СПОСОБ ИММУНОРЕАБИЛИТАЦИИ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2010 года по МПК A61K33/00 A61K35/26 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам иммунореабилитации онкозаболеваний.

Заболеваемость злокачественными новообразования в последние десятилетия в России постоянно увеличивается и, как прогнозирует большинство специалистов, прирост числа онкологических больных в XXI веке будет постоянно возрастать. На современном этапе развития медицинской науки основными методами лечения рака по-прежнему остаются хирургия и химиолучевая терапия. Известно, что итогом подобного терапевтического подхода является развитие у больного иммуносупрессии, часто являющейся причиной постоперационных осложнений. В этой связи необходимость включения биотерапии как полноправного компонента комбинированного терапевтического подхода в онкологической практике к настоящему времени не вызывает сомнений у большинства специалистов. Использование этого метода в адъювантном режиме после радикальных операций, химио- и лучевого лечения позволяет продлить время безрецидивного периода жизни, улучшить качество жизни пациентов. Одним из основных и наиболее ценным в практическом отношении направлений биотерапии является активация клеточного звена противоопухолевого иммунитета. С этой целью применяют методы так называемой адоптивной (от «adoptive» - привнесенный) иммунотерапии. Суть этих методов заключается в активации иммунокомпетентных клеток вне организма (in vitro) под воздействием цитокинов. Как известно, основную роль в противоопухолевой защите играют натуральные киллеры (НК) и цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ). Для большинства опухолей не обнаружено специфических опухолевых антигенов, а многие из них не экспрессируют МНС, поэтому не могут быть распознаны ЦТЛ. НК относятся к системе неспецифического иммунитета и, в отличие от ЦТЛ, не нуждаются в экспрессии МHС и наличии антигенов для эффективного лизиса опухолевых клеток. Однако их количество в организме невелико, всего 10-15% от всех лимфоцитов крови, что не позволяет НК справиться со значительной опухолевой массой. Методы адоптивной иммунотерапии позволяют получить из суммарно малоактивных фракций мононуклеарных лимфоцитов крови больного значительное количество так называемых лимфокин-активированных киллеров (ЛАК). ЛАК вводят в организм пациента, где они оказывают выраженное противоопухолевое действие. ЛАК-иммунотерапия расширяет спектр возможностей противоопухолевой терапии. Помимо того, она имеет преимущества по сравнению с традиционными методами: отсутствие токсичности, удовлетворительная переносимость лечения, возможность применения совместно с другими традиционными методами лечения; в случаях лекарственной резистентности - стимуляция местного противоопухолевого клеточного иммунитета, приводящая к лизису опухоли, а также улучшение качества и продолжительности жизни пациентов. Метод ЛАК-терапии является универсальным, поскольку возможно его применение практически при любых нозологических формах злокачественных новообразований (меланома, рак легкого, рак яичников, рак желудка и т.д.). Эффективность применения ЛАК в терапии онкологических заболеваний является широко известным фактом. Имеются сведения о позитивном опыте применения ЛАК-терапии при лечении людей (детей и взрослых) с химиорезистентными распространенными злокачественными солидными опухолями. Однако проведенные клинические исследования показали, что наиболее эффективна адоптивная иммунотерапия у пациентов со злокачественными выпотами (опухолевыми плевритами, асцитами и перикардитами). По приведенным данным клиническая эффективность составила 88%. Следует отметить, что замедление или прекращение накопления жидкости наступало только в тех случаях, когда в плевральном выпоте отмечалось значительное количество активированных лимфоидных клеток. Исследование показало эффективность предложенного метода адоптивной иммунотерапии при асцитах у больных с диссеминированным раком яичников. При проведении ЛАК-терапии отмечались деградация и последующее исчезновение из злокачественного выпота опухолевых клеток на фоне повышения числа активированных лимфоидных элементов у 87% больных, а также снижение уровня онкомаркера (СА-125) у 50% и частичная регрессия опухоли у 13% пациенток. Установлено, что адоптивная иммунотерапия может оказывать нормализующее влияние на иммунный статус онкологических больных и способствовать регрессии опухолевых плевритов и асцитов даже при химиорезистентных формах рака яичников. Кроме того, в настоящее время адоптивная иммунотерапия с использованием ЛАК-клеток применяется главным образом для лечения так называемых иммуночувствительных форм злокачественных новообразований: меланомы и рака почки. К сожалению, наряду с терапевтическим эффектом авторы иногда отмечают появление негативных побочных эффектов этого вида терапии. У больных наблюдались повышение температуры, озноб, артралгия, миалгия, тошнота, рвота, диарея, нарушения сосудистой проницаемости, нарушение дыхательной функции, признаки поражения печени. Наиболее вероятной причиной подобных системных реакций является ответная реакция организма на одномоментное массированное локализованное введение высокой концентрации цитокинов и, прежде всего, интерлейкина-2 (IL-2). Логично предположить, что во избежание подобного негативного эффекта ЛАК-терапии предпочтительным способом является создание в ткани депо активированных клеток, синтезирующих цитокины в процессе своей жизнедеятельности, которые, попадая в кровь, будут распределятся по организму, не создавая в одном локальном месте высокой токсической концентрации. Структурной основой для создания такого депо могут служить пористые титановые носители для клеточных структур (см. патент RU 2300345, опубл. 10.06.2007), являющиеся продуктом скаффолд-технологий (от англ. «scaffold» - помост из строительных лесов), которые в настоящее время широко применяются в ортопедической практике.

В качестве эффекторов в биотерапии применяют не только ЛАК, но и другие иммунокомпетентные клетки. Предлагаются самые разные способы повышения их активности. В частности, весьма перспективным направлением является воздействие на клетки электромагнитного излучения. Несмотря на существование различных точек зрения на первичность тех или иных физико-химических механизмов воздействия электромагнитного поля на биообъекты, большинство исследователей единодушны в том, что поле указанной природы оказывает влияние прежде всего на физико-химические процессы, а через них и на скорость биохимических реакций метаболизма через усиление флюктуации зарядовых компонентов ионного гомеостаза, способных реагировать на данную частоту поля, ЭМП изменяет величину свободной энергии системы зарядов гомеостаза (Павлов А.Н. «Воздействие электромагнитных излучений на жизнедеятельность». - М.: Гелиос АРВ, 2002, стр.224). Это предположение согласуется с положением, выдвинутым Л.Д.Ландау, утверждающим, что зависящая от функции корреляции биологической макроскопической системы свободная энергия взаимодействия взаимодействующей с полем системы будет значительно меняться (Ландау Л.Д., Лифшиц Л.М. «Статистическая физика». - М.: Гостехиздат, 1958, стр.400). Это в свою очередь будет приводить к изменениям процессов деления и роста клеток, в частности, в результате ферментативных реакций.

Для различных ферментов ЭМП с одинаковыми характеристиками может как активизировать, так и подавлять соответствующие реакции (см. патент RU 2179578, опубл. 20.02.2002). К настоящему времени в научной литературе накопилось большое количество данных, свидетельствующих о значительном и разностороннем воздействии на прокариотические и эукариотические клетки факторов волновой природы различного происхождения. Как было установлено, результирующее воздействие волнового фактора обусловлено как физическими характеристиками возбуждающей волны и биологическими особенностями клетки-мишени, так и физико-химическими особенностями среды взаимодействия. Так, было доказано, что ионы микроэлементов в минимальных концентрациях осуществляют как стимуляцию, так и ингибицию метаболизма клеток (Моралев Л.Н. и др. «Реактивные изменения клетки под влиянием биокомплекса цинка». Успехи современного естествознания. - Российская Академия естествознания, 7, 2007).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ лечения онкозаболеваний, заключающийся в том, что осуществляют подкожную имплантацию пористых никелид титановых носителей-инкубаторов с депонированной в их поры вакциной из обработанной ЭМП биопсийного опухолевого материала (см. патент RU 2285548, опубл. 20.10.2006).

Недостатками известного способа являются применение в качестве носителей пористого никелида титана, так как ионы никеля, входящие в состав носителей, даже в минимальных концентрациях вызывают развитие онкологических заболеваний. Применение вакцины из «убитых» опухолевых клеток опасны в плане пассивной антигенной стимуляции роста опухоли.

Задачей изобретение является устранение указанных недостатков, исключение прогрессирования основного заболевания и продление жизни у онкологических больных. Технический результат заключается в снижении метастатической активности опухоли, продлении жизни пациента и улучшении ее качества.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что способ иммунореабилитации онкозаболеваний заключается в том, что осуществляют подкожную имплантацию пористых титановых носителей-инкубаторов с депонированной в их поры вакциной, при этом в качестве вакцины используют собственные модифицированные лимфолейкоцитарные клетки. Для подготовки вакцины из собственных модифицированных лимфолейкоцитарных клеток у пациента выполняют пункцию периферической крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Под местной анестезией 0.5% раствором новокаина в количестве 30.0 мл подкожно в области живота троакаром имплантируют пористые конструкции из титана (скаффолд), содержащие модифицированные собственные лимфолейкоцитарные клетки, взятые при пункции периферической вены.

Экспериментальные исследования выполнялись на базе НИИ ЭД и ТО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Целью работы было изучение возможности использования титановых пластинок (скаффолдов) в качестве структурной основы депо эффекторных иммунокомпетентных клеток как перспективного способа иммунной биотерапии, а также оценка перспективности применения автономных генераторов электрических импульсов (АЭС ЖКТ) для стимуляции эффективности иммунокомпетентных клеток.

При изучении иммуномодулирующей активности in vitro в качестве скаффолдов использовали пористые титановые пластинки (пористость 55-60%), имеющие форму параллелепипедов (15×3×3 мм). В качестве клеток-эффекторов использовали дендритные клетки и ЛАК.

Проведенные экспериментальные исследования позволили установить, что применение титанового скаффолда в качестве концентрирующей эффекторные клетки структуры позволяет им сохранять жизнеспособность и даже несколько увеличивать цитолитическое противоопухолевое действие. Этот эффект реализуется, вероятно, за счет цитокинов TNFα и IL-1β, синтезируемых ЛАК и оказывающих цитопатогенное действие на опухолевые клетки. Поскольку высокий уровень активности подобной клеточной колонии самоподдерживается за счет синтеза клетками INFγ, предполагалось, что уровень этого цитокина в среде также должен быть повышен. Однако нам не удалось подтвердить это предположение. Тем не менее, необходимо отметить, что примененный метод анализа цитокинового позволяет идентифицировать лишь свободные молекулы медиатора. Исходя их этого можно предположить, что клетки синтезируют INFγ в достаточном количестве, чтобы поддерживать свою функциональную активность, но он быстро связывается рецепторами самой клетки-продуцента или близкорасположенных к ней и поэтому не детектируется в среде, окружающей скаффолд. Аналогично этим доводом можно попытаться объяснить обнаруженную низкую концентрацию и других цитокинов. В этой связи чрезвычайно интересным представляется факт увеличения в среде, содержащей скаффолд с ЛАК, концентрации IL-5. В среде, содержащей кроме нагруженного скаффолда опухолевые клетки, этот цитокин обнаружить не удается. Известно, что данный цитокин усиливает экспрессию на клеточной мембране рецепторов к IL-2, ускоряя пролиферацию. Возможно, в условиях концентрированного расположения молекулы этого цитокина быстро связываются рецепторами, следствием чего в итоге является длительное поддержание в депо значительного количества активированных клеток.

Полученные результаты позволили подтвердить ранее описанный рядом исследователей эффект прямого цитотоксического воздействия ионов цинка под действием ЭМП. Нами было показано, что существует дифференциация эффекта подобного воздействия. Так, опухолевые клетки в 3 раза более чем ЛАК чувствительны к его цитопатогенному воздействию, а угнетение дыхательной активности дендритных клеток после воздействия ионофореза было выражено наименее значительно - их ИЖ в 3.2. раза меньше, чем ИЖ ЛАК.

Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что введение в организм скаффолдов, нагруженных в ЛАК, будет способствовать созданию в организме депо колонии функционально активных иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих в процессе за счет постоянного синтеза цитокинов активацию различных звеньев иммунитета.

Полученные в эксперименте данные позволили применить этот метод в клинике.

Клинический пример

Больная Ш., 43 года, история болезни 3294, находилась на этапном лечение в ЦКБ РАН, г.Москва, с 10 сентября 2007 г. по 30 апреля 2008 г. с морфологически подтвержденным ИГХ диагнозом: Перстневидно-клеточный рак желудка IV стадии, метастазы Круккенберга, канцероматоз брюшины, метастаз в пупочное кольцо, паховые лимфоузлы, резистентный асцит.

При поступлении предъявляла жалобы на потерю веса, анарексию, выраженную слабость. При клиническом обследовании диагноз подтвердился. Пациентке выполнен первый этап иммунореабилитации. Последующие три месяца пациентка находилась на амбулаторном наблюдении с обязательным посещением клиники раз в 2 недели и сдачей анализов. Производился лапароцентез по показаниям в пределах 10-12 литров асцитической жидкости. Через три месяца пациентка вновь поступила на 2-й этап иммунореабилитации. При обследовании отмечается улучшение самочувствия, появился аппетит, уменьшение асцитической жидкости до 6 литров, уменьшение и дефрагментация паховых лимфоузлов. При контрольной ЭФГДС с прицельной биопсией обнаружен склерозирующий процесс опухоли проксимального отдела желудка без нарушения моторно-эвакуаторной функции желудка. На КТ и УЗИ органов малого таза и яичников обнаружен процесс формирования соединительной ткани метастазов яичников и кист в малом тазу. Мониторинг иммунологических параметров показал тенденцию роста натуральных киллеров крови и интерлейкина-2. Следующие три месяца амбулаторного наблюдения показали устойчивую стабилизацию основного процесса и нормализацию гематоиммунологических параметров. В апреле 2008 г. пациентка поступила на 3-й этап реабилитации, где после обследование найдены все показания для оперативного лечения - циторедуктивное удаление метастазов Круккенберга. 21 апреля под эндотрахеальным наркозом выполнена лапароскопия, где установлено, что опухолевидные образования яичников размягчились, стали подвижными, появились кистозные образования на них и в местах метастазирования в париетальной брюшине. Процесс признан операбельным, произведена конверсия на нижне-срединную лапаротомию и без технических трудностей яичники были удалены, брюшная полость осушена, признаков инвазивного роста опухоли на обнаружено, брюшная полость ушита наглухо.

Таким образом, основываясь на экспериментальных данных, данных клинического наблюдения, заявленный способ позволяет управлять течением опухолевого процесса и тем самым продлить и создать комфортные условия жизни онкологическим больным.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для иммунореабилитации онкозаболеваний. Способ по изобретению заключается в том, что осуществляют подкожную имплантацию пористых титановых носителей-инкубаторов с депонированной в их поры вакциной. В качестве таких носителей используют пористые титановые носители-инкубаторы, а в качестве вакцины используют собственные лимфокин-активированные киллеры, модифицированные электромагнитным полем. Изобретение позволяет снизить метастатическую активность опухоли за счет создания в организме депо функционально активных иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих в процессе постоянного синтеза цитокинов активацию различных звеньев иммунитета. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ иммунореабилитации онкозаболеваний, заключающийся в подкожной имплантации пористых носителей-инкубаторов с депонированной в их поры вакциной, отличающийся тем, что в качестве таких носителей используют пористые титановые носители-инкубаторы, а в качестве вакцины используют собственные лимфокин-активированные киллеры, модифицированные электромагнитным полем.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для подготовки вакцины используют кровь, полученную в результате пункции периферической вены.