КЛЕТКИ ЛЕГКИХ ХЛОПКОВЫХ КРЫС ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N5/00 C12N5/06 C12N7/00 C12N7/02 A61K39/42 

Релевантные заявки/включение для сведения

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №60/366014, поданной 20 марта 2002 г., включенной сюда в виде ссылки. Вышеупомянутая заявка и все документы, цитированные здесь или во время ее выполнения («приложенные цитированные документы»), и все документы, цитированные или упомянутые в приложенных цитированных документах, и все документы, цитированные или упомянутые здесь («цитированные здесь документы»), и все документы, цитированные или упомянутые в цитированных здесь документах, наряду с инструкциями, описаниями, техническими условиями продуктов и вкладышами для любых продуктов изготовителей, упомянутые здесь или в любом документе, включенном здесь для сведения, включены здесь для сведения и могут быть использованы в практике изобретения.

Область изобретения

Данное изобретение относится к новой клеточной линии и ее применениям, включая новый способ получения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вируса, вызывающего заболевание свиней, известное как репродуктивный и респираторный синдром свиней (РRRS).

В более общем смысле изобретение относится к размножению микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению (например, депонированных клеток или клеточной линии, или клеток, или клеточной линии, обладающих всеми их отличительными свойствами) для получения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, такие как микроорганизмы или патогены, например, вирусы, для которых обычно грызуны или крысы, или хлопковые крысы, или клетки легких хлопковых крыс не являются естественными хозяевами, или РНК-вирусы, например, одноцепочные с «плюс»-цепью РНК-вирусы, например, вирусы порядка Nidovirales, например, артевирусы или вирусы семейства Arteriviridae, например, вирус, повышающий активность лактатдегидрогеназы (LDV), вирус инфекционного артериита лошадей (EAV), вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV) и вирус PRRS (переносчиками которого, как правило, являются членистоногие), вирусы семейства Coronaviridaе, например, коронавирусы, такие как вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов (также вирусы, переносчиками которых, как правило, являются членистоногие) и торовирусы, такие как торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота.

Вирусы, преимущественно размножающиеся с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, включают вирус парагриппа собак (CPI), например, CPI типа 2 (CPI-2), аденовирус, такой как аденовирус собак (CAV), например, аденовирус собак типа 2 (CAV-2), аденовирус свиней (PAV), например, аденовирус свиней типа 3 (PAV-3) и типа 5, герпесвирус крупного рогатого скота, например, герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (является возбудителем инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR)), герпесвирус лошадей (EHV), например, типа 1 (EHV-1) или типа 4 (EHV-4), ротавирус крупного рогатого скота (BRV), вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (PI-3), кишечный и респираторный коронавирус крупного рогатого скота (BCV), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV).

Более предпочтительно вирус представляет собой вирус PRRS.

В более предпочтительных воплощениях клетки легких хлопковых крыс или клеточная линия представляют таковую, депонированную в АТСС как РТА-3930, или клетки легких, или клеточную линию, обладающую всеми отличительными свойствами АТСС РТА-3930, или клетки легких хлопковых крыс, или клеточную линию, полученную культивированием клеток легких хлопковых крыс, по меньшей мере, в течение 10, например, по меньшей мере, в течение 21 или 76, или 100 пассажей, например, 10 или более, или 21 или более, или 76, или более пассажей, например, по меньшей мере, в течение 10 или 21, или 76 пассажей и преимущественно до (и включая) 100 пассажей и получение такой клеточной линии, в которой клетки легких хлопковых крыс, в основном, являются эпителиальными клетками, и морфологические характеристики сохраняются при пассажах.

Следовательно, изобретение относится к подобным клеткам или клеточной линии, а также ко всем их применениям.

Вирусы, размноженные с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, пригодны для получения иммуногенных композиций и вакцин против заболеваний, вызванных вирусами, такими как PRRSV. Аналогичным образом, микроорганизмы или другие патогены, культивированные с использованием клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, пригодны для получения иммуногенных и вакцинных композиций против других патогенов или микроорганизмов.

Также изобретение относится к применению вирусов, выращенных пассажами в клетках по изобретению, например, для получения аттенуированных, инактивированных и субъединичных иммуногенных композиций и вакцин; и таким образом, изобретение относится к подобным аттенуированным, инактивированным и субъединичным иммуногенным композициям и вакцинам.

Уровень техники

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS) впервые был описан в Северной Каролине (США) в 1987 г. В то время данное заболевание свиней называли «загадочным» заболеванием свиней или MSD, позднее оно стало известно как «синдром бесплодия и респираторных расстройств у свиней» или SIRS. Затем, в 1990 г., оно появилось в Центральной Европе. В начале его называли в Европе «синдромом эпидемических абортов и респираторных расстройств» или PEARS, и наконец «репродуктивным и респираторным синдромом свиней» или PRRS, которое стало общепринятым названием в мире.

Вирус PRRS представляет собой покрытый оболочкой вирус с одноцепочечной РНК, впервые был выделен в Нидерландах и назван вирусом Лелистада. Его отнесли к семейству Arteriviridaе. Вирусы семейства Arteriviridaе входят в порядок Nidovirales. Другими вирусами в порядке Nidovirales являются вирусы семейства Coronaviridae, такие как коронавирусы и торовирусы.

Вирус PRRS был описан в заявке WO 92/21375. Изолят был депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) в Институте Пастера, Париж, Франция, под инвентарным номером I-1102. Был также выделен североамериканский тип (WO 93/03760), и вирус был помещен на хранение в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) под инвентарным номером VR-2332.

У свиней заболевание PRRS характеризуется нарушениями со стороны репродуктивной системы и респираторными симптомами. Клетками-мишенями для вируса PRRS являются макрофаги.

Одной из проблем, затрудняющих получение иммунологических продуктов против вируса PRRS, является ограниченная доступность стабильных субстратов для репликации вируса.

Вирус PRRS может размножаться только на альвеолярных макрофагах (РАМ) свиней (Wensvoort G. et al., in The Vet. Quart. 13:121-130, 1991). Необходимость использования здоровых свиней определенного возраста для получения данных макрофагов имеет несколько недостатков. Кроме того, чувствительность к заражению вирусом не гарантирована у выделенных РАМ, поскольку клеточные субстраты, полученные от различных животных, всегда очень вариабельны. Это создает основной недостаток при получении партий антигена постоянного и однородного качества, и каждую партию необходимо оценивать для определения ее чувствительности.

Проводились исследования с целью поиска других клеточных субстратов. Так, в патенте США №5476778 тестировали 15 клеточных линий, полученных от других видов животных (например, крупного рогатого скота, собак, кошек, человека, свиней, обезьян) и из других тканей (например, почек, легких, семенников) для культивирования вируса PRRS. Только на одном типе (клетки МА-104) из 15 клеточных линий имел место рост вируса PRRS.

Линии клеток почек обезьян (например, VERO, MA-104, MARC-145, см. соответственно патент США №5476778 и заявку WO 98/00165) используют для культивирования и аттенуирования вируса PRRS. Но титры вируса PRRS на данных клетках являются низкими и, следовательно, стоимость получения - высокой.

Несмотря на то, что в настоящее время инактивированные и аттенуированные вакцины против PRRS являются промышленно доступными, было бы очень важным иметь альтернативные клеточные субстраты для получения вируса PRRS, например, для производства вакцин или иммуногенных композиций. И в более общем смысле является очень важным иметь альтернативные клеточные субстраты для получения патогенов, таких как вирусы, например, РНК-вирусы, например, одноцепочечные с «плюс»-цепью РНК-вирусы, такие как вирусы порядка Nidovirales, такие как артевирусы, или вирусы семейства Arteriviridaе, и вирусы семейства Coronaviridae, например, для получения вакцин или иммуногенных композиций.

Кроме того, было бы предпочтительно обеспечить новую линию клеток легких хлопковых крыс.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основано на установлении того факта, что, несмотря на то, что грызуны не являются естественными хозяевами вируса PRRS, вирус PRRS растет или размножается в клетках легких хлопковых крыс. Кроме того, была получена и депонирована новая клеточная линия, произведенная из тканей легких хлопковых крыс.

Настоящее изобретение также основано на установлении того факта, что другие вирусы также растут и размножаются в клетках легких хлопковых крыс, такие вирусы, которые не являются природными патогенами грызунов. Данные вирусы включают вирус парагриппа собак типа 2 (CPI-2), аденовирус собак типа 2 (CАV-2), герпесвирус лошадей типа 1 (EHV-1), герпесвирус лошадей типа 4 (EHV-4), ротавирус крупного рогатого скота (BRV) и коронавирус крупного рогатого скота (BCV).

В более общем смысле настоящее изобретение включает применение клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению для размножения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, такие вирусы, для которых обычно грызуны или крысы, или хлопковые крысы, или клетки легких хлопковых крыс не являются естественными хозяевами, или вирусы порядка Nidovirales, например, артевирусы или вирусы семейства Arteriviridaе, например, вирус, повышающий активность лактатдегидрогеназы (LDV), вирус инфекционного артериита лошадей (EAV), вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV) и вирус PRRS (переносчиками которого, как правило, являются членистоногие), вирусы семейства Coronaviridaе, например, коронавирусы, такие как вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов (также вирусы, переносчиками которых, как правило, являются членистоногие) и торовирусы, такие как торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота.

Вирусы, преимущественно размножающиеся с использованием линии клеток легких хлопковых крыс или клеток, или клеточной линии по изобретению, включают вирус парагриппа собак (CPI), например, CPI типа 2 (CPI-2), аденовирус, такой как аденовирус собак (CAV), например, аденовирус собак типа 2 (CAV-2), аденовирус свиней (PAV), например, аденовирус свиней типа 3 и (PAV-3), герпесвирус крупного рогатого скота, например, герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (является возбудителем инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR)), герпесвирус лошадей (EHV), например, типа 1 (EHV-1) или типа 4 (EHV-4), ротавирус крупного рогатого скота (BRV), вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (PI-3 или bPI-3), коронавирус крупного рогатого скота (BCV) и вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Более предпочтительно вирус представляет вирус PRRS. Следовательно, изобретение относится к размножению, или культивированию, или выращиванию данных вирусов.

Некоторые вирусы могут расти в клетках легких хлопковых крыс, такие как герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (BHV-1) (см. Papp Z. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2933-2943, например, p.2935), вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (bPI-3) (см. Breker-Klassen M.M. et al., J. Virol., 1995, 69 (7), 4308-4315) и аденовирус свиней типа 3 (PAV-3) (см. заявку РСТ на патент WO-А3-99/53047). Однако в данных документах не описывается или не предлагается применение подобных клеток и вирусов, культивированных в них, для получения инактивированных, аттенуированных и субъединичных иммуногенных композиций или вакцин и их введение животным, и способы иммунизации или вакцинации.

Изобретение также включает клетки легких хлопковых крыс или клеточную линию, депонированную в АТСС как РТА-3930, или клетки легких хлопковых крыс, или клеточную линию, обладающую всеми отличительными свойствами АТСС РТА-3930, или клетки легких хлопковых крыс, или клеточную линию, полученную культивированием клеток легких хлопковых крыс, по меньшей мере, в течение 10, или 21, или 76 пассажей, например, 10 или более, или 21 или более, или 76, или более пассажей, например, по меньшей мере, в течение 10 или 21, или 76 пассажей и предпочтительно до и включая 100 пассажей и получение такой клеточной линии, в которой клетки легких хлопковых крыс, в основном, являются эпителиальными клетками, и морфологические характеристики сохраняются при пассажах.

Преимущественно настоящее изобретение включает применение клеток легких хлопковых крыс (клеток CRL), например, клеточных линий, полученных из данных клеток, для размножения вирулентного или аттенуированного вируса PRRS.

Преимущественно настоящее изобретение также включает применение клеток CRL, например, клеток или клеточных линий, полученных из данных клеток, таких как клетки или клеточные линии по изобретению (например, депонированные клеточные линии или клетки, обладающие их свойствами), для размножения микроорганизмов или патогенов, таких как вирусы, например, вирулентные или аттенуированные вирусы, такие как CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV, BCV.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования или размножения вируса, такого как PRRSV, CPI-2, CAV-2, PAV-5, EHV-1, EHV-4, BRV, BCV, LDV, EAV, SHFV, вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов, торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота, включающий контактирование вируса с клетками легких хлопковых крыс в условиях, подходящих для культивирования или размножения. Способ может дополнительно включать сбор полученного вируса. Для получения иммуногенной или иммунологической, или вакцинной композиции вирус необязательно можно инактивировать и/или он может включать белок(белки) или антиген(ы), или эпитоп(ы), выделенные из них (для инактивированных или субъединичных композиций), и вирус или субъединицу можно смешать с подходящим носителем или разбавителем, и/или адъювантом, например, подходящим для ветеринарии или фармацевтически приемлемым носителем, или разбавителем, и/или адъювантом.

Термины «иммуногенная композиция» и «иммунологическая композиция», и «иммуногенная или иммунологическая композиция» включают любую композицию, которая вызывает иммунный ответ против патогена-мишени; например, после введения или инъекции животному (такому, как свинья) стимулируется иммунный ответ против патогена-мишени (например, PRRS). Термины «вакцинная композиция» и «вакцина», и «вакцинная композиция» включают любую композицию, которая индуцирует защитный иммунный ответ против патогена-мишени или которая эффективно защищает от патогена; например, после введения или инъекции животному (например, свинье) развивается защитная иммунная реакция против патогена-мишени или обеспечивается эффективная защита от патогена (например, PRRS). Субъединица патогена, например вируса, представляет собой антиген или иммуноген, или эпитоп, выделенные из патогена, например вируса; и субъединичная композиция включает или состоит в основном из одного или более антигенов, иммуногенов или эпитопов, выделенных из патогена, например вируса.

Настоящее изобретение также обеспечивает культуры микроорганизма или патогена, например вируса, такого вируса, для которого обычно грызуны или крысы, или хлопковые крысы, или клетки легких хлопковых крыс не являются естественными хозяевами, например, такого, как PRRSV, LDV, EAV, SHFV, вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов, торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота, CPI-2, CAV-2, PAV-5, EHV-1, EHV-4, BRV или BCV, преимущественно вирус PRRS, CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV или BCV, полученных в результате культивирования или размножения в клетках легких хлопковых крыс или клетках, или клеточной линии по изобретению, например, инактивированные, аттенуированные и субъединичные культуры или препараты.

Подобные культуры отличаются от предшествующих культур, поскольку они могут не содержать загрязняющих веществ из культур, полученных в других клетках, и могут иметь другие титры по сравнению с культурами, полученными в других клетках. Например, если вновь вернуться к вирусу PRRS, полученному в свиных клетках, то данные культуры содержат загрязняющие вещества из свиных клеток, в то время как PRRSV, культивированный в клетках CRL, не содержит загрязняющих веществ, обнаруживаемых в свиных клетках. Данный анализ можно распространить на культуры PRRSV и других вирусов, культивированных в других клетках, которые использовались для размножения PRRSV и других вирусов, по сравнению с культурами вирусов, полученными в клетках CRL по настоящему изобретению, в результате чего становится очевидным, что культуры по настоящему изобретению отличаются от культур предшествующего уровня техники.

Настоящее изобретение также включает иммуногенные композиции и вакцины против PRRS или против PRRSV, которые можно получить из культуры вируса PRRS по изобретению, преимущественно живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины и субъединичные иммуногенные композиции и вакцины.

Настоящее изобретение также включает иммуногенные композиции и вакцины против других патогенов или микроорганизмов, культивированных и размноженных в клетках CRL или клеточной линии, или клетках по изобретению, например, живые, аттенуированные, инактивированные или субъединичные композиции или вакцины. Данные иммуногенные композиции или вакцины могут быть против любого микроорганизма или патогена, или вируса, выращенного, культивированного, размноженного или тому подобное, в клетках CRL или клеточной линии, или клетках по изобретению, например, это иммуногенные или вакцинные композиции против любого из упомянутых здесь вирусов или микроорганизмов, или патогенов, таких как CPI-2, CAV-2, ВHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV.

Изобретение включает наборы, содержащие клетки и вирус, или микроорганизм, или патоген для культивирования в них, предпочтительно в отдельных контейнерах и еще более предпочтительно, когда отдельные контейнеры находятся в одной упаковке, и набор необязательно содержит инструкции для культивирования, выращивания, содержания клеток и/или вируса с инструкциями, необязательно включающими инструкции для сбора и/или инактивации вируса, и/или выделения субъединичного антигена или иммуногена, или эпитопа.

Изобретение дополнительно включает комбинированные композиции, например, композиции, содержащие одну или более вакцин, или иммуногенных композиций по изобретению, или вакцину, или иммуногенную композицию по изобретению в комбинации с другой вакцинной или иммунногенной композицией, или активным компонентом (например, инактивированным или аттенуированным вирусом, или патогеном, или микроорганизмом, или их субъединичным антигеном, или иммуногеном, или белком, или эпитопом).

Таким образом, изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины против заболевания свиней, содержащие смесь культур вирусов PRRS и PAV-3 по изобретению, такие как живые, аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины, или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины. PAV-3 может также представлять собой рекомбинантный PAV-3, который содержит одну или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие и экспрессирующие один или более чужеродный или гетерологичный, или экзогенный иммуноген(ы), антиген(ы) или эпитоп(ы) (чужеродный, гетерологичный или экзогенный по отношению к аденовирусу). В заявках WO 99/53047, WO 99/08706, WO 01/83737 и WO 00/47756 приводятся примеры рекомбинантных аденовирусов свиней, которые можно использовать в практике изобретения.

Другим примером является то, что изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины против заболевания собак, содержащие смесь культур вирусов CPI-2 и CAV-2 по изобретению, такие как живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины. CAV-2 также может представлять собой рекомбинантный СAV-2, который содержит одну или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие и экспрессирующие один или более чужеродный или гетерологичный, или экзогенный иммуноген(ы), антиген(ы) или эпитоп(ы) (чужеродный, гетерологичный или экзогенный по отношению к аденовирусу). В патенте США №6090393 приводятся примеры аденовирусов собак, которые можно использовать в практике изобретения.

Дополнительным примером является то, что изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины против заболевания крупного рогатого скота, содержащие смесь, по меньшей мере, двух или, по меньшей мере, трех, или всех четырех вирусных культур по изобретению, включая BHV-1, BRV, bPI-3 и/или BCV, например, BHV-1+BRV, BHV-1+BRV+bPI-3, BHV-1+BRV+bPI-3+BCV, BRV+bPI-3, BRV+bPI-3+BCV, bPI-3+BCV, BHV+bP-3, BHV+bPI-3+BCV, BHV-1+BCV, BRV+BCV, такие как живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины, или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины. Иммуногенные композиции и вакцины против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащие смесь, по меньшей мере, двух культур вирусов по изобретению, включая BHV-1 и bPI-3, и иммуногенные композиции и вакцины против кишечного заболевания крупного рогатого скота, содержащие смесь, по меньшей мере, двух культур вирусов по изобретению, включая BCV и BRV, являются предпочтительными.

Еще одним дополнительным примером комбинированных композиций по изобретению являются иммуногенные композиции и вакцины против заболевания лошадей, содержащие смесь культур вирусов EHV-1 и EHV-4 по изобретению, такие как живые аттенуированные иммуногенные композиции и вакцины, инактивированные иммуногенные композиции и вакцины, или субъединичные иммуногенные композиции и вакцины.

Изобретение включает получение подобных комбинированных композиций, например, смешением активных компонентов, преимущественно вместе с носителем или разбавителем, и/или адъювантом.

Изобретение также включает набор для получения комбинированных иммуногенных и вакцинных композиций по изобретению, например, набор, содержащий (а) микроорганизм, патоген или вирус, или их антиген, или эпитоп (предпочтительно вирус, упомянутый здесь) и (b) микроорганизм, патоген или вирус, или их антиген, или эпитоп (преимущественно вирус или его иммуноген, антиген или эпитоп, но также включаются другие микроорганизмы, упомянутые здесь), который отличается от (а), в отдельных контейнерах, необязательно в одной упаковке и необязательно с инструкциями для смешивания и/или введения.

Изобретение дополнительно включает способы индукции иммунного ответа введением хозяину, такому как хозяину, предрасположенному к заболеванию, вызываемого патогеном или микроорганизмом, или вирусом, полученным в клетках легких хлопковых крыс или клеточной линии, например, клетках легких хлопковых крыс или клеточной линии по изобретению, например, вирусом, упомянутым здесь, иммуногенной или вакцинной композиции по изобретению, содержащей подобный инактивированный, или аттенуированный патоген или микроорганизм, или вирус, или их антиген, или иммуноген, или эпитоп в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы иммунизации или вакцинации, или индукции иммунного ответа против заболевания PRRS или против вируса с использованием иммуногенной композиции и/или вакцины по изобретению, например, введением иммуногенной или вакцинной композиции хозяину, например, свинье, в количестве, достаточном для индукции соответствующего иммунного ответа. И изобретение дополнительно обеспечивает способы иммунизации или вакцинации, или индукции иммунного ответа против заболевания CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV, или против вирусов, с использованием иммуногенной композиции и/или вакцины по изобретению, введением иммуногенной или вакцинной композиции хозяину, например, естественному хозяину вируса, в количестве, достаточном для индукции соответствующего иммунного ответа.

Настоящее изобретение, например, когда используются смешанные или комбинированные композиции, включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у животного-хозяина против двух или более различных антигенов, эпитопов или патогенов, или микроорганизмов, или вирусов, такого как у свиньи, против PRRS и PAV-3, включающие введение эффективного количества для стимуляции ответа на иммунную композицию(и) и/или вакцину(ы) по изобретению. (Множественное число используют, поскольку способ можно также осуществлять на практике последовательным введением композиций или вакцин по изобретению.) Аналогичным образом в качестве дополнительного примера изобретение включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у собаки против заболевания CPI-2 и CAV-2 или против вирусов, с использованием или введением эффективного количества иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. Аналогично изобретение обеспечивает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота, по меньшей мере, против двух или, по меньшей мере, трех, или, по меньшей мере, четырех заболеваний крупного рогатого скота или против вирусов с использованием или введением эффективного количества иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. Дополнительно изобретение включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота против заболевания BHV-1 и bPI-3 или против вирусов, с использованием или введением иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. Изобретение также включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота против заболевания BCV и BRV или против вирусов, с использованием или введением эффективного количества иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению. И изобретение включает способы иммунизации или вакцинации, или стимуляции иммунного ответа у лошадей против заболевания EHV-1 и ЕHV-4 или против вирусов с использованием или введением иммуногенной композиции(й) и/или вакцины(н) по изобретению.

Необходимо отметить, что в данном описании и, в частности, в формуле изобретения термины, такие как «содержит», «содержащийся», «содержащий» и тому подобное могут иметь значение, относящееся к таковому в патентном законе США, например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное, и термины, такие как «в основном состоящий из» и «состоит в основном из» имеют значения, определенные в патентном законе США, например, они позволяют неточно цитировать элементы, но исключают элементы, которые имеются в предшествующем уровне техники или влияют на основные или новые свойства изобретения.

Эти и другие воплощения раскрыты здесь или являются очевидными из сути следующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

Заявители разработали способ получения или размножения вирусов, в котором используются клетки легких хлопковых крыс, а также новую клеточную линию, и способ размножения или получения, или культивирования, или выращивания микроорганизмов, или патогенов, или вирусов в подобных клетках.

Легкие извлекают из хлопковых крыс и подвергают ферментативному расщеплению (например, под действием трипсина и/или коллагеназы). Собирают супернатант, содержащий разделенные клетки, и культивируют, например, в виде монослоя или в суспензии. Предпочтительно клетки культивируют в виде монослоя, например, на минимальной поддерживающей среде (МЕМ) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (FBS) и/или лактальбумина гидрозилата (LAH). Преимущественно культуральная среда может содержать антибиотики, например, гентамицин, стрептомицин и/или пенициллин.

Вирус PRRS культивируют в подобной культуре клеток легких. Вирусы PAV-3, CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV также можно культивировать в подобной культуре клеток легких.

Клеточную культуру предпочтительно получают в результате нескольких пассажей данных клеток. Преимущественно в результате пассажей данных клеток можно получить клеточные линии, которые пригодны, например, для размножения вируса PRRS. Например, клетки можно подвергнуть, по меньшей мере, 10 пассажам, например, от 10 до 100 пассажей. Предпочтительно данные клеточные линии длительно сохраняют жизнеспособность при отсутствии фетальной телячьей сыворотки (FВS), хотя для получения монослоя необходимо некоторое количество FBS или другого подходящего фактора роста клеток.

Другим преимуществом культуры клеток CRL по настоящему изобретению является то, что культура клеток может существовать, по меньшей мере, в течение месяца в виде жизнеспособного монослоя или суспензии без необходимости в замещении израсходованной среды или дополнительном добавлении питательных веществ. Эта прочность обеспечивает преимущество многократного получения вируса из одной и той же культуры клеток без необходимости в стартовом периоде (приживании культуры) и без истощения маточной культуры клеток.

Таким образом, можно получать высокий выход вируса из одной и той же клеточной культуры. В одном воплощении процесс культивирования включает два или более сбора вируса с или без повторного посева вируса и/или добавления свежей культуральной среды. Предпочтительно, чтобы после каждого сбора в клеточную культуру добавляли свежую культуральную среду.

Следуя данному способу, клетки легких хлопковых крыс культивируют до 76 пассажей и получают в виде клеточной линии. Данные клетки легких хлопковых крыс в основном представляют собой эпителиальные клетки, и их морфологические характеристики сохраняются во время пассажей. Пассаж 21 был депонирован 18 декабря 2001 г. по условиям Будапештского соглашения в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, под инвентарным номером АТСС РТА-3930.

При воплощении настоящее изобретение включает применение эпителиальных клеток легких хлопковых крыс, линий эпителиальных клеток, полученных из них, таких как клеточная линия РТА-3930, или клеточная линия, обладающая ее отличительными свойствами, для получения вирулентного или аттенуированного вируса PRRS. В дополнительных воплощениях настоящее изобретение включает применение эпителиальных клеток легких хлопковых крыс, линий эпителиальных клеток, полученных из них, таких как клеточная линия РТА-3930 или клеточная линия, обладающая ее отличительными свойствами, для получения вирулентного или аттенуированного вируса CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV или BCV. В дополнительных воплощениях настоящее изобретение включает применение клеточной линии РТА-3930 или клеточной линии, обладающей ее отличительными свойствами, для получения вирулентного или аттенуированного вируса BHV-1 или bPI-3. Клеточную линию или клеточную линию, обладающую ее отличительными свойствами, можно также использовать в отношении других упомянутых здесь вирусов.

Таким образом, другим аспектом изобретения является способ получения вируса PRRS, включающий культивирование вируса PRRS в культуре клеток легких хлопковых крыс, содержащей эпителиальные клетки, предпочтительно в линии клеток легких хлопковых крыс. Например, вирус получают в клеточной линии РТА-3930 или клеточной линии, имеющей ее отличительные свойства. Данный способ получения вирусов можно также использовать в отношении вирусов CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV, а также других упомянутых здесь вирусов.

Вирус может представлять собой вирулентный вирус или аттенуированный вирус.

Получение вируса включает стадии посева и культивирования вируса на данных клетках. Перед посевом клетки по изобретению можно подрастить в подходящей культуральной среде, например среде МЕМ с добавлением FBS или другого подходящего фактора роста клеток. Культивирование клеток предпочтительно проводят при температуре в пределах от 35 до 39°С, предпочтительно примерно при 37°С. Преимущественно клеточная культура является монослоем. Альтернативно клеточная культура представляет собой суспензию. В основном вирус высевают, когда клетки в монослое выращены до слияния. Внеклеточный вирус можно непосредственно выделить из супернатанта. Внутриклеточный вирус можно выделить после соответствующего разрушения клеток, например, замораживанием/оттаиванием или обработкой ультразвуком. В случае клеточных культур в суспензии вирус можно выделить, например, после фильтрования фильтрата. Вирус можно выделить через 2-15 суток, например, через 3-7 суток, более предпочтительно через 5-7 суток после посева. Выделение вируса проводят способами, хорошо известными специалистам в данной области, касающимися получения вирусов. На данной стадии получают неочищенную вирусную культуру.

В культуральную среду, используемую в данном изобретении, можно добавить антибиотики.

Если необходимо, вирус, например вирус PRRS, адаптируют к росту в клетках по изобретению. Адаптацию можно проводить совместным культивированием в клетках по изобретению и клетках почек обезьян, таких как МА-104. Как это хорошо известно, адаптацию проводят серийными пассажами в сокультурах при постепенном увеличении количества клеток по изобретению. Данную адаптацию также можно проводить для вирусов CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 или BCV, а также других упомянутых здесь вирусов.

Неочищенную культуру можно сконцентрировать и/или очистить.

Концентрирование можно проводить любым обычным способом, известным специалистам в данной области, например избирательным осаждением или ультрафильтрацией. Очистку можно проводить любым обычным способом, известным специалистам в данной области, например ультрацентрифугированием или хроматографическими методами, например гель-фильтрацией. На данной стадии получают концентрированные вирусные культуры, очищенные культуры или концентрированные и очищенные культуры.

В другом аспекте изобретения вирусные культуры по изобретению (неочищенные, концентрированные, очищенные или концентрированные и очищенные) можно инактивировать с использованием любого обычного метода, например, термического и/или химического метода. Преимущественным методом является химическая инактивация, например, с использованием бета-пропиолактона, формалина, этиленимина или его производного, такого как бинарный этиленимин (BEI), и комбинаций данных инактивирующих соединений. На данной стадии получают инактивированные вирусные культуры PRRS.

В другом аспекте изобретения из вируса, находящегося в вирусных культурах по изобретению (неочищенных, концентрированных, очищенных или концентрированных и очищенных, необязательно инактивированных), можно экстрагировать иммуногенные фракции, такие как гликопротеины или белки. Экстракцию иммуногенных фракций вируса проводят способами, известными специалистам в данной области. На данной стадии получают субъединичные вирусные препараты.

Таким образом, другими аспектами изобретения являются описанные здесь вирусные неочищенные культуры, концентрированные культуры, очищенные культуры, концентрированные и очищенные культуры, инактивированные культуры, субъединичные препараты.

В предпочтительном воплощении изобретения вирулентный вирус можно аттенуировать проведением достаточного количества пассажей клеток по изобретению. Специалист в данной области может определить обычным экспериментированием число пассажей, необходимое для аттенуирования вируса. Получают препарат аттенуированного вируса.

Целью данного изобретения также является обеспечение иммуногенных композиций и вакцин для профилактики заражения вирусом. Данные иммуногенные композиции или вакцины содержат, по меньшей мере, одну культуру или препарат, описанные здесь.

Термин «иммуногенная композиция» включает в данном случае любую композицию, способную, при введении животному, например свинье, стимулировать иммунный ответ против вируса или антигена, или иммуногена, или эпитопа. Термин «вакцина» включает в данном случае любую композицию, способную, при введении животному, например свинье, стимулировать защитный иммунный ответ против вируса, или эффективно защищать животное от указанного вируса.

Иммуногенные композиции или вакцины по изобретению могут включать вирусную культуру или препарат, или антиген, или иммуноген, или эпитоп вируса и, по меньшей мере, один иммуноген, антиген, или эпитоп другого патогенна, или другой патоген (например, инактивированный или аттенуированный патоген). Подобный иммуноген, антиген или эпитоп может быть, например, бактериального, или паразитарного, или вирусного происхождения, либо представлять собой инактивированную или аттенуированную форму патогена. Изобретение также включает наборы для получения данных комбинированных композиций, а также способы получения данных комбинированных композиций и применение компонентов данных комбинированных композиций для получения комбинированных композиций. Следовательно, изобретение включает набор для получения комбинированных иммуногенных или вакцинных композиций по изобретению, например набор, который содержит: (а) микроорганизм, патоген или вирус, или его антиген, или эпитоп (преимущественно вирус, упомянутый здесь) и (b) микроорганизм, патоген или вирус, или его антиген, или эпитоп (преимущественно вирус или его иммуноген, антиген, или эпитоп, но также включаются другие патогены, упомянутые здесь), который отличается от (а), в отдельных контейнерах, необязательно в одной и той же упаковке и необязательно с инструкциями для смешивания и/или введения.

Иммуногенные композиции и/или вакцины по изобретению могут включать культуру или препарат вируса PRRS (например, инактивированный или аттенуированный PRRSV, или его иммуноген, или антиген, или эпитоп) и, по меньшей мере, один иммуноген, антиген или эпитоп другого патогена свиней (включая, без ограничений, патоген в инактивированной или аттенуированной форме). Данный патоген можно выбрать из группы, включающей, но не ограничиваясь этим, вирус псевдобешенства, вирус гриппа свиней, парвовирус свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита (коронавирус), цирковирус свиней, такой как цирковирус свиней типа 2, ротавирус, аденовирус свиней типа 3, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Clostridium spp., Salmonella spp., Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae и Actinobacillus pleuropneumoniae.

Преимущественно иммуногенные композиции и вакцины по изобретению могут включать культуру или препарат вируса PRRS и вируса PAV-3, выращенных и размноженных в клетках или клеточных линиях по изобретению, например, на клеточной линии РТА-3930 или клеточной линии, обладающей всеми ее отличительными свойствами. Иммуногены патогенов свиней могут включать вирус псевдобешенства gB, вирус псевдобешенства gC, вирус псевдобешенства gD, вирус гриппа свиней HA, вирус гриппа свиней NA, вирус гриппа свиней NР, ORF4 вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, ORF7 вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, ORF5 PRRSV, PRRSV ORF3, PRRSV ORF6, открытые рамки считывания PRRSV 5 (ORF5) и 6 (ORF6), открытые рамки считывания PRRSV 5 (ORF5) и 3 (ORF3), и 6 (ORF6), вирус холеры свиней E1, ген вируса холеры свиней E2, парвовирус VP2, ORF1 цирковируса свиней типа 2 или ORF2 цирковируса свиней типа 2. В отношении иммуногенов свиных патогенов, молекул нуклеиновых кислот, кодирующих их, и конструкций, экспрессирующих их, следует обращаться к патентам США №6517843, 6497883, 6391314, 6379676, 6217883, 6207165 и публикации патента США №2003003112 и заявкам на патент WO 99/53047, WO 99/08706, WO 01/83737 и WO 00/47756. Таким образом, изобретение также включает способы получения данных композиций, а также наборы для этого.

Иммуногенные композиции и вакцины по изобретению могут включать культуру или препарат вирусов CPI-2 и/или CAV-2 (например, инактивированный или аттенуированный CPI-2 и/или CAV-2, или их иммуноген, или антиген, или эпитоп) и, по меньшей мере, один иммуноген, антиген или эпитоп другого патогена собак (включая, но не ограничиваясь этим, патоген в инактивированной или аттенуированной форме). Данный патоген можно выбрать из группы, включающей, но не ограничиваясь этим, вирус чумы собак, парвовирус собак, коронаровирус собак, герпесвирус собак, возбудитель болезни Лайма, Borrelia burgdorferi и вирус бешенства. Преимущественно иммуногенные композиции и вакцины по изобретению включают культуру или препарат вируса CPI-2 и/или культуру или препарат вируса CAV-2 по изобретению. Иммуногенами CPI-2 могут быть CPI-2 F и/или HN. См. также патенты США №5616326, 6090393, 6159477, 6228846 в отношении иммуногенов патогенов собак и нуклеиновокислотных молекул, кодирующих их, и конструкций, экспрессирующих их. Таким образом, изобретение также включает способы получения данных композиций, а также наборы для этого.

Иммуногенные композиции и вакцины по изобретению могут включать культуру или препарат вирусов BHV-1, BRV, bPI-3 и/или BCV (например, инактивированные или аттенуированные BHV-1, BRV, bPI-3 и/или BCV, или их иммуноген, или антиген, или эпитоп) и, по меньшей мере, один иммуноген, антиген или эпитоп другого патогена крупного рогатого скота (включая, но не ограничиваясь этим, патоген в инактивированной или аттенуированной форме). Данный патоген можно выбрать из группы, включающей, но не ограничиваясь этим, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и вирус диареи крупного рогатого скота. Преимущественно иммуногенные композиции и вакцины по изобретению включают, по меньшей мере, две вирусные культуры или препарата по изобретению, включающих BHV-1, BRV, bPI-3 и/или BCV. Иммуногенами BRSV могут быть BRSV F или G, или N, такие как BRSV F и/или G, или N, и/или G. Иммуногенами BHV-1 могут быть gB и/или gC, и/или gD. Иммуногенами BVDV может быть белок Е0 (gp48) и/или белок Е2 (gp53). BVDV может быть типа 1 и/или типа 2. Иммуногены bPI-3 могут представлять собой bPI-3 F и/или HN. В отношении иммуногенов патогенов крупного рогатого скота и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих их, и конструкций, экспрессирующих их, см. патенты США №6451770, 6376473, 6224878. Таким образом, изобретение включает способы получения данных композиций, а также наборы для этого.

Иммуногенные композиции и вакцины по изобретению могут включать культуру или препарат вирусов EHV-1 и/или EHV-4 (например, инактивированные или аттенуированные EHV-1 и/или EHV-4, или их иммуноген, антиген или эпитоп), и, по меньшей мере, один иммуноген, антиген или эпитоп другого патогена лошадей (включая, но не ограничиваясь этим, патоген в инактивированной или аттенуированной форме). Данный патоген можно выбрать из группы, включающей, но не ограничиваясь этим, вирус гриппа лошадей, вирус восточного энцефаломиелита (EEV), вирус западного энцефаломиелита (WEV), вирус венесуэльского энцефаломиелита (VEV), возбудитель болезни Лайма, Borrelia burgdorferi, Clostridium tetani, вирус артериита лошадей (EAV) и вирус бешенства. Предпочтительно иммуногенные композиции и вакцины по изобретению могут включать культуру или препарат вируса EHV-1 и культуру или препарат вируса EHV-4 по изобретению. Гликопротеинами EHV могут быть gB, gD, gB+gD, gC и gЕ. В отношении иммуногенов патогенов лошадей и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих их, и конструкций, экспрессирующих их, следует обращаться к патентам США №6207166 и 6368603. Таким образом, изобретение также включает способы получения данных композиций, а также наборы для этого.

Иммуногенная композиция или вакцина по изобретению, которая также включает подобный дополнительный иммуногенный компонент (дополнительный иммуноген, антиген или эпитоп), имеет то преимущество, что она индуцирует иммунный ответ или защиту против нескольких инфекций или заболеваний, или их возбудителей одновременно. Данный дополнительный иммунногенный компонент может представлять собой аттенуированный или инактивированный микроорганизм, рекомбинантную конструкцию или субъединицы (например, белки, гликопротеины, полипептиды или эпитопы). В практике изобретения можно использовать способы определения эпитопов, такие как получение перекрывающихся библиотек пептидов (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168; Pepscan (Geysen H.M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen H.M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19 (1), 43-47; Geysen H.M., Southeast Asian J. Trop.Med. Public. Health, 1990, 21 (4), 523-533; Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561) для определения эпитопов иммуногенов, антигенов, полипептидов, гликопротеинов и тому подобное, без излишнего экспериментирования. С помощью данной информации можно сконструировать нуклеиновокислотные молекулы, кодирующие подобный эпитоп и с использованием этих конкретных данных и сведений в данной области можно сконструировать векторы или конструкции, например рекомбинантные вирусы или векторы, или плазмиды, экспрессирующие иммуногены, эпитопы или антигены, без излишнего экспериментирования.

Иммуногенные композиции или вакцинные композиции дополнительно включают фармацевтически приемлемый или приемлемый для ветеринарии эксципиент, разбавитель или растворитель и необязательно стабилизатор и/или адъювант. Подходящие лекарственные формы хорошо известны специалистам в данной области. Лекарственные формы можно разработать для любого соответствующего пути введения.

Фармацевтически приемлемым растворителем может быть вода или физиологический раствор.

Инактивированные иммуногенные композиции или инактивированные вакцины предпочтительно включают, по меньшей мере, один адъювант.

Живые аттенуированные вирусы могут быть лиофилизированными, предпочтительно со стабилизатором. Лиофилизацию можно проводить хорошо известными обычными способами лиофильной сушки. Фармацевтически приемлемыми стабилизаторами может быть SPGA (сахароза-фосфат-глутамат-альбумин) (Bovarnik et al., J. Bacteriology, 1950, 59: 509), углеводороды (например, сорбит, маннит, лактоза, сахароза, глюкоза, декстран, трегалоза), глутамат натрия (Tsvetkov T. et al., Cryobiology 1983, 20 (3): 318-23; Israeli E. et al., Cryobiology 1993, 30 (5): 519-23), белки, такие как пептон, альбумин или казеин, белоксодержащие агенты, такие как сепарированное молоко (Mills C.K. et al., Cryobiology 1988, 25 (2): 148-52; Wolff E. et al., Cryobiology 1990, 27 (5): 569-75) и буферы (например, фосфатный буфер, буфер на основе фосфата щелочного металла).

Адъювант можно использовать для того, чтобы сделать растворимыми лиофилизированные препараты.

Примерами адъювантов являются эмульсии масло-в-воде, вода-в-масле-в-воде на основе минерального масла и/или растительного масла и неионогенных поверхностно-активных веществ, таких как блок-сополимеры, Tween®, Span®. Другими подходящими адъювантами являются витамин Е, сапонины, Carboрol®, гидроокись алюминия, фосфат алюминия или окись аммония (“Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach”, Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, 1995, Plenum Press New York). В документах, цитированных здесь, также можно получить сведения по адъювантам, а также по эксципиентам, разбавителям, носителям и растворителям.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ иммунизации или способ вакцинации с использованием соответственно иммуногенных композиций или вакцинных композиций по изобретению.

Способ включает, по меньшей мере, одно введение животному эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по изобретению. Животное может быть самцом, самкой, беременной самкой и новорожденным. Данное введение можно особенно проводить внутримышечной (в/м), внутрикожной (в/к) или подкожной (п/к) инъекцией или интраназально, или орально. Иммуногенную композицию или вакцину по настоящему изобретению можно вводить с помощью шприца или безыгольного инъектора (такого как, например, Pigjet или Biojector (Bioject, Oregon, США)).

Для аттенуированных композиций дозы вируса или микроорганизма, или патогена, полученных в новой клеточной культуре, могут находиться в пределах примерно от

10³ до примерно 10⁷ CCID₅₀ (средние инфекционные дозы для клеточной культуры), предпочтительно в пределах примерно от 10⁴ до примерно 10⁶ CCID₅₀, и более предпочтительно они могут составлять 10⁵ CCID₅₀. Объемы для введения составляют 0,2-2,0 мл, предпочтительно примерно 2,0 мл. Можно проводить одно или более введений, например, две инъекции с интервалом 2-4 недели, и предпочтительно с бустер-иммунизацией примерно через 3 недели после первой инъекции.

Для инактивированных композиций вируса или микроорганизма, или патогена, полученных на новой клеточной культуре, животному можно ввести примерно 10⁴-10⁹ эквивалентных CCID₅₀ (титр перед инактивацией), предпочтительно примерно 10⁵-10⁸ эквивалентных CCID₅₀ в разовой лекарственной форме. Объем одной разовой лекарственной формы может находиться в пределах от 0,2 до 5,0 мл, и предпочтительно находится в пределах от 0,5 до 2,0 мл, и более предпочтительно составляет примерно 2,0 мл. Можно проводить одно или более введений, например, две инъекции с интервалом 2-4 недели, и предпочтительно с бустер-иммунизацией примерно через 3 недели после первой инъекции.

Для субъединичных композиций, например, из вируса или патогена, или микроорганизма, полученных на новой клеточной культуре, животному можно вводить от 5 до 500 мкг, предпочтительно от 20 до 50 мкг. Объем для введения составляет от 0,2 до 2,0 мл, предпочтительно составляет примерно 2,0 мл. Можно проводить одно или более введений, например, две инъекции с интервалом 2-4 недели, и предпочтительно с бустер-иммунизацией примерно через 3 недели после первой инъекции.

Композиции по изобретению можно также вводить другим млекопитающим, например, мышам или лабораторным животным, например, для получения поликлональных антител или для получения гибридом для моноклональных антител.

Изобретение дополнительно будет описано с помощью последующих неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1: получение клеток легких хлопковых крыс (CRL)

Легкие, после извлечения из подвернутого эвтаназии животного, помещали в среду для культуры клеток, содержащую минимальную поддерживающую среду F-15 (MEM F-15, Hyclone, cat#SH30024.02) и гентамицин в концентрации 30 мкг/мл. В данную среду добавляли промышленно доступные антибиотики (пенициллин и стрептомицин) и фунгицид (амфотерцин В) в концентрации 2% об./об. Легкие обрабатывали ферментами при 37°С в конической центрифужной пробирке емкостью 50 мл, содержащей 25 мл раствора коллагеназы (Sigma, cat#L-0130) и трипсин (Sigma, cat#T-8003) в концентрации соответственно 1 мг/мл и жесткости 1Х (соответствует концентрации 2,5 мг/мл) в среде МЕМ F-15, содержащей гентамицин в концентрации 30 мкг/мл. Через 30 мин обработки добавляли фетальную телячью сыворотку (FBS) (Bio Whittaker) до конечной концентрации 10% об./об. После диспергирования клеток с использованием пипетки и осветления собирали супернатант, содержащий диассоциированные клетки, и высевали в матрасы размером 25 см² со средой МЕМ F-15, содержащей гентамицин в концентрации 30 мкг/мл и с добавлением FBS до конечной концентрации 10% об./об.

Пример 2: культивирование клеток CRL

Для удаления остаточного количества FBS со слившегося монослоя клеток CRL, полученных в примере 1, использовали раствор трипсина. Клетки, покрытые 0,1% (1Х) смесью свиной трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (JRH Biosciences, cat#62244-79P) (3 мл на 75 см², 5 мл на матрас размером 150 см²) помещали в термостат при 37°С и тщательно наблюдали до тех пор, пока не завершилось прикрепление клеток. Клетки диспергировали с использованием пипетки и собирали 3 мл клеточной суспензии. В это время 1:4 собранных клеток культивировали на свежей среде для клеточных культур, содержащей МЕМ F-15, гентамицин в концентрации 30 мкг/мл и FBS в концентрации 10% об./об.

Клетки CRL культивировали при 37°С в термостате с 5% СО₂. Доля 1:4 слитого монослоя сливалась примерно в течение 4 суток, а доля 1:8 давала слитый монослой примерно в течение 7 суток. Это составляет пассаж.

Затем клетки размножали от пассажа 2 до пассажа 76.

После добавления криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО) небольшие порции замораживали на всех пассажах вплоть до 76. Порции хранили в жидком азоте.

Клетки CRL из 21 пассажа депонировали в Американской коллекции типовых культур под инвентарным номером АТСС РТА-3930.

Пример 3: размножение вируса PRRS в клетках CRL

Использовали аттенуированный вирус PRRS, о котором известно, что он размножается в клетках почек обезьян.

Культивирование вируса PRRS проводили на монослое клеток CRL в матрасах размером 75 см² (матрас Т75) в 50 мл культуральной среды, содержащей МЕМ F-15, гентамицин в концентрации 30 мкг/мл и FBS в концентрации 10% об./об. Перед посевом вируса клетки инкубировали при 37°С в течение 24 ч пока они не сливались. После посева 1 мл вируса PRRS зараженные клетки инкубировали при 37°С в течение 5-7 суток. Рост вируса оценивали непрямой реакцией иммунофлуоресценции (IFA) и титрованием супернатанта. После замораживания/размораживания собирали супернатант. Данный материал представляет неочищенную культуру вируса PRRS.

Непрямая реакция иммунофлуоресценции (IFA)

Для проведения IFA клетки трипсинизировали, диспергировали, собирали и ресуспендировали в свежей среде МЕМ F-15, содержащей гентамицин (в концентрации 30 мкг/мл) и с добавлением FBS до концентрации 10% об./об. Клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей из расчета 100 мкл/лунку и культивировали в течение ночи до слияния. Готовили четырехкратные серийные разведения PRRS. Затем 100 мкл или 200 мкл разбавленного вируса вносили в каждую лунку в ряду 96-луночного планшета. Планшет помещали при 37°С в термостат с 5% СО₂ на 7 суток. Лунки, содержащие зараженные клетки CRL, определяли непрямой реакцией иммунофлуоресценции (IFA) с моноклональными антителами против вируса PRRS (SDOW 17, полученными от USDA; Magar R. et al., Can J. vet Res., 1995, 59 (3): 232-4).

Характеристика вируса PRRS, выросшего в культуре CRL

Вирус PRRS титровали в 96-луночном планшете, содержащем клетки CRL. Титр рассчитывали с использованием метода Спирмана-Кербера для определения 50% конечной точки и выражали в пересчете на мл. Результаты выражали в log₁₀ (FAID₅₀)/мл. Титр в итоге составлял 4,3 в log₁₀ (FAID₅₀)/мл.

Пример 4: адаптация вируса PRRS к росту на CRL и размножению

Вирус NADC 8 PRRS адаптировали к росту в клетках CRL. NADC 8 получали из Национального центра болезней животных (USDA).

Вирус последовательно размножали в совместных культурах клеток CRL и клеток МА-104 (клетки почек африканской зеленой мартышки, исходная клеточная линия MARC-145), содержащей постепенно снижающиеся количества клеток МА-104. Первоначально клетки CRL высевали в соотношении 1:9 с клетками МА-104 (20000 клеток CRL/мл: 180000 клеток МА-104/мл) при 37°С, МЕМ F-15 с гидрозилатом лактальбумина (LAH в концентрации 0,1% об./об.), гентамицином в концентрации 30 мкг/мл и FBS в концентрации 10% об./об. Когда данные совместные культуры сливались, высевали вирус PRRS (1 мл на матрас Т75) без какого-либо замещения среды. Рост вируса оценивали непрямой реакцией иммунофлуоресценции (IFA, как описано в примере 3) и титрованием супернатанта. Высеянные клетки инкубировали при 37°С в течение 5-7 суток. Пассаж включает замораживание/размораживание, сбор супернатанта и последующий посев 1 мл жизнеспособной совместной культуры в матрасе Т75, т.е. примерно 10% собранного супернатанта.

Данную процедуру повторяли пассажированием посевного материала на совместных культурах CRL:МА-104 в соотношениях соответственно 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4; 7:3, 8:2 и 9:1.

В конце вирус культивировали в матрасе Т75 в монослое, состоявшем только из клеток CRL, в 50 мл культуральной среды, содержащей МЕМ F-15, гентамицин в концентрации 30 мкг/мл и FBS в концентрации 10% об./об. (без LAH). Зараженные клетки CRL инкубировали при 37°С в течение 5-7 суток. После замораживания/размораживания собирали супернатант. Данный материал представляет неочищенную культуру вируса PRRS.

Данные IFA показывали, что NADC 8 заражал клетки CRL.

Характеристика вируса PRRS, выросшего в культуре CRL

Штамм NADC 8 вируса PRRS титровали в 96-луночном планшете, содержащем клетки CRL. Культивирование проводили, как описано выше. Титр рассчитывали с использованием метода Спирмана-Кербера при определении 50% конечной точки и выражали в пересчете на мл. Результаты выражали в log₁₀ (FAID₅₀)/мл.

Титр составлял 4,12 в log₁₀ (FAID₅₀)/мл.

Другие вирусы, такие как другие вирусы порядка Nidovirales, например артевирусы или вирусы семейства Arteriviridae, например вирус, повышающий активность лактатдегидрогеназы (LDV), вирус артериита лошадей (EAV), вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV), вирусы семейства Coronaviridae, например коронавирусы, такие как вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229F, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота, коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов, торовирусы, такие как торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота и другие вирусы, для которых грызуны или крысы, или хлопковые крысы не являются естественными хозяевами, можно адаптировать к росту в клетках легких хлопковых крыс, предпочтительно клетках легких хлопковых крыс или клеточной линии по изобретению (например, депонированных) с использованием способов, описанных здесь или способов, аналогичных описанным здесь для PRRS.

Пример 5: способ инактивации

Собирают вирус PRRS, выросший на CRL (пример 3 или 4). Вирусную суспензию обрабатывают ультразвуком при температуре примерно 5°С. Вирусную суспензию фильтруют через мембрану с размером пор 50-100 мкм примерно при 5°С.

В вирусную суспензию вносят бета-пропиолактон в конечной концентрации 1/3000 (об./об.). После гомогенизации перемешиванием суспензию переносят в другой стерильный матрас.

Инактивацию проводят при перемешивании в течение 24 ч, примерно при 5°С. Значение рН доводят примерно до 7,2 добавлением 1М NaOH.

Инактивированную вирусную суспензию концентрируют ультрафильтрацией примерно 50 раз. Концентрированную вирусную суспензию хранят при -40°С.

Пример 6: получение инактивированной вакцины в виде эмульсии на минеральном масле

Вакцину готовят с инактивированным вирусом PRRS, полученным в примере 5 (после размораживания и разбавления), со следующим составом:

суспензия инактивированного вируса PRRS 167 мл масляная фаза 83 мл

Масляная фаза состоит из 7% по массе (мас./об.) ангидроманнита олеата, 8% (мас./об.) этоксилированной олеиновой кислоты (11 этиленоксидов) и 85% (об./об.) светлого вазелинового масла (по Европейской фармакопее).

Водную фазу и масляную фазу стерилизуют по отдельности фильтрованием. Эмульсию готовят смешением и гомогенизацией ингредиентов с помощью турбинного эмульгатора Silverson.

Одна доза вакцины содержит примерно 10^7,5 CCID₅₀ (титр перед инактивацией). Объем одной дозы вакцины составляет 2,0 мл для введения внутримышечным путем.

Пример 7: размножение вирусов в клетках CRL

Штаммы вирусов, использованные в качестве стандартного (референсного) вируса, для которых имеются флуоресцирующие антитела (FA), титровали с использованием клеток CRL. Поскольку данные стандартные вирусы обычно титровали с использованием стандартных клеточных линий, каждый имеет известный титр с различной степенью вариации. Использовали десяти- или четырехкратные разведения данных стандартных вирусов для посева на клетки CRL в 96-луночных планшетах с использованием обычного метода титрования для каждого вируса. Через 7 суток инкубации планшеты фиксировали ацетоном и окрашивали соответствующими FA. Титры флуоресцентных-положительных культур сравнивали с титрами, полученными на стандартных клеточных культурах. Результаты представлены ниже (см. таблицу).

Стандартный вирус Титр/CRL Титр/стандартная клеточная линия Вирус парагриппа собак типа 2 (CPI-2) 4,96 5,6 в клетках МDСК Аденовирус собак типа 2 (CAV-2) 1,72 5,8 в клетках МDСК Герпесвирус крупного рогатого скота типа 1 (BHV-1) 3,64 7,1 в клетках МDВК Герпесвирус лошадей типа 1 (EHV-1) 5,74 Титр не определен Герпесвирус лошадей типа 4 (EHV-4) 5,44 6,13 в клетках Веро Ротавирус крупного рогатого скота (BRV) 5,32 6,0 в клетках МА-104 Вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (bPI-3) 6,46 7,0 в клетках МDВК Коронавирус крупного рогатого скота (BCV) 3,52 4,79 в клетках МDВК Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) 5,22 5,34 в клетках МАRC-145

Титры вирусов выражены в log₁₀ 50% инфекционной дозы для клеточных культур на миллилитр (log₁₀ CCID₅₀/мл).

Несмотря на то что в каждом случае титры вируса, полученного на CRL, были ниже по сравнению со стандартными клеточными линиями, необходимо подчеркнуть, что данные вирусы не прошли клеточную адаптацию при использовании клеток CRL, что имело место для стандартного вируса при использовании стандартной клеточной линии. В данном случае целью было только детектировать репликацию вируса. Другими словами, при определенных усилиях количество живого вируса, выросшего в клетках CRL, можно повысить до такой степени, что оно будет равным или выше чем количество вируса, выросшего на клеточных линиях, к которым он адаптирован. Это показано данными по адаптированию вируса PRRS к CRL (пример 4), когда титры одинакового серийного разведения этого вируса составляли соответственно 5,22 и 5,34 (log₁₀ CCID₅₀/мл) при использовании соответственно клеток CRL и клеток MARC-145 (чувствительный субклон клеток МА-104). Различие в значениях титра было незначительным.

Изобретение дополнительно описывается последующими пронумерованными положениями:

1. Способ получения вируса PRRS, где получают культуру клеток легких хлопковых крыс и культивируют вирус PRRS в данной клеточной культуре.

2. Способ по п.1, где клеточная культура включает эпителиальные клетки.

3. Способ получения вируса PRRS, где получают культуру клеток из линии клеток легких хлопковых крыс и культивируют вирус PRRS в данной культуре.

4. Способ по п.3, где культура включает эпителиальные клетки.

5. Способ получения вируса PRRS, где получают культуру эпителиальных клеток легких хлопковых крыс и культивируют вирус PRRS в данной клеточной культуре.

6. Способ получения вируса PRRS, где получают культуру клеток из линии эпителиальных клеток легких хлопковых крыс и культивируют вирус PRRS в данной клеточной линии.

7. Способ по п.п.3 или 6, где клеточная линия представляет клеточную линию, депонированную в АТСС под инвентарным номером РТА-3930 или линию клеток легких хлопковых крыс, обладающую всеми отличительными свойствами клеточной линии, депонированной в АТСС под инвентарным номером РТА-3930.

8. Способ по п.7, где клеточная линия представляет клеточную линию, депонированную в АТСС под инвентарным номером РТА-3930.

9. Способ по любому из п.п.1-8, где вирус PRRS представляет вирулентный вирус PRRS.

10. Способ по любому из п.п.1-8, где вирус PRRS представляет аттенуированный вирус PRRS.

11. Способ по любому из п.п.1-8, где вирус PRRS культивируют в клетках и получают неочищенную культуру вируса PRRS.

12. Способ по любому из п.п.1-8, где вирус PRRS культивируют в клетках, получают вирус, дающий неочищенную культуру вируса PRRS, и подвергают данную неочищенную культуру очистке с получением очищенной культуры вируса PRRS.

13. Способ по любому из п.п.1-8, где вирус PRRS культивируют в клетках, получают вирус, дающий неочищенную культуру вируса PRRS, и подвергают данную неочищенную культуру концентрированию с получением концентрированной культуры вируса PRRS.

14. Способ по любому из п.п.1-8, где вирус PRRS культивируют в клетках, получают вирус, дающий неочищенную культуру вируса PRRS, и подвергают данную неочищенную культуру концентрированию и очистке с получением концентрированной и очищенной культуры вируса PRRS.

15. Способ по п.11, где неочищенную культуру инактивируют.

16. Способ по п.12, где очищенную культуру инактивируют.

17. Способ по п.13, где концентрированную культуру инактивируют.

19. Способ по п.14, где концентрированную и очищенную культуру инактивируют.

20. Способ по п.п.15, 16, 17 или 18, где культуру инактивируют химическим агентом.

21. Способ по п.19, где химический агент выбран из группы, состоящей из бета-пропиолактона, формалина, этиленимина и бинарного этиленимина.

22. Способ по п.п.11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, где культуру обрабатывают для выделения субъединиц PRRS.

23. Способ по п.9, где вирус PRRS культивируют в клетках и выделяют аттенуированный вирус PRRS.

24. Вирус PRRS или культура вируса PRRS, полученные после культивирования вируса PRRS в клетках легких хлопковых крыс.

25. Вирус PRRS или культура вируса PRRS, полученные после культивирования вируса PRRS на линии клеток легких хлопковых крыс.

26. Вирус PRRS или культура вируса PRRS по п.п.23 или 24, где клетки являются эпителиальными клетками.

27. Вирус PRRS или культура вируса PRRS по п.п.23 или 24, где клетки включают эпителиальные клетки.

28. Вирус PRRS или культура вируса PRRS по п.25, где клеточная линия представляет собой клеточную линию, депонированную в АТСС под инвентарным номером РТА-3930, или линию клеток легких хлопковых крыс, обладающую всеми отличительными свойствами клеточной линии, депонированной в АТСС под инвентарным номером РТА-3930.

29. Вирус PRRS или культура вируса PRRS по п.25, где клеточная линия представляет собой клеточную линию, депонированную в АТСС под инвентарным номером РТА-3930.

30. Вирус PRRS или культура вируса PRRS, полученные путем осуществления способа по любому из п.п.1-20 или 22.

31. Вирус PRRS или культура вируса PRRS по любому из п.п.23-28, являющиеся инактивированными.

32. Вирус PRRS или культура вируса PRRS по любому из п.п.23-28, являющиеся аттенуированными.

33. Субъединичный препарат вируса PRRS, полученный путем осуществления способа по п.21.

34. Иммуногенная композиция, содержащая вирус PRRS или культуру вируса PRRS по любому из п.п.23-31, и приемлемый для ветеринарии эксципиент, разбавитель или растворитель.

35. Иммуногенная композиция, содержащая субъединичный препарат вируса PRRS по п.32 и приемлемый для ветеринарии экципиент, разбавитель или растворитель.

36. Иммуногенная композиция по п.33, дополнительно содержащая стабилизатор.

37. Иммуногенная композиция по п.п.33 или 34, или 35, дополнительно содержащая адъювант.

38. Иммуногенная композиция, содержащая культуру вируса PRRS, полученную способом по п.1.

39. Иммуногенная композиция, содержащая культуру вируса PRRS, полученную способом по п.3.

40. Иммуногенная композиция, содержащая культуру вируса PRRS, полученную способом по любому из п.п.1-22.

41. Вакцина, содержащая культуру вируса PRRS, полученную способом по п.1.

42. Вакцина, содержащая культуру вируса PRRS, полученную способом по п.3.

43. Вакцина, содержащая культуру вируса PRRS, полученную способом по любому из п.п.1-22.

44. Вакцина, содержащая вирус PRRS или культуру вируса PRRS по любому из п.п.23-31 и приемлемый для ветеринарии эксципиент, разбавитель или растворитель.

45. Вакцина, содержащая субъединичный препарат вируса PRRS по п.32 и приемлемый для ветеринарии экципиент, разбавитель или растворитель.

46. Вакцина по п.43, дополнительно содержащая стабилизатор.

47. Вакцина по п.п.43 или 44, или 45, дополнительно содержащая адъювант.

48. Способ иммунизации свиньи, включающий введение свинье иммунногенной композиции по любому из п.п.33-39.

49. Способ вакцинации свиньи, включающий введение свинье вакцины по любому из п.п.40-46.

50. Линия клеток легких хлопковых крыс, депонированная в АТСС под инвентарным номером РТА-3930, или линия клеток легких хлопковых крыс, обладающая всеми отличительными свойствами клеточной линии, депонированной в АТСС под инвентарным номером РТА-3930.

51. Линия клеток легких хлопковых крыс, депонированная в АТСС под инвентарным номером РТА-3930.

Таким образом, имея описанные подробно предпочтительные воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение, определенное вышеуказанными положениями, не ограничивается конкретными деталями в вышепредставленном описании, поскольку возможны его явные многочисленные вариации, без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложены способ получения вируса на клетках легких хлопковых крыс, а также линия клеток легких хлопковых крыс АТСС РТА-3930 для роста, размножения и культивирования вирусов. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения вируса, включающий:
I) культивирование клеток легких хлопковых крыс по меньшей мере в течение 10 пассажей с получением линии клеток хлопковых крыс;
II) инокуляцию клеточной линии вирусом;
III) размножение вируса в клетках; и
IV) выделение вируса.

2. Способ получения вируса по п.1, где клетки легких хлопковой крысы культивируют в течение по меньшей мере 21 пассажа.

3. Способ получения вируса по п.2, где клетки легких хлопковой крысы культивируют в течение по меньшей мере 76 пассажей.

4. Способ получения вируса по п.1, где линия клеток легких хлопковой крысы представляет собой АТСС РТА-3930.

5. Способ получения вируса по п.1, где вирус представляет собой вирус, повышающий активность лактатдегидрогеназы (LDV), вирус артериита лошадей (EAV), вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), вирус инфекционного бронхита, коронавирус собак, коронавирус кошек, коронавирус человека 229Е, вирус эпидемической диареи свиней, вирус инфекционного гастроэнтерита, вирус инфекционного гастроэнтерита свиней, респираторный вирус свиней, коронавирус крупного рогатого скота (BCV), коронавирус человека ОС43, вирус гепатита мышей, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус крыс, вирус сиалодакриоаденита, вирус инфекционного бронхита птиц, коронавирус индеек, коронавирус кроликов, торовирус лошадей, торовирус свиней, торовирус человека, торовирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа собак (CPI), аденовирус, герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), герпесвирус лошадей (EHV), ротавирус крупного рогатого скота (BRV) или вирус парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (bPI-3).

6. Способ по п.5, где вирус представляет собой PRRSV, CPI типа 2, аденовирус собак типа 2, аденовирус свиней типа 3, BHV-1, EHV-1, EHV-4, bPI-3, BRV или BCV.

7. Способ по п.6, где вирус представляет собой PRRSV.

8. Линия клеток легких хлопковых крыс, предназначенная для осуществления способа получения вируса по п.1, где линия клеток представляет собой линию клеток легких хлопковой крысы АТСС РТА-3930.