализа Каплана-Майера сопоставили медианы сроков пребывания в ОРИТ и в стационаре в зависимости от значений показателей CD10. Снижение CD10 связано с удлинением пребывания в ОРИТ с 4 (3-5) до 8 (6-10) койко-дней (р<0,001) и в стационаре с 14 (12-16) до 19 (16-22) койко-дней (р<0,001).

Способ помогает определить риск развития сепсиса на доклинической стадии. Выявление неблагоприятного прогноза с точки зрения развития сепсиса позволяет заблаговременно усилить терапию инфекции назначением более агрессивной антибиотикотерапии. Таким образом сокращается количество тяжелых форм сепсиса и улучшается состояние здоровья и качество жизни детей.

Пример 1 (неблагоприятный)

Доношенный ребенок Ж.-Г., поступил в ОРИТ новорожденных 05.02.2023 в возрасте 4 часов жизни в крайне тяжелом состоянии, обусловленном дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточностью, неврологической симптоматикой вследствие перенесенной тяжелой асфиксии при рождении, проведении реанимационных мероприятий, запредельного лактат-ацидоза, нарушений углеводного обмена (гипергликемии), водно-электролитных нарушений, с подозрением на врожденную пневмонию. На аппаратной ИВЛ с достаточно жесткими параметрами. При поступлении уровень CD10 нейтрофилов 0,92 тыс. ед. фл., что составляет 15,4% от медианы показателя в совокупности здоровых индивидов. Данное значение свидетельствует в пользу развития сепсиса. У ребенка наблюдается нестабильность гемодинамики, развитие шока - потребовалась массивная КТП (допамин, добутамин, норадреналин, адреналин), гормональная терапия (дексаметазон). В неврологическом статусе выраженный синдром угнетения, атония. В возрасте 5 часов жизни проведена терапевтическая гипотермия (72 ч) с 05.02.2023 по 08.02.2023 для предупреждения вторичного поражения головного мозга. На фоне последующего согревания ребенка отмечалось нарастание геморрагического синдрома, производилась трансфузия СЗП, снижение доз кардиотонических и вазопрессорных препаратов. С момента поступления ребенка на ИВЛ спонтанной дыхательной активности нет. У ребенка длительно сохранялись выраженные метаболические нарушения, лактатемия, нарушение гликемического профиля. На 2 сутки жизни отмечается развитие острого почечного повреждения с олигурией, выраженным отечным синдромом. В неврологическом статусе атоническая кома. Противомикробную терапию получал с момента поступления с учетом маркеров воспаления и данных бактериологического исследования (гемокультура К. pneumoniae; высевы Е. faecalis, Е. faecium). Прогноз для жизни и восстановления неблагоприятный; для дальнейшего лечения ребенок переведен в отделение оказания паллиативной помощи.

Пример 2 (благоприятный)

Доношенная девочка Д., поступила в ОРИТ новорожденных бригадой скорой медицинской помощи на самостоятельном дыхании. Уровень CD10 нейтрофилов при поступлении 12,5 тыс. ед. фл., что составляет 209% от медианы показателя в совокупности здоровых индивидов. Данное значение свидетельствует против развития сепсиса, что дает основание на положительный прогноз. Состояние ребенка при рождении тяжелое за счет наличия дыхательных нарушений в виде втяжения уступчивых мест грудной клетки, стонущего дыхания, синдрома угнетения в виде снижения мышечного тонуса и уровня церебральной активности. Проводится респираторная поддержка СРАР, назначена антибактериальная, инфузионная терапия. Оксигенируется удовлетворительно, устойчиво. По КОС и газам крови в динамике компенсирована. На фоне проводимой терапии состояние ребенка с положительной динамикой. Рентгенологически аспирационная пневмония разрешилась. В анализах мочи и крови без воспалительных изменений. Курс антибактериальной терапии завершен на 10-е сутки жизни. В неврологическом статусе синдром угнетения ЦНС с уменьшением, девочка стала активнее. Ребенок в удовлетворительном состоянии выписан под наблюдение педиатра по м/ж.

Пример 3 (неблагоприятный)

Девочка А.-Г. поступила в ОРИТ новорожденных в первые сутки жизни с множественными пороками развития, дыхательной недостаточностью, анурией. Ребенок находился в ОРИТ, где состояние было с положительной динамикой в виде регресса дыхательной недостаточности; гемодинамика стабильна; отмечается артериальная гипертензия почечного генеза, контролируемая плановой терапией амлодипином. В анализе на вторые сутки госпитализации уровень CD10 - 6,22 тыс. ед. фл., что составляет 104% от медианы показателя в совокупности здоровых индивидов. Со вторых суток после анурии отмечается восстановление диуреза. Ребенок переведен в госпитальное отделение. С учетом отсутствия нарастания дыхательной, сердечной и интерстинальной недостаточности на фоне прогрессивного роста почек, отсутствия гиперазотемии, адекватного темпа диуреза на фоне стимуляции, нетяжелых метаболических и электролитных нарушений, поддающихся медикаментозной коррекции, решено воздержаться от хирургических методов лечения, включая заместительную почечную терапию. Несмотря на проводимую консервативную терапию, отмечается прогрессия почечной гипертензии. В посеве мочи повторные высевы Enterococcus faecium 10⁵ (S ванкомицин, линезолид), с целью санации мочевых путей по чувствительности назначен линезолид, в посеве мочи от 31.01.2023 роста нет, однако появились воспалительные изменения в ОАМ, по согласованию с клин.фармакологом усилена АБТ, подключен цефоперазон сульбактам 100 мг/кг/сут. На фоне чего моча санирована, курс АБТ завершен; тенденция к генерализации инфекции отсутствует. Состояние пациентки в дальнейшем с отрицательной динамикой. Тяжесть состояния обусловлена хронической болезнью почек у ребенка с множественными пороками развития, в том числе поликистозом почек, осложненным нефрогенной артериальной гипертензией, плохо поддающейся антигипертензивной терапии, некомпактным миокардом, сердечной недостаточностью на этом фоне с выраженным риском острой гемодинамической нестабильности. В связи с потерей контроля заболевания 14.03.2023 выполнена двусторонняя нефрэктомия; послеоперационный период без особенностей. Ребенок длительное время наблюдается междисциплинарной командой специалистов.

Пример 4 (благоприятный) Девочка Ш.-Л. поступила в ОРИТ новорожденных в первые сутки жизни с диагнозом «Неонатальная аспирация амниотической жидкости и слизи. Аспирационная пневмония, дыхательная недостаточность». В анализе на первые сутки уровень CD10 - 6.4 тыс. ед. фл., что составляет 107% от медианы показателя в совокупности здоровых индивидов. С момента поступления ребенок находился на ИВЛ без зависимости от кислорода. В динамике режимы вентиляции с расширением. В возрасте 3-х суток жизни ребенок экстубирован, переведен на самостоятельное дыхание с дотацией дополнительного кислорода через маску; сохранялась умеренная дыхательная недостаточность. Периодически требовалась установка воздуховода. В динамике явления дыхательной недостаточности с разрешением, стойко независима от кислорода, клинически и рентгенологически данных за пневмонию нет. Достигнута стойкая санация мочи, других очагов бактериальной инфекции у ребенка не выявлено. Гемодинамика с момента поступления у ребенка стабильная. В кардиотонической терапии не нуждался. Ребенок с ВПС в динамике осматривался кардиологом - тактика ведения согласована. Энтеральное кормление с рождения с пошаговым расширением объема разового кормления. На 2-й неделе госпитализации активные попытки самостоятельного сосания, к 3-й неделе - полный объем кормления сосет сама, с учетом плоского характера весовой кривой в питание введена смесь для маловесных детей. В динамике питание усваивает хорошо, сосет более активно и эффективно, начала стабильно прибавлять в весе. В неврологическом статусе в динамике также с улучшением - девочка более активна, адекватно реагирует на осмотр, менее выражена мышечная гипотония. Рефлексы новорожденного вызываются удовлетворительно. Ребенок в удовлетворительном состоянии выписан домой.

Таким образом, заявляемый способ обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, а также характеризуется низкой себестоимостью и простотой исполнения. Способ найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических отделениях интенсивной терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования развития неонатального сепсиса. Определяют экспрессию CD10 на зрелых нейтрофилах периферической крови методом проточной цитометрии. При значении экспрессии CD10 ниже 6,29 тыс. ед. фл. прогнозируют развитие неонатального сепсиса. Способ обеспечивает повышение чувствительности и специфичности прогнозирования развития неонатального сепсиса за счет определения экспрессии CD10 на зрелых нейтрофилах периферической крови. 4 пр.

Способ прогнозирования развития неонатального сепсиса, характеризующийся тем, что определяют экспрессию CD10 на зрелых нейтрофилах периферической крови методом проточной цитометрии и при значении экспрессии CD10 ниже 6,29 тыс. ед. фл. прогнозируют развитие неонатального сепсиса.