СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ НЕРВНЫХ ТКАНЕЙ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОСОВМЕСТИМЫХ СУСПЕНЗИЙ ИЛИ ВЗВЕСЕЙ КРЕМНИЕВЫХ НАНОКЛАСТЕРОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K50/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, нейрохирургии, микрохирургии, нейротравматологии, и может быть использовано для стимуляции роста нервной ткани и восстановления иннервации тканей.

Из уровня медицины хорошо известны оперативные и терапевтические методики, способы и решения задач аналогичного характера.

Так, из уровня медицины известен «Способ стимуляции регенерации поврежденного периферического нерва» у экспериментальных животных после операции его перерезки и сшивания, который включает введение лекарственных препаратов, в качестве которых используют витамины группы В и антихолинэстеразные препараты. Дополнительно в послеоперационном периоде животным вводят внутримышечно нейротоксин яда пестрого скорпиона в дозах 40-50 мкг/кг один раз в 2 дня в течение 30-40 дней, повторяя курс 2-3 раза с интервалом 20-30 дней. Способ обеспечивает ускорение процесса регенерации и увеличение объема регенерирующих нервных волокон в периферическом нерве, см., например, описание к патенту РФ №2290187, А61К 35/64, А61М 5/00, А61Р 25/02.

Вместе с тем, из уровня медицины известен способ стимуляции роста нервных тканей, раскрытый в описании к патенту РФ №2185839, А61К 35/74, А61Р 25/00 «Применение препарата Ветом 7048 для восстановления регенерационных процессов в нервных тканях». Согласно данному способу, в качестве лекарственного препарата при восстановлении регенерационных процессов в нервных тканях в лечении больных с посттравматическими изменениями спинномозговых тканей предложено применение препарата Ветом-7048. Препарат стимулирует рост нервных отростков и размножение нейронов.

Кроме того, из уровня техники известны технологии аналогичного назначения, раскрытые в описаниях зарубежных охранных документов, например, US 6114126, US 5545719, US 4533244, ЕР 1544289.

Из уровня медицины так же известен «Способ лечения повреждения периферического нерва», при котором осуществляют аутонейропластику дефекта нерва, имплантацию проволочных электродов эпиневрально на оба конца зон контакта поврежденного участка нерва с расположением электродов, лишенными изоляции, открытыми активными концами вдоль направления поврежденного нерва. При этом перед имплантацией проволочных электродов производят разволокнение их концов и полученными нитевидными проволочками обхватывают по окружности нервный ствол и аутонейротрансплантат. Располагают электроды на дистальном и проксимальном концах поврежденного нерва на 5-10 мм выше и ниже зоны нейрорафии и проводят электростимуляцию. Способ позволяет ускорить регенерацию нервного волокна и снизить повреждения нервной ткани, см., например, описание к патенту РФ №2254884, A61N 1/32, А61В 17/00 (ближайший аналог).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что для его реализации требуется введение в организм металлических электродов и необходимость их последующего извлечения из организма. При этом вероятность повторного травматического воздействия на нервные волокна не исключается. Оставление металлического электрода в организме может привести к непредсказуемым последствиям.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности стимуляции роста нервных тканей на основе использования электрических свойств полупроводниковых кремниевых нанокластеров.

При реализации данного изобретения достигаются несколько медико-биологических результатов. Во-первых, исключается необходимость контактного подсоединения (и последующего удаления), возбуждающего нервные клетки и стимулирующего их регенерацию металлических электродов. Во-вторых, топография направления роста нервных тканей определяется не упомянутыми металлическими электродами, а электрически структурируемой системой кремниевых нанокластеров. В-третьих, будучи нейтральным веществом, кремний биодеградирует в организме в окись кремния, который выводится из него естественным образом без использования специальных мер.

Указанная задача решается путем введения в область участка тела с поврежденными нервными тканями кремниевых нанокластеров в форме суспензии или взвеси, приготовленных, например, на основе водного раствора.

Суть способа заключается в следующем. Будучи полупроводниковым материалом, кремний обладает известными электрическими свойствами, определяющимися структурой его энергетических уровней. С другой стороны, величина кремниевого нанокластера соизмерима с размером нервной клетки, что позволяет ему электрически эффективно взаимодействовать с ней, то есть принимать от нервной клетки электрические сигналы и электрически возбуждать ее. Это возбуждение передается центральной нервной системе.

Для иллюстрации последующего на фиг.1 представлены строения сенсорного (1) и моторного (2) нерва и использованы следующие обозначения: 3 - дендриты, 4 - аксон, 5 - нервная клетка, 6 - ядро нервной клетки, 7 - неврилемма, 8 - дендрон, 9 - миелиновая оболочка, 10 - нервные окончания, 11 - рецептор, 12 - шванновская клетка, 13 - ядро шванновской клетки, 14 - перехват Ренвье, 15 - концевая бляшка, 16 - эффектор, 17 - распространение нервного импульса. Также для иллюстрации на фиг.2 представлен срез нервного волокна и использованы следующие обозначения:18 - эпиневрий, 19 - перинервий, 20 - эндонервий. Пучки нервных волокон собраны в нервы. Нервы покрыты оболочкой из соединительной ткани - эпиневрием (18), каждый пучок разделяет перинервий (19), а эндонервий (20) связывает нервные волокна в пучки.

На фиг.3 приведена динамика изменения электрического потенциала U_n нервного импульса при его распространении вдоль аксона (4). Сигналы передаются по нервным клеткам в виде электрических импульсов. Электрофизиологические исследования показали, что мембрана аксона с внутренней стороны заряжена отрицательно по отношению к наружной стороне, и разность потенциалов составляет примерно -65 мВ. Этот потенциал, так называемый потенциал покоя (U_nn), обусловлен разностью концентраций ионов калия и натрия по разные стороны мембраны. При стимуляции аксона электрическим током потенциал на внутренней стороне мембраны увеличивается до +40 мВ. Потенциал действия (U_n∂) возникает за счет кратковременного увеличения проницаемости мембраны аксона для ионов натрия и входа последних в аксон (около 10^-6% от общего числа ионов Na⁺ в клетке). Нервные импульсы пробегают по аксонам (4) в виде незатухающей волны деполяризации со скоростью, зависящей от их толщины.

Острые повреждения периферических нервов включают три патогенетических звена: 1) нейрапраксия - временная потеря функции при отсутствии разрыва аксона, 2) axonotmesis - разрыв аксона с сохранением миелиновой оболочки из-за длительного сдавления или растягивания, ведущего к полному выпадению чувствительных и моторных функций и разной скорости восстановления (рост от проксимального к дистальному концу 1-2 мм/сут), зависит от возобновления роста аксона, 3) neurotmesis - разрыв и аксона, и его оболочки в результате пересечения нерва, который требует хирургического восстановления (регенерация - 2,5 см/мес).

Самой тяжелой формой такой травмы является разрыв нерва. Известно, что разорванный нерв может регенерировать. Для этого необходимо, чтобы нервное волокно со стороны разрыва, которое ближе к спинному мозгу, проросло до отделенной части; обычно такая регенерация ограничена длиной поврежденного участка до нескольких миллиметров. Если разрыв имеет большую протяженность, нервное волокно не может самостоятельно восстановиться.

На сегодняшний день такие травмы лечат путем автотрансплантации здорового участка нервного волокна из другого места в организме в область повреждений. Этот участок является «ориентиром» для роста поврежденного нерва. Такой метод обладает очевидными недостатками: потерей функции в донорской области, необходимость нескольких операций, а часто найти подходящий нерв для трансплантации оказывается просто невозможно. Существуют различные синтетические «протезы», но они работают хуже, чем автотрансплантация; они способны соединять разрывы длиной до 4 сантиметров.

Одним из перспективных направлений влияния на процесс регенерации нервных тканей является попытка связать живые нервные клетки с электронными устройствами.

Создание нейро-электронного соединения, которое могло бы передавать сигналы нейронной системе, представляет собой трудную задачу. Решающую роль здесь играет обеспечение биосовместимости используемых инструментов и материалов.

Биосовместимость подразумевает то, что живые клетки в искусственных или в естественных условиях растут без изменения их свойств.

Другим важным фактором при создании нейро-электронного соединения является размерность подсоединяемых к нейронной сети «контактирующих» устройств.

В последние годы были предприняты попытки связать живые нервные клетки (нейроны) с подложкой монолитного кремния и с электронными устройствами, основанными на кремнии [2]. Это направление стимулировалось возможностью использования хорошо отработанных технологий применения кремния для производства электронных приборов микронного размера, которые могли бы активировать нейроны для формирования нейро-электронного устройства сопряжения.

Однако, для взаимодействия с нейронной сетью в целом, более эффективным было бы использование оптических методов. К сожалению, из-за плохих оптических свойств монолитного кремния, нервональную активность практически невозможно превратить в световые сигналы. В последнее время большой интерес вызывает пористый кремний (ПК). Для иллюстрации на фиг.4 приведены характерный вид структуры ПК и размеры этой структуры: длина нитей (21) L 100 нм, а их диаметр D 1÷5 нм.

В [2] ПК использовался в качестве подложки, которая предназначалась для выращивания нейронов и для преобразования нервональной активности в световые сигналы. Поверхность ПК хорошо подходит для контакта нейрон - чип. Помимо этого, посредством своей обширной по площади поверхности и топографии, ПК может использоваться для формирования процесса выращивания нервных клеток или как электрод для фиксирования электрической активности, получаемой в ходе развития нервных клеток [1].

Установлено, что неврональные процессы могут направляться топографией пористого кремния, что позволяет использовать пористый кремний для направления аксонального роста, оживлять участки на фиксированной площади чипа и выборочно стимулировать аксональный рост различных видов нервных волокон.

Известными являются данные об успешном выращивании нейронов и живых клеток на подложках ПК, которые показали его биологическую совместимость. Нейроны, выращенные на подложках ПК, демонстрируют нормальные мембранные свойства и формирование биоэлектрического потенциала [2].

Все предыдущие описания использования ПК на сегодняшний день могут стимулировать регенерацию нервной ткани только вне живого организма (in vitro). Тем не менее, одним из важнейших результатов [1] и [2] является факт стимуляции роста в направлении, определяемого структурой ПК, в данном случае 2D наноструктурой. Собственно говоря, факт использования в рассмотренных работах плоской наноструктурной поверхности для регенерации нервных тканей и является серьезным сдерживающим фактором применения полученных результатов in vivo.

Заявляемый способ, на основе использования кремниевых нанокластеров, позволяет осуществлять электрическое (на уровне нанокластер - нейрон) стимулирование их регенерации как in vitro, так и in vivo (как вне, так и внутри организма). При этом наноструктуирование кремниевых кластеров происходит не на плоской поверхности, как в ПК, а в 3D пространстве суспензии или взвеси кремниевых нанокластеров, заполняющих место разрыва нервной ткани.

Ниже приводится описание графических материалов, никоим образом не ограничивающих все возможные варианты осуществления заявленного изобретения.

На фиг.5 приведена иллюстрация системы электрически связанных нейронов и цепочек кремниевых нанокластеров.

Ниже приводится нумерация основных элементов рассматриваемой системы и наименования этих элементов.

22, 23 - окончания разорванных нервных волокон;

24 - кремниевый нанокластер,

25 - цепи электрически связанных кремниевых нанокластеров;

26 - группа кремниевых нанокластеров, условно показывающая объемность структуры электрически связанных цепей нанокластеров,

27 - направления аксонального роста регенерирующей нервной ткани,

28 - локализация суспензии или взвеси в области разрыва нервных волокон.

Ниже приводится пример осуществления изобретения, никоим образом не ограничивающий все возможные варианты его реализации.

Полупроводниковая природа кремниевых нанокластеров приводит к тому, что после введения суспензии или взвеси кремниевых нанокластеров в локальную область разрыва нервных волокон, по меньшей мере, один из ближайших к поврежденной нервной клетке нанокластеров, например нанокластер (24), возбуждает в ней электрический потенциал и подсоединяется к ней за счет действия кулоновских сил.

Силы взаимодействия зарядов F прямо пропорциональны произведению модулей зарядов и обратно пропорциональны квадрату расстояния между ними r:

Нейтрализовав таким образом электрический заряд возбужденной нервной клетки, противоположная поверхность нанокластера сама оказывается заряженной. Следующий нанокластер аналогичным образом подсоединяется к предыдущему. В конце концов, образуется цепь кремниевых нанокластеров (25), соединенных друг с другом силой электрического притяжения. Локализация введенной суспензии или взвеси в пространстве повреждения нервных волокон (28) позволяет, в соответствии с законом минимума энергии, самоорганизовать структуру кремниевых нанокластером таким образом, что их цепи, начавшись у одного окончания поврежденного нерва, например (22), будут иметь свое окончание у другого его конца (23). Для реализации данного способа на основе применения известных технологий (например, путем механического измельчения) получают кремниевые нанокластеры, и приготавливают их суспензию или взвесь, например, на основе водного раствора. Приготовленный таким образом биосовместимый материал путем, например, инъекции вводят в локальную область с поврежденными нервными тканями.

Принцип стимуляции регенерации (по своей сути - автостимуляции и авторегинерации и роста в направлении (27)) нервных тканей заключается в передаче возбуждающих сигналов от ЦНС и в ЦНС (17) посредством искусственно создаваемых цепей электрически связанных кремниевых нанокластеров (25). При этом передача импульса возбуждения от нервного окончания происходит по принципу волны деполяризации, то есть по тому же принципу, который заложен природой для естественной передачи электрического возбуждения по нервным волокнам (см. фиг.3).

Группа кремниевых нанокластеров (24) на фиг.5 условно показывает объемность структуры, состоящей из электрических цепей (23).

Рассмотрение поверхности любого горизонтального сечения объемной структуры кремниевых нанокластеров приводит к выводу о том, что она эквивалентна структуре поверхности ПК (см. фиг.4), которая способствует стимуляции регенерации нервных тканей и определяет топологию их роста.

Таким образом, известное использование подложки ПК для стимуляции регенерации нервной ткани является частным случаем заявляемого способа, и помимо прочего имеет серьезные ограничения по применению.

Результаты испытаний суспензии (взвеси) кремниевых нанокластеров на подопытных крысах in vivo подтвердили эффективность заявляемого способа стимуляции регенерации нервных тканей.

Ниже представлены данные о материалах и методах экспериментальных исследований. Образцы кремниевых нанокластеров приготовлены методом электрохимического травления пластин монокристаллического кремния в электролите на основе плавиковой кислоты и этанола в соотношении 1:1 при плотности тока травления 60 мА/см² в течение 1 часа. Такая процедура позволяла получить слои так называемого пористого кремния, представляющего собой совокупность nc-Si с размером 2-5 нм. После завершения процесса травления слои пористого кремния были отделены от подложки, высушены и подвергнуты механическому измельчению до получения порошка.

В ходе приготовления инъекционных взвесей и суспензий кремниевые нанокластеры тщательно растирались в агатовой ступке. Инъекционные взвеси и суспензии приготовлены на основе смешивания полученного порошка с водой. Максимальный размер кремниевых нанокластеров в суспензии не превышал 50 нм. Приготовленные взвеси и суспензии с концентрациями 0,05, 0,25 и 0,5 г/л в дозах 100 мкл вводили в область травмированного нервного волокна.

В экспериментальное исследование было включено 30 крыс (250-300 г), у каждой из которых в начале исследования была нарушена целостность седалищного нерва (Nervius Ishiadicus).

Было сформировано 2 группы - каждая по 15 крыс.

Первая группа (контрольная) - для восстановления иннервации взвесь кремниевых нанокластеров не применялась.

Во второй группе (функциональной) производилась инъекция взвеси кремниевых нанокластеров в область нарушения целостности нервного волокна.

Контроль за функциональными группами проводился в течение 60 дней после операции.

Нами установлено, что у 70% крыс в группе, где применялась взвесь кремниевых нанокластеров, полное восстановление функции седалищного нерва наблюдалось уже на 49-ый день после операции.

При этом большинство животных в контрольной группе, у которых не проводилось восстановление иннервации, сформировали группу с поврежденными конечностями и в функциональном плане стали непригодными.

Ни одно животное из экспериментальной группы не выбыло.

Указанные выше концентрации взвесей и суспензий не в коем случае не ограничивают возможные их значения и могут быть подобраны в зависимости от типов повреждения нервных тканей.

Хирургическое вмешательство производилось в соответствии с этическими принципами исследований, связанных с животными, которые прописаны в MROI и европейском законодательстве (в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей).

Литературные источники

1. Fredrik Johansson, Martin Kanje, Cecilia Eriksson, Lars Wallman. Guidance of neurons on porous patterned silicon: is pore size important. Phys.stat.sol.(c) 2, No.9, 3258-3262 (2005)/DOI 10/1002/pssc.200561135.

2. S.Ben-Tabou de-Leon, R. Oren, M.E.Spira, N.Korbakov, S.Yitzchaik, A.Sa'ar. Porous silicon substrates neurons culturing and bio-photonic sensing. Phys.stat.sol.(a) 202, No.8 1456-1461 (2005)/DOI 10.1002/pssa.200461136.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и предназначено для стимуляции регенерации нервных тканей. Проводят восстановление электрической проводимости нервных тканей. Для этого на травмированном участке нервных тканей формируют локальную область из биосовместимой суспензии или взвеси кремниевых нанокластеров. Предлагаемый способ позволяет стимулировать регенерацию нервных тканей в эксперименте. 5 ил.

Способ стимуляции регенерации нервных тканей, включающий восстановление электрической проводимости нервных тканей, для чего на травмированном участке нервных тканей формируют локальную область из биосовместимой суспензии или взвеси кремниевых нанокластеров.