БИОРЕЗОРБИРУЕМЫЙ ИМПЛАНТАТ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕРВОВ Российский патент 2023 года по МПК A61F2/04 A61L27/18 A61L27/56 A61L27/58 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, точнее, к биорезорбируемым имплантатам на основе полимерных нановолокон для регенерации периферических нервов.

Изобретение предназначено для использования в медицине, а именно в нейрохирургии, травматологии, ортопедии в качестве биорезорбируемых имплантатов для регенерации периферических нервов. Изобретение может найти применение в тканевой инженерии для регенерации аксонов и леммоцитов.

В настоящее время поврежденные периферические нервы восстанавливают с помощью хирургического вмешательства, а именно наложением анастомозов. Однако, это эффективно лишь при размере поврежденного участка нерва, диастазе, менее 3 см.

При реконструкции повреждений размером более 3 см наложение швов отрицательно влияет на регенерацию нерва ввиду возникающих механических напряжений в нервной ткани. Поэтому в таких случаях применяют трансплантаты различного происхождения, а также имплантаты в виде трубчатых каналов – кондуитов (Lundborg G. A 25-year perspective of peripheral nerve surgery: Evolving neuroscientific concepts and clinical significance // J Hand Surg Am. 2000. Vol. 25, № 3. P. 391–414; Meek M.F., Coert J.H. US Food and Drug Administration/Conformit Europe-approved absorbable nerve conduits for clinical repair of peripheral and cranial nerves. // Ann Plast Surg. 2008. Vol. 60, № 1. P. 110–116).

Чаще всего восстановление периферического нерва проводят методом аутотрансплантации, который считается «золотым стандартом» (Babu P. et al. Entubulation techniques in peripheral nerve repair // The Indian Journal of Neurotrauma. 2008. Vol. 5, № 1. P. 15–20; de Ruiter G.C.W. et al. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair // Neurosurg Focus. 2009. Vol. 26, № 2. P. E5; Millesi H. Bridging defects: autologous nerve grafts. // Acta Neurochir Suppl. 2007. Vol. 100. P. 37–38). Источником материала являются ткани или органы собственного организма. Аутотрансплантат является матрицей, которая обеспечивает направление регенерации нервных волокон, жизнеспособность шванновских клеток (леммоцитов) и диффузию к месту дефекта нейротрофических факторов. Однако этот метод обладает множеством ограничений, связанных с необходимостью многократных операций, с отличием размеров трансплантата и нервной ткани, дефицита донорского материала. Трудности в восстановлении нервной ткани связаны с инвазией рубцовой ткани, что обусловлено миграцией фибробластов в зону диастаза.

Перечисленные проблемы частично решаются применением алло- и ксенотрансплантатов, но их клиническое применение ограничено в связи с частными случаями иммунного отторжения, вторичной инфекции и других системных побочных эффектов.

Многих перечисленных недостатков лишены имплантаты на основе природных и синтетических полимеров. Однако, лишь часть из них превосходит по своим характеристикам аутотрансплантаты и большинство не позволяют восстанавливать дефекты с диастазом более 3 см. Помимо этого существует сложность их хирургического применения, а продукты разложения могут оказывать негативное воздействие на живой организм. Если имплантат получен из нерезорбируемого материала, требуется повторная операция с целью его удаления.

Анализ литературы позволил сформулировать основные требования к материалам, структуре и дизайну имплантатов, используемых для регенерации нервов. Среди них:

- биосовместимость материала имплантата и продуктов его биорезорбции;

- пористая структура имплантата должна препятствовать диффузии клеток соединительной и мышечной тканей, в область диастаза;

- пористая структура имплантата должна способствовать васкуляризации стенок имплантата;

- внутренний канал трубчатого имплантата должен включать анизодиаметричные поры, поперечный диаметр которых соизмерим с диаметром аксонов поврежденного нерва;

- скорость резорбции имплантата и его компонентов не должна быть выше скорости регенерации нервной ткани.

В настоящее время известны конструкции для направленной регенерации периферических нервов. Они состоят из полимерной трубки, внутренний канал которой содержит стволовые или соматические клетки, компоненты межклеточного матрикса, гелеобразный или волокнистый наполнитель (Chew S.Y. et al. Aligned Protein-Polymer Composite Fibers Enhance Nerve Regeneration: A Potential Tissue-Engineering Platform. // Adv Funct Mater. 2007. Vol. 17, № 8. P. 1288–1296; Jing W. et al. Constructing conductive conduit with conductive fibrous infilling for peripheral nerve regeneration // Chemical Engineering Journal. 2018. Vol. 345. P. 566–577; Yoo J. et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel // Biomater Sci. 2020. Vol. 8, № 22. P. 6261–6271). Наполнители создают благоприятную среду для направленного движения шванновских клеток, снижению их дезориентации (Ertürk A. et al. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. // J Neurosci. 2007. Vol. 27, № 34. P. 9169–9180). Эти клетки выполняют важнейшие функции в процессе регенерации нерва, они формируют миелиновую оболочку нейронов, выполняют опорную функцию, способствуют ионному обмену тела нейрона с внешней средой, что приводит к возможности передачи возбуждения по нервным волокнам.

Регенерация периферических нервов при диастазе более 3 см без использования имплантатов различного строения невозможна. Отсутствие контакта между нервными волокнами приводит к нарушениям двигательной или сенсорной активности человека или животного.

В патенте CN 101579246 описана конструкция трубки для восстановления периферического нерва. Внутренний диаметр трубки от 1 до 200 мкм, толщина стенок от 0,01 до 1 мм. Стенки трубки состоят из двух слоев волокон фиброина шелка диаметром от 50 до 3000 нанометров. Внешний слой состоит из волокон, ориентированных перпендикулярно оси трубки, внутренний слой - из волокон, расположенных параллельно оси трубки. Ориентация волокон достигалась варьированием скорости вращения приемного барабана от 2,5 до 1500 об/мин и скорости линейного перемещения фильеры от 2,5 см/c до 8 м/с и более.

Особая чистота фиброина шелка достигалась трехкратным кипячением исходного сырья в течение 30 мин в растворе карбоната натрия массовой долей 0,05%. Очищенные фиброиновые волокна растворяли в смеси этанола с LiBr при температуре 80°±2°C. После диализной сушки получали регенерированную пленку фиброина шелка, которую перед электроформованием волокон, растворяли в муравьиной кислоте. Для повышения скорости регенерации периферического нерва, внутренний канал трубки заполняли одним или несколькими типами факторов роста нервных клеток, таких как нейротрофические факторы роста головного мозга, фактор роста фибробластов, а также нейротрофический фактор роста глиальной клеточной линии.

Конструкция, приведенная в патенте CN 101579246 включает способ получения фиброина шелка и волокон на его основе, требующий высоких энергетических и трудовых затрат, несет экологическую нагрузку на окружающщую среду. При получении трубчатого имплантата используют способ электроформования нановолокон, расположенных как параллельно оси трубки, так и перпендикулярно, что также существенно усложняет процесс получения имплантата для регенерации нервов.

Также, описан имплантат на основе нановолокон для направленного роста нервов и способ его получения в патенте CN 104739473. Кондуит в виде трубки состоит из внутреннего слоя, содержащего нити на основе нановолокон, и наружного слоя в виде пленки из нановолокон, полученных методом электроформования. Для получения нитей из нановолокон для внутреннего слоя применяли метод прядения. Нити, состоящие из ориентированных нановолокон, покрывали полимерной пленкой. Нановолокна для пленки и нити получали из синтетических полимеров, таких как поликапролактон, полимолочная кислота, полиуретан, а также из полимеров природного происхождения - коллагена, желатина и фиброина шелка.

Такая конструкция имплантата включает нити, полученные методом прядения исходного материала на основе нановолокон, обработанные полимерным раствором с целью образования пленки на их поверхности. Это является существенным недостатком способа получения имплантата в целом, так как метод прядения не сможет обеспечить необходимый уровень упругих характеристик элементов конструкции, а также требует дополнительных стадий его получения.

Имплантат для восстановления нервных волокон на основе хитозана и нейротрофических факторов роста описан в патенте CN113546215A. Имплантат с пористостью 65–85% изготавливали из хитозана с молекулярной массой 10K-500k. В зависимости от пористости образца и молекулярной массы хитозана время резорбции имплантата в организме человека составляла от 1 недели до 6 месяцев. Имплантат обладал хорошей биосовместимостью. Способ получения имплантата включал растворение хитозана в растворах кислот, таких как уксусная, фосфорная, лимонная, молочная. Заливку раствора в форму, заморозку его при температуре от -60 до -90 °С, лиофилизацию и обработку щелочным раствором с последующей промывкой водой. Пористую губку насыщали нейротрофическими факторами, основным фактором роста фибробластов (bFGF), мозговым нейротрофическим фактором (BDNF), нейротрофическим фактором 3 NEXE, нейротрофическим фактором глиальных клеток (GDNF). Существенным недостатком описанной в данном патенте конструкции от заявленной является способ формирования пористой структуры. В патенте используют метод лиофилизации раствора хитозана, с последующей обработкой полученной губки раствором щелочи. Это не позволяет получать тонкостенную пористую конструкцию на основе хитозана, обладающую необходимыми прочностными и упругими характеристиками в жидких средах.

Трубка для регенерации нервов описана в патенте CA2334688A1. Трубка представляет собой нетканый полимерный материал, внешняя и/или внутренняя поверхность которого покрыта коллагеном и/или желатином. В трубке параллельно оси расположены коллагеновые волокна, предварительно подвергнутые термогидратационному сшиванию и покрытые ламинином. Коллагеновые волокна на основе коллагена I типа или смеси типа I и III заполняют просвет искусственного канала на 70–99,99 %, а их диаметр составляет 1–50 мкм.

Искусственная трубка может быть получена на основе следующих биорезорбируемых полимеров: полигликолевая, полимолочная кислоты или их сополимеры, сополимер молочной кислоты и ε-капролактона, полидиоксанон, и сополимер гликолевой кислоты и триметиленкарбоната путем трикотажного плетения с последующим погружением в раствор коллагена или желатина и сушкой. Длина трубки составляла 28–35 мм, внутренний диаметр 1–8 мм, толщина 0,1–3 мм, размер пор 5–30 мкм, толщина коллагенового и/или желатинового покрытия 0,2–5 мм.

Трубчатый имплантат, описанный в патенте получают методом трикотажного плетения с последующей обработкой коллагеном. Трикотажный способ получения материала не позволяет сформировать пористую структуру с размером пор менее миллиметра, что является недостатком конструкции, не позволяющим препятствовать диффузии фибробластов и миоцитов в зону диастаза.

В патенте RU 2446757 C1 описан способ изоляции области шва периферического нерва с использованием политетрафторэтилена. Проксимальный конец поврежденного периферического нерва проводят в трубчатом имплантате из политетрафторэтилена. Способ позволяет снизить послеоперационные осложнения, а именно образование нервом и сдавление нерва рубцовыми тканями. Политетрафторэтилен не является биорезорбируемым полимером, стенки трубки на его основе не содержат пор, необходимых для обмена зоны дефекта нерва белками, витаминами, микроэлементами. Отсутствие биорезорбции трубчатого имплантата на основе политетрафторэтилена является существенным недостатком, так как требует повторного хирургического вмешательства по его удалению.

В патенте WO2007090102A2 описана полимерная волокнистая матрица, кондуит, для регенерации нервных волокон. Кондуит представляет собой многослойную трубчатую конструкцию, состоящую от 1 до 1000 слоев из нано- и микроволокон. Внутренний (первый) слой которой состоит из волокон, ориентированных вдоль оси трубки. Кондуит получен методом электроформования из таких биорезорбируемых полимеров как алифатические полиэфиры, полиалкилен, полидиметилсилоксан, поликапролактон, полилизин, коллаген, ламинин, фибронектинастин, эластин, альгината, фибрин, гиалуроновая кислота, протеогликаны, полипептиды и их комбинаций при этом хотя бы один слой из сополимера лактид и гликолида.

После электроформования первого слоя методом вытяжки проведена ориентации волокон вдоль оси трубки не менее, чем на 50%. После получения кондуита из нетканого материала, в просвет вводили ориентированные волокна.

В кондуит могут быть введены шванновские клетки, нейральные стволовые клетки или компоненты внеклеточного матрикса, факторы роста с образованием ковалентной связи с полимерным кондуитом.

В описанном патенте, для получения одноосно ориентированных структурных элементов конструкции используют метод вытяжки пленочного материала на основе полимерных нановолокон. Эта дополнительная технологическая операция не может привести к формированию структуры нити с необходимыми упругими характеристиками.

Таким образом, создание качественного биорезорбируемого полимерного имплантата для регенерации периферических нервов остается актуальной задачей.

Решением данной задачи является создание эффективного биорезорбируемого имплантата для регенрации периферических нервов.

Заявляемый биорезорбируемый имплантат для регенерации периферических нервов на основе нановолокон из биорезорбируемых полимеров, представляющий собой трубку на основе нановолокон из поли(L-лактида), поли(ε-капролактона) или сополимера поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) с соотношением мономерных звеньев от 50:50 до 90:10, стенки которой толщиной от 50 до 700 мкм, содержащие поры размером от 0,1 до 10 мкм и внутренним диаметром от 0,5 до 10 мм, при этом внутренний канал трубки содержит композиционные моноволокна из хитозана и наполнителя в виде нанофибрилл хитина в количестве от 0 до 50 масс.% по отношению к хитозану, диаметр композиционных моноволокон составляет от 10 мкм до 100 мкм, модуль упругости от 8 до 12 ГПа.

Совокупность существенных признаков заявляемого имплантата для регенерации периферических нервов обеспечивает получение технического результата:

- биорезорбируемость, которая обеспечивается химическим строением поли(L-лактида), поли(ε-капролактона), а также сополимеров поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона);

- поры размером 0,2–200 мкм, обеспечивают барьерные свойства стенок имплантата, препятствуют миграции клеток, в частности мио- и фибробластов в зону диастаза, образованию соединительной ткани;

- пористая структура имплантата способствует диффузии в зону диастаза белков, витаминов и микроэлементов, необходимых для регенерации нервной ткани;

- свободный объем внутреннего канала трубки, в который помещены композиционные волокна на основе хитозана, состоит из протяженных пор, способствующих направленному росту аксонов и шванновских клеток от проксимального конца к дистальному;

- упругие свойства биорезорбируемых композиционных волокон из хитозана, содержащих нанофибриллы хитина, обеспечивают стабильность механических свойств имплантата и его пористой структуры;

- полиэлектролитные свойства хитозана и волокон на его основе способствуют прохождению электрических импульсов между дистальным и проксимальным концами поврежденного нерва.

Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну биорезорбируемого имплантата для регенерации периферических нервов.

Существенным отличием настоящего изобретения от описанных в приведенных патентах, является трубка, состоящая из одного слоя нановолокон из резорбируемых полимеров. Наличие во внутреннем канале трубки композиционных волокон на основе хитозана формирует протяженные поры, поперечный размер которых соизмерим с размерами аксонов периферического нерва, что обеспечивает направленный рост аксонов периферического нерва и повышение пролиферативной активности шванновских клеток. Наличие композиционных волокон также обеспечивает стабильность упругих свойств имплантата. Полиэлектролитные свойства хитозана и волокон на его основе, обладающих ионной проводимостью, способствуют электрической коммуникации между дистальным и проксимальным концами поврежденного нерва.

Только совокупность существенных признаков заявляемого имплантата для регенерации периферических нервов - трубка из нановолокон на основе биорезорбируемых полимеров, канал которой содержит композиционные волокна из хитозана, в которых наполнителем являются нанофибриллы хитина, позволяет достичь указанного технического результата.

Неочевидным из уровня техники является факт, что пористая структура трубчатого имплантата на основе нановолокон из биорезорбируемых полимеров, полученных методом электроформования, препятствует диффузии клеток в область диастаза, что предотвращает возникновение соединительной ткани между поврежденными концами нерва. Наличие в составе композиционных волокон на основе хитозана и нанофибрилл хитина инициирует направленную регенерацию аксонов и пролиферацию шванновских клеток. Конструкция имплантата позволяет выполнять все манипуляции, связанные с его стерилизацией, а также выполнением анастомозов при имплантации.

Ни в одном из аналогов не удалось при комбинации полимерной трубки из нановолокон и композиционных волокон из хитозана и нанофибрилл хитина получить результат заявляемого изобретения. Это позволяет утверждать о соответствии заявляемого имплантата для регенерации периферических нервов условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Графические материалы:

Фиг.1 Схема имплантата, наполненного хитозановыми волокнами.

Фиг.2 Микрофотография кондуита на основе нановолокон поли(L-лактида) и композиционных волокон из хитозана.

а, б) торец;

в, г) внутренний канал;

Фиг.3 Фотографии стадий имплантации кондуита для регенерации седалищного нерва крысы:

а) нативный седалищный нерв;

б) седалищный нерв с диастазом 10 мм;

в) дефект нерва, замещенный аутоневральной вставкой;

г) имплантат на основе нановолокон из поли(L-лактида);

д) седалищный нерв после имплантации;

е) седалищный нерв через 4 месяца после реконструкции;

Сущность изобретения и подтверждение возможности его осуществления наиболее полно раскрываются в примере получения биорезорбируемого имплантата для регенерации периферических нервов и его применения.

Пример 1.

Имплантат для регенерации периферических нервов представлял трубку из нановолокон поли(L-лактида) с внутренним диаметром 1,0 мм, стенки трубки толщиной 300 мкм содержали поры размером от 0,2 до 10 мкм. Внутренний канал трубки содержал 90 моноволокон из хитозана диаметром 100 мкм, модуль упругости которых составлял 8 ГПа. (Фиг. 1). Фотография кондуита, наполненного волокнами, представлена на фиг. 2.

Эксперименты in vivo проводили на самцах белых крыс Wistar в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (принципы Европейской конвенции, Страсбург, 1986 г., и Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными 1996 г.). Вес подопытных животных составлял 180–200 г, возраст – 3 месяца, количество – 10 штук в каждой группе. Животных оперировали под общей анестезией (растворы Zoletil 100–0,1 мл и Rometarum 20 мг/мл – 0,0125 мл на 0,1 кг массы животного, интраперитонеально). Животным рассекали седалищный нерв, и на уровне середины бедренной кости создавали диастаз размером 1см. (Фиг. 3). Диастаз замещали кондуитом. После имплантации рану послойно ушивали атравматическими иглами с нитью Prolen 4-0.

Наиболее объективным методом оценки функционального состояния периферических нервов является электронейромиография - метод диагностики, основанный на анализе биоэлектрических потенциалов мышц и периферических нервов. Процедура заключается в воздействии низкоинтенсивных электрических импульсов и фиксации реакции мышцы, иннервируемой этим нервом, М-ответ. Амплитуда М-ответа указывает на количество двигательных единиц в данной мышце.

Для проведения электронейромиографии, животных иммобилизовали на манипуляционном столике, далее рефератный и стимулирующий электроды вводили в m. biceps femoris (двуглавая мышца бедра), заземляющий электрод фиксировали на стопе.

Амплитуда М-ответа интактных нервов подопытных животных составляла 26-28мВ. Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 5.1±1.8 мВ, через 16 недель 8,8±3.9 мВ.

Пример 2. Имплантат получали по способу, приведенному в примере 1. Трубка состояла из нановолокон на основе поли(ε-капролактона). Внутренний канал трубки содержал 90 композиционных моноволокон из хитозана, содержащих 0,5 мас. % нанофибрилл хитина, диаметром 80 мкм, модуль упругости которых составлял 10 ГПа.

Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 4.3±1,7 мВ, через 16 недель 12,5±5,8 мВ.

Пример 3. Имплантат получали по способу, приведенному в примере 1. Трубка состояла из нановолокон на основе поли(L-лактида). Внутренний канал трубки содержал 100 композиционных моноволокон из хитозана, содержащих 30 мас. % нанофибрилл хитина, диаметром 100 мкм, модуль упругости которых составлял 11 ГПа.

Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 4.9±1.4мВ, через 16 недель 12,7±3.7 мВ.

Пример 4. Имплантат получали по способу, приведенному в примере 1. Трубка состояла из нановолокон на основе поли(L-лактида). Внутренний канал трубки содержал 70 композиционных моноволокон из хитозана, содержащих 50 мас. % нанофибрилл хитина, диаметром 100 мкм, модуль упругости которых составлял 12 ГПа.

Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 5.3±0.9 мВ, через 16 недель 14,1±4.6 мВ.

Пример 5. Имплантат получали по способу, приведенному в примере 1. Трубка состояла из нановолокон на основе поли(L-лактида). Внутренний канал трубки содержал 50 волокон из хитозана, диаметром 25 мкм, модуль упругости которых составлял 7 ГПа.

Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 3.9±1.5 мВ, через 16 недель 6.9±4.7 мВ.

Пример 6. Имплантат получали по способу, приведенному в примере 1. Трубка состояла из нановолокон на основе сополимера поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) с соотношением мономерных звеньев 70:30. Внутренний канал трубки содержал 80 волокон из хитозана, диаметром 90 мкм, модуль упругости которых составлял 8 ГПа.

Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 3.5±1.3 мВ, через 16 недель 11,6±3,5 мВ.

Пример 7. Имплантат получали по способу, приведенному в примере 1. Трубка состояла из нановолокон на основе сополимера поли(L-лактида) Внутренний канал трубки не содержал волокон из хитозана,

Значения амплитуды М-ответа после имплантации: через 4 недели 5.1±1.8 мВ, через 16 недель 8,8±3.9 мВ.

Технический результат заключается в том, что применение имплантата на основе нановолокон из биорезорбируемых полимеров и композиционных волокон из хитозана, содержащих нанофибриллы хитина в экспериментах in vivo по регенерации периферических нервов на животных показало существенное повышение двигательной активности задних конечностей подопытных крыс по сравнению с контрольными животными.

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к биорезорбируемым имплантатам для регенерации периферических нервов на основе нановолокон из биорезорбируемых полимеров. Имплантат представляет собой трубку на основе нановолокон из поли(L-лактида), поли(ε-капролактона) или сополимера поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) с соотношением мономерных звеньев от 50:50 до 90:10. Стенки трубки с толщиной от 50 до 700 мкм и внутренним диаметром от 0,5 до 10 мм содержат поры размером от 0,1 до 10 мкм. Внутренний канал трубки содержит композиционные моноволокна из хитозана и наполнителя в виде нанофибрилл хитина в количестве от 0 до 50 мас.% по отношению к хитозану. Диаметр композиционных моноволокон составляет от 10 мкм до 100 мкм, модуль упругости от 8 до 12 ГПа. Достигается повышение качества биорезорбируемого полимерного материала для регенерации периферических нервов за счет формирования структуры нити с необходимыми упругими характеристиками. 3 ил., 7 пр.

Биорезорбируемый имплантат для регенерации периферических нервов на основе нановолокон из биорезорбируемых полимеров, представляющий собой трубку на основе нановолокон из поли(L-лактида), поли(ε-капролактона) или сополимера поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) с соотношением мономерных звеньев от 50:50 до 90:10, стенки которой толщиной от 50 до 700 мкм содержат поры размером от 0,1 до 10 мкм, при этом внутренний канал трубки диаметром от 0,5 до 10 мм содержит композиционные моноволокна из хитозана и наполнителя в виде нанофибрилл хитина в количестве от 0 до 50 мас.% по отношению к хитозану, диаметр композиционных моноволокон составляет от 10 мкм до 100 мкм, модуль упругости от 8 до 12 ГПа.