СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕПОНИРОВАННЫХ ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ Российский патент 2010 года по МПК A61K35/14 A61K35/24 C12N5/71 

Описание патента на изобретение RU2400238C1

Изобретение относится к медицине, а именно к способам иммунореабилитации онкологических заболеваний.

Известные методы иммунотерапии позволяют получить из малоактивных фракций мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) крови больного значительное количество так называемых лимфокин-активированных киллеров (ЛАК). ЛАК-иммунотерапия расширяет спектр возможностей противоопухолевой терапии. Помимо того, она имеет преимущества по сравнению с традиционными методами: отсутствие токсичности, удовлетворительная переносимость лечения, возможность применения совместно с другими традиционными терапевтическими методами; в случаях лекарственной резистентности, стимуляция местного противоопухолевого клеточного иммунитета приводит к лизису опухоли, а также улучшает качество и продолжительность жизни пациентов. Однако, как показали исследования, биораспределения ЛАК в условиях системного введения активированных лимфоцитов преимущественно накапливаются в паренхиме легких и печени и определяются в области опухолевых узлов в данных органах не более 1 сут. Поэтому для повышения эффективности иммунотерапии использовали многократные введения больших доз ЛАК (до нескольких миллиардов за курс). Высокодозная ИЛ-2/ЛАК-терапия сопровождается выраженными побочными эффектами (лихорадка, озноб, артралгия, миалгия, тошнота, рвота, диарея, нарушения сосудистой проницаемости и нарушение дыхательной функции). В последние годы развиваются методы локальной и локорегиональной адаптивной иммунотерапии, позволяющие создать эффективную концентрацию ЛАК в области опухолевого процесса и минимизировать системные побочные эффекты. Поскольку далеко не во всех случаях имеется возможность адресной доставки ЛАК к опухолевым образованиям, перспективным является разработка методов, позволяющих формировать в различных тканях депо активированных клеток. Продуцируемые в процессе жизнедеятельности депонированных ЛАК цитокины могут оказывать длительное стимулирующее влияние на противоопухолевый иммунитет. Кроме того, в последнее время появились сведения о способности ЛАК, введенных в опухолевые узлы, оказывать не только прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки, но и за счет выделяемых цитокинов рекрутировать в область введения ЛАК другие эффекторы противоопухолевого иммунитета. Важно отметить, что ЛАК могут лизировать опухолевые клетки не только при непосредственном контакте, но и за счет дистантного действия цитокинов, индуцирующих высвобождение цитопатогенных факторов (например, оксида азота) из макрофагов. Структурной основой для создания такого депо могут служить пористые титановые пластинки, являющиеся продуктом скаффолд-технологий (от англ. «scaffold» - строительные леса), которые в настоящее время широко применяются в хирургической и ортопедической практике.

Наиболее близким к заявленному способу является способ получения клеточного трансплантата для лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний, характеризующийся тем, что кровь или взвесь костного мозга центрифугируют в одноступенчатом градиенте фиколла, проводят культивирование МНК в среде RPMI 1640 или DMEM с 5% человеческой сыворотки пациента или АВ сыворотки донора, далее клетки разделяют на моноциты/макрофаги, прикрепляющиеся к подложке, и лимфоциты, не прикрепляющиеся к подложке, МНК помещают в культуральную среду на 2-4 ч и затем сливают неприкрепившиеся лимфоциты для получения незрелых ДК, к оставшимся прикрепившимся клеткам моноцитам/макрофагам добавляют гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), далее для стимуляции созревания ДК используют провоспалительные факторы ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6 (10 нг/мл), при этом полученные в экстракорпоральных условиях незрелые дендритные клетки (CD83low, CD86low, CD80low) инкубируют с лизатом опухоли, или вирусными, или бактериальными антигенами и факторами индукции созревания ДК в течение 1 сут и получают зрелые пульсированные антигенами ДК (CB83high, CD86high, CD80high), для получения ЛАК-клеток к лимфоцитам добавляют ИЛ-2 в концентрации 1000 МЕ/мл (см. патент RU 2309753, кл. А61К 35/14, опубл. 10.11.2007). Недостатками известного способа являются необходимость использования многократных введений больших количеств лимфоцитов, а также необходимость локального или локорегионарного введения. Это существенно затрудняет применение этого метода у онкологических больных с опухолями различной локализации.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков.

Технический результат заключается в повышении эффективности получаемого средства для локальной и локорегионарной иммунотерапии онкологических больных. Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что согласно способу получения депонированных лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) выделяют мононуклеарные лимфоциты (МНЛ) из периферической крови или злокачественного выпота центрифугированием на одноступенчатом градиенте фиколла плотностью 1,06-1,08 г/см3, генерируют и концентрируют ЛАК путем последовательного осаждения МНЛ центрифугированием, ресуспендирования его в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 2-10% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млн.МЕ/мл и инкубирования в СО2-инкубаторе в течение 48-72 ч, а затем депонируют взвесь полученных клеток ЛАК в культуральной среде из расчета 2 млн. ЛАК на 200 мл среды на стерилизованные и промытые культуральной средой пористые титановые носители с пористостью 55-60%.

На фиг.1-4 изображены гистограммы, отражающие иммунофенотип ЛАК,

на фиг.1 - распределение для CD16+;

на фиг.2 - распределение для CD56+,

на фиг.3 - распределение для CD25+;

на фиг.4 - распределение для CD38+.

При этом приняты обозначения: Gm - среднегеометрическая отклонение сигнала, CV - коэффициент вариации; в квадратных скобках - регистрирующиеся каналы, после квадратных скобок - средний канал, в круглых скобках процент клеток, экспрессирующих данный антиген, линия M1 - уровень значений, отличных от контроля.

На фиг.5-8 изображена цитотоксическая активность ЛАК, депонированных в скаффолдах, при увеличении в 400 раз.

на фиг.5 - интактные клетки К-562;

на фиг.6 - инкубация интактных ЛАК с клетками К-562;

на фиг.7 - интактные клетки К-562 и пустой скаффолд;

на фиг.8 - инкубация ЛАК, депонированных в скаффолде, с клетками Л-562.

Выделение МНЛ из периферической крови может быть осуществлено различными способами, например центрифугированием в одноступенчатом градиенте фиколла. Для предотвращения свертывания кровь стабилизируют обычно применяемыми для этих целей консервантами, такими как, например, гепарин, цитрат натрия, ЭДТА.

Предлагаемый способ позволяет получать достаточное количество лимфоцитов из 100 мл периферической крови или из одной дозы лейкомассы донора, что значительно упрощает процедуру забора мононукларных лейкоцитов проведения аппаратной сепарации крови.

Культивирование МНЛ происходит в RPMI-1640 или DMEM с 2-10% человеческой сыворотки пациента (или АВ сыворотки донора) в одноразовых пластиковых флаконах объемом 250 мл фирмы Costar или аналогичных флаконах других фирм. Для получения лимфокин-активированных киллеров МНЛ культивируют с интерлейкином-2 в концентрации 0,5-1,0 МЕ/мл.

В качестве скаффолдов используют пористые титановые пластинки пористостью 55-60%, имеющие форму параллелепипедов (15×3×3 мм). Стерилизованные и промытые культуральной средой скаффолды интенсивно встряхивают для освобождения пор от остатков среды и на поверхность граней наносят 2 млн. ЛАК в 200 мкл культуральной среды.

Пример осуществления изобретения.

1. Выделение МНЛ из периферической крови.

МНЛ выделяют из стабилизированной гепарином (25 ед./мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла («Pharmacia», плотностью 1.077 г/см3) центрифугированием при 400 g в течение 30 минут. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирают пипеткой и трехкратно отмывают в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждают центрифугированием при 200 g.

2. Генерация ЛАК.

МНЛ подсчитывают, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в среде RPMI 1640 с добавками (HEPES, L-глютамин, гентамицин) в концентрации 1 млн./мл, с добавлением 5% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млн.МЕ/мл и инкубируют в CO2-инкубаторе в течение 48-72 ч. Как показано на Фиг.1, популяция активированных МНЛ преимущественно представлена натуральными киллерами (CD16+, CD56+) и активированными формами лимфоцитов (CD25+, CD38+).

3. Депонирование ЛАК в пористых титановых скаффолдах.

Стерилизованные и промытые культуральной средой скаффолды интенсивно встряхивали для освобождения пор от остатков среды и наносили на поверхность граней 2 млн. ЛАК в 200 мкл культуральной среды.

4. Микроскопия.

Интактные ЛАК и ЛАК, депонированные в титановых скаффолдах и помещенные в 24-луночные планшеты, просматривают и фотографируют на инвертоскопе Axiovert (Zess, Германия). Как показано на Фиг.2 при микроскопическом исследовании, ЛАК, помещенные в скаффолд, вызывают более выраженный лизис клеток линии К 562, чем интактные ЛАК. При этом не было отмечено рассеивания ЛАК из скаффолда; в лунке наблюдались лишь единичные лимфоидные элементы.

5. Оценка противоопухолевого действия интактных ЛАК и ЛАК, депонированных в пористых титановых скаффолдах, на линии опухолевых клеток К 562.

В лунки 24-луночного планшета («Costar», USA) вносили по 2 млн. ЛАК или скаффолд с ЛАК и по 400000 клеток линии К 562. В контрольных сериях в лунки микропланшет добавляли только ЛАК, скаффолд, нагруженный ЛАК, либо клетки К 562. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 4,5% CO2. Затем отбирали часть среды для последующего определения цитокинов.

Воздействие скаффолдов на противоопухолевые свойства ЛАК оценивали, используя МТТ-колориметрический тест. Индекс цитотоксической активности (ИЦА) ЛАК рассчитывали на основании данных оптической плотности в контрольных и опытных сериях. Оптическую плотность измеряли на мультискане MS (Labsystem, Финляндия). Цитотоксический эффект ЛАК в скаффолдах был результатом бесконтактного воздействия эффекторов на клетки-мишени. Представленные материалы свидетельствуют о том, что ЛАК в скаффолде дольше сохраняют свою цитотоксическую активность и через 10 сут культивирования проявляют достоверно более высокую киллерную активность по сравнению с интакными ЛАК (в среднем на 22%) (табл.1).

6. Определение продукции цитокинов интактных ЛАК и ЛАК, депонированных в пористых титановых скаффолдах.

Концентрацию цитокинов в культуральной среде определяли, используя набор для исследования концентрации цитокинов человека FlowCytomix human Th1/Th2 11plex BMS810 FF (Bender MedSystems) методом проточной цитофлуометрии на приборе FACSCalibur Systems.

В табл.2 представлены данные о продукции цитокинов ЛАК. Установлено, что воздействие металла скаффолда не влияет на секрецию цитокинов активированными лимфоцитами. ЛАК, помещенные в скаффолды, продолжают адекватно функционировать, так как концентрация цитокинов в среде инкубации, практически, идентична таковой для интактных ЛАК. Однако ЛАК, депонированные в скаффолдах, продуцируют противовоспалительный цитокин IL-10 в меньших количествах.

Таблица 1 Изменение индекса цитотоксической активности (ИЦА, %) интактных и помещенных в скаффолд ЛАК при испытании на клетках линии К 562 Эффекторы Сроки культивирования ЛАК (сут) 2 5 10 Интактные ЛАК 88±3 74±4 62±5 ЛАК в скаффолде 89±1 86±2 84±2* * достоверное (р<0,05) отличие от интактных ЛАК

Таблица 2 Продукция цитокинов ЛАК (пкг/мл) Клетки-продуценты INFγ IL-6 IL-4 IL-5 IL-1β TNFα TNFβ IL-10 IL-12p70 IL-2 Интактные ЛАК 6601±726,1 1751±1576,6 0 0±19 540±70,2 1508±90,5 64±3,8 887±79,8 16±3,0 1625±260,0 ЛАК в скаф. 5879±649,7 1878±1691,0 0 0±19 500±65,0 1630±97,8 43±2,6 243±21,9 20±2,5 1504±240,6 Пустой скаф.+ЛАК 4190±460,9 1045±938,3 0 0±18 485±63,1 987±59,2 20±1,2 791±71,2 13±10,2 1026±164,2 К 562 0±11,0 28±5,2 0 0±18 4±0,5 11±0,7 0±6,1 0±9,0 0±18,9 6±16,2 * достоверное (р<0,05) отличие от интаткных ЛАК

Похожие патенты RU2400238C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ДЛЯ АДЪЮВАНТНОЙ АДАПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ 2009
  • Чикилева Ирина Олеговна
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Верескунова Наталья Владимировна
  • Киселевский Михаил Валентинович
RU2414915C2
СПОСОБ ИММУНОРЕАБИЛИТАЦИИ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ 2008
  • Данилин Александр Николаевич
  • Загребин Леонид Валентинович
  • Шестов Сергей Семенович
  • Яновский Юрий Григорьевич
RU2377994C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ 2009
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Соснов Андрей Владимирович
RU2402338C1
Биодеградируемый имплантат для локальной иммунотерапии онкологических больных 2021
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Мартыненко Наталья Сергеевна
  • Рыбальченко Ольга Владиславовна
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Маншарипова Алмагуль Тулеуловна
  • Кабиева Айгуль Одаковна
  • Добаткин Сергей Владимирович
  • Эстрин Юрий Захарович
RU2780932C1
Биодеградируемый металлический имплантат для локальной иммунотерапии пациентов с солидными опухолями 2021
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Мартыненко Наталья Сергеевна
  • Рыбальченко Ольга Владиславовна
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Маншарипова Алмагуль Тулеуловна
  • Кабиева Айгуль Одаковна
  • Добаткин Сергей Владимирович
  • Эстрин Юрий Захарович
RU2780927C1
Титановый имплантат с функцией локальной иммунотерапии для остеореконструктивной хирургии и профилактики местного рецидива онкологического заболевания и способ его изготовления 2021
  • Страумал Борис Борисович
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Когтенкова Ольга Александровна
  • Киселевский Михаил Валентинович
RU2779367C1
СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ОЧИСТКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ 2010
  • Даванков Вадим Александрович
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Будник Михаил Иванович
RU2448897C1
Биомедицинский клеточный продукт со специфической противоопухолевой активностью, представленный популяциями лимфокин-активированных киллеров и анти-HER2 CAR-γδΤ-ОИЛ и анти-HER2 CAR-T-NK 2022
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Петкевич Алиса Антоновна
  • Липенгольц Алексей Андреевич
  • Чикилева Ирина Олеговна
  • Анисимова Наталья Юрьевна
RU2786210C1
СПОСОБ АКТИВАЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА 2015
  • Каприн Андрей Дмитриевич
  • Абакушина Елена Вячеславовна
  • Маризина Юлия Витальевна
  • Неприна Галина Степановна
RU2603079C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ IFN-γ И TNF-α ДЛЯ АДОПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ 2023
  • Гельм Юлия Витальевна
  • Гривцова Людмила Юрьевна
  • Пасова Ирина Алексеевна
  • Константинова Татьяна Викторовна
  • Иванов Сергей Анатольевич
RU2822876C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 400 238 C1

Реферат патента 2010 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕПОНИРОВАННЫХ ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ

Изобретение относится к биохимии и медицине, а именно к способам получения депонированных лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) для лечения онкологических заболеваний. Предложен способ, согласно которому выделяют мононуклеарные лимфоциты (МНЛ) из периферической крови или злокачественного выпота центрифугированием на одноступенчатом градиенте фиколла плотностью 1,06-1,08 г/см3, генерируют и концентрируют ЛАК путем последовательного осаждения МНЛ центрифугированием, ресуспендирования его в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 2-10% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млн.МЕ/мл и инкубирования в СО2-инкубаторе в течение 48-72 ч, а затем депонируют взвесь полученных клеток ЛАК в культуральной среде из расчета 2 млн. ЛАК на 200 мл среды на стерилизованные и промытые культуральной средой пористые титановые носители с пористостью 55-60%. Изобретение позволяет повысить эффективность получаемого средства для локальной и локорегионарной иммунотерапии онкологических больных. 8 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 400 238 C1

Способ получения депонированных лимфокин-активированных киллеров (ЛАК), согласно которому выделяют мононуклеарные лимфоциты (МНЛ) из периферической крови или злокачественного выпота центрифугированием на одноступенчатом градиенте фиколла плотностью 1,06-1,08 г/см3, генерируют и концентрируют ЛАК путем последовательного осаждения МНЛ центрифугированием, ресуспендирования его в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 2-10% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млнМЕ/мл и инкубирования в CO2 инкубаторе в течение 48-72 ч, а затем депонируют взвесь полученных клеток ЛАК в культуральной среде из расчета 2 млн ЛАК на 200 мл среды на стерилизованные и промытые культуральной средой пористые титановые носители с пористостью 55-60%.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2400238C1

КОМБИНИРОВАННЫЙ КЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПЛАНТАТ НА ОСНОВЕ ЛИМФОКИНАКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ И ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ, ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ 2006
  • Гольдштейн Дмитрий Вадимович
  • Макаров Андрей Витальевич
  • Арутюнян Ирина Владимировна
  • Фатхудинов Тимур Хайсамудинович
  • Ржанинова Алла Анатольевна
  • Шаменков Дмитрий Алексеевич
  • Горностаева Светлана Николаевна
  • Волков Алексей Вадимович
  • Бочков Николай Павлович
RU2309753C1
УСТАНОВКА ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ НАКИПИ 1998
  • Курзин Н.Н.
  • Потапенко И.А.
  • Богатырев Н.И.
  • Андрейчук В.К.
  • Давыденко Н.В.
RU2131572C1
US 5091511 А, 25.02.1992
Устройство для обработки сферических поверхностей 1983
  • Люцин Илья Самуилович
  • Моргулис Рафаил Юрьевич
  • Сирота Эрнест Моисеевич
SU1093404A1
КОЛМА MASAHARU et al
Method for manufacture of lymphokine activated killer (LAK) cells without sing type AB plasma, Jpn
Kokai Tokkyo Koho, CA COPYRIGHT 2009 ACS on STN, original reference No.114:17026h, 17.027a/.

RU 2 400 238 C1

Авторы

Загребин Леонид Валентинович

Шестов Сергей Семенович

Анисимова Наталья Юрьевна

Верескунова Наталья Владимировна

Киселевский Михаил Валентинович

Даты

2010-09-27Публикация

2009-03-04Подача