СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к спиртовой промышленности, в частности к способу культивирования дрожжей для спиртового производства.

Известен способ культивирования микроорганизмов в присутствии проксанола в количестве 0,001-1,000 г/л, предварительно смешанного с дополнительным источником углерода в количестве, пропорциональном увеличению скорости массопередачи кислорода, внесенных в питательную среду в момент начала лимитирования биосинтеза кислородом (патент РФ №1559696, 1993 г. Способ культивирования микроорганизмов.).

Недостатком данного способа является невысокая концентрация дрожжевых клеток.

Наиболее близким по технической сущности является способ культивирования дрожжей для спиртового производства на питательной среде, в которой культивирование ведут в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло или сахарозу до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 500-1000 млн/мл, после чего культуральную жидкость последней ступени выдерживают в анаэробных условиях в течение 2-3 часов, в процессе культивирования ведут подпитку стерильным суслом или раствором сахарозы в продукте декантации послеспиртовой барды до содержания сахара в питательной среде 4-6% (патент РФ №2136746, Бюл. №25, 1999 г. Способ культивирования дрожжей для спиртового производства).

Недостатком данного способа является невысокая концентрация 500-1000 млн/мл дрожжевых клеток.

Задачей изобретения является создание способа культивирования дрожжей для спиртового производства, позволяющего получить чистую дрожжевую культуру с высокой концентрацией клеток 1500-2000 млн/мл и хорошим качеством.

Техническая задача в способе культивирования дрожжей для спиртового производства в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло, в процессе культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae p.XII, р. М, смесь р. XII и р. М, Y 717, р. 1976 ведут подпитку стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4-6%, культивирование дрожжей ведут до достижения заданной концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени культивирования, достигается тем, что при культивировании указанных дрожжей в культуральную жидкость при достижении в ней концентрации дрожжевых клеток 700 млн/мл вносят неионогенный ПАВ - проксанол в количестве 0,005-0,01 г/л, осуществляют управление аэрацией и перемешиванием по дыхательному коэффициенту дрожжей, поддерживая его в период лаг-фазы в пределах 3,5-10 [гСO₂/гO₂], в период экспоненциальной фазы роста - в пределах 1,5 - 2,5 [гСO₂/гO₂], и на последней ступени культивирования культуральную жидкость выдерживают в течение 2-3 часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента в пределах 20-35 [гСO₂/гO₂], до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн/мл.

Предлагаемый способ позволяет увеличить концентрацию дрожжевых клеток до 4 раз по сравнению с прототипом и получить дрожжи с хорошим качеством и высокой бродильной активностью.

В заявленном способе используют продукт декантации послеспиртовой барды, полученной после ректификации бражки на сырцовой ректификационной установке. Послеспиртовая барда является отходом производства (см. журнал «Биотехнология», №6, 1997, с.43-46). Сусло готовят в соответствии с Регламентом производства спирта из крахмалистого сырья, часть 1 - М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1979. Проведена серия экспериментов на культурах дрожжей широко используемых в спиртовом производстве - Saccharomyces cerevisiae p.XII, р. М, смесь р. XII и р. М (в соотношении 1:1), Y 717, р. 1976. Установлено, что активный рост и накопление биомассы дрожжей при выбранных условиях культивирования характерны для всех заявленных культур.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.Чистую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на сусле-агаре, пересевают в качалочные колбы объемом 750 мл на стерильную питательную среду объемом 50 мл с начальным содержанием сахара 4%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Частота встряхивания качалочных колб 220 об/мин.

В процессе культивирования дрожжей в качалочных колбах ведут подпитку стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4%. При достижении концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости 700 млн/мл полученную дрожжевую культуру переносят в ферментер объемом 10 литров, куда добавляют стерильный 10% водный раствор неионогенного ПАВ - проксанола из расчета 0,005 г на литр культуральной жидкости. Культивирование дрожжей ведут в ферментере на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4%, в качестве которой используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Аппарат-ферментер для культивирования дрожжей оснащен самовсасывающей мешалкой, вращающейся со скоростью от 200 до 1400 об/мин.

В процессе культивирования дрожжей осуществляют управление аэрацией и перемешиванием культуральной жидкости по дыхательному коэффициенту дрожжей (RQ), который рассчитывается на основании газового баланса по следующей формуле (разницей между мольными объемами углекислого газа и кислорода при нормальных условиях пренебрегаем) (см. Мухачев С.Г. Определение параметров аэробного роста микроорганизмов на основе газового анализа. - Сб. XVIII международной конференции «Математические методы в технике и технологиях», 2005, т.6, с.160-163):

где: 0,00033 и 0,2095 - объемные доли соответственно углекислого газа и кислорода в сухом атмосферном воздухе;

0,7905 - объемная доля инертных газов в сухом воздухе, подаваемом на аэрацию;

O₂ и СO₂- объемные доли кислорода и углекислого газа в отработанном воздухе, выходящем из ферментера.

Для расчета величины дыхательного коэффициента (RQ) измеряют остаточную концентрацию кислорода и концентрацию углекислого газа в отработанном воздухе, выходящем из ферментера.

Измерения проводят с помощью газоанализаторов на углекислый газ (СO₂) и кислород (O₂): прибор ГИАМ-5 производства «Аналитприбор», г.Смоленск, кл.2 и ММГ-7, производства «Медтехника», г.Казань, кл.2. соответственно.

Первые 2-3 часа роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в период лаг-фазы, процесс культивирования дрожжей ведут, управляя режимными параметрами аэрации и перемешивания, поддерживая значение дыхательного коэффициента равным 3,5 [гСO₂/гO₂], в последующий экспоненциальный период роста дрожжевой культуры осуществляют управление аэрацией и перемешиванием культуральной жидкости, поддерживая дыхательный коэффициент на уровне 1,5 [г СO₂/гO₂].

В процессе подготовки питательной среды и подпиток, а также при культивировании дрожжей концентрацию сахара в культуральной жидкости определяют методом Бертрана, количество дрожжевых клеток - подсчетом клеток в камере Горяева (см. книгу «Микробиологический контроль гидролизно-дрожжевого производства». - М.: Экология, 1991 г., с.44-50; «Практикум по микробиологии» - М.: Издательство Моск. Ун-та, 1976, с.174-176).

По мере роста дрожжевой популяции при снижении содержания сахара в культуральной жидкости до рВ 2,5% проводят подпитку стерильным суслом с содержанием рВ 12-15% с внесенным в него стерильным 10% водным раствором неионогенного ПАВ - проксанола в концентрации 0,005 г на 1 литр подпитки. Подпитка возвращает содержание сахара в питательной среде к начальному значению.

При достижении концентрации дрожжевых клеток, равной 1500 млн/мл, дрожжевую культуру направляют на следующую ступень в ферментер объемом 500 литров и ведут процесс культивирования в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4%, управляя аэрацией и перемешиванием по соответствующему каждой стадии роста дрожжевой культуры дыхательному коэффициенту аналогично предыдущей ступени.

На последней ступени культивирования при достижении концентрации дрожжевых клеток 1500 млн/мл дрожжи Saccharomyces cerevisiae выдерживают в питательной среде с содержанием сахара 4% в течение 2-х часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента дрожжей равным 20 [гСО₂/гО₂], для переключения дрожжевых клеток с дыхательного на анаэробный тип жизнедеятельности, перестройки ферментативного комплекса дрожжевой клетки для катализа брожения.

Бродильную активность и качество дрожжей определяют газометрическим методом (см. журнал «Пищевая промышленность», №11, 1989, с.37-38; книга «Контроль производства хлебопекарных дрожжей» автора О.А.Бакушинской, - М.: Пищевая пром-ть, 1978 г.)

Качество выращенных дрожжей - хорошее.

Пример 2. Чистую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на сусле-агаре, пересевают в качалочные колбы объемом 750 мл на стерильную питательную среду объемом 50 мл с начальным содержанием сахара 6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Частота встряхивания качалочных колб 220 об/мин.

В процессе культивирования дрожжей в качалочных колбах при снижении сахара в культуральной жидкости до рВ 2,5% ведут подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) до содержания сахара в питательной среде 6%. При достижении концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости 700 млн/мл полученную дрожжевую культуру переносят в ферментер объемом 10 литров, куда добавляют стерильный 10% водный раствор неионогенного ПАВ - проксанола из расчета 0,01 г ПАВ на литр культуральной жидкости. Культивирование дрожжей ведут в ферментере на стерильной питательной среде с содержанием сахара 6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Процесс культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae осуществляют, управляя аэрацией и перемешиванием, которые определяются часом роста дрожжевой культуры и соответствующим ему дыхательным коэффициентом. В период лаг-фазы (первые 2-3 часа роста) режимные параметры аэрации и перемешивания устанавливают такими, чтобы дыхательный коэффициент был равным 10 [гСO₂/гO₂], в период интенсивного роста (последующие 10-12 часов), в экспоненциальной фазе, дыхательный коэффициент поддерживают на уровне 2,5 [гСO₂/гО₂].

В процессе культивирования дрожжей проводят подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) с добавлением в него стерильного 10% водного раствора проксанола в концентрации 0,01 г/л, возвращая содержание сахара в питательной среде к начальному значению.

При достижении концентрации дрожжевых клеток, равной 1700 млн/мл, дрожжевую культуру направляют на следующую ступень в ферментер объемом 500 литров и ведут процесс в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 6%, аналогично предыдущей степени.

На последней ступени культивирования при достижении концентрации дрожжевых клеток 1700 млн/мл дрожжи выдерживают в питательной среде с содержанием сахара 6% в течение 3-х часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента равным 35 [гСО₂/гO₂], что необходимо для переключения дрожжевых клеток с дыхательного на анаэробный тип жизнедеятельности.

Качество выращенных дрожжей - хорошее.

Пример 3. Чистую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на сусле-агаре, пересевают в качалочные колбы объемом 750 мл на стерильную питательную среду объемом 50 мл с начальным содержанием сахара 5%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Частота встряхивания качалочных колб 220 об/мин.

В процессе культивирования при снижении сахара в культуральной жидкости до 2,5% ведут подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) до содержания сахара в питательной среде 5%. При достижении концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости качалочных колб 700 млн/мл полученную дрожжевую культуру переносят в ферментер объемом 10 литров, куда добавляют стерильный 10% водный раствор неионогенного ПАВ - проксанола из расчета 0,0075 г ПАВ на литр культуральной жидкости. Культивирование дрожжей ведут в ферментере на стерильной питательной среде с содержанием сахара 5%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

В процессе культивирования дрожжей осуществляют управление аэрацией и перемешиванием по дыхательныму коэффициенту дрожжей. В период лаг-фазы (первые 2-3 часа роста дрожжевой культуры) режимные параметры устанавливают такими, чтобы дыхательный коэффициент был равен 7 [гCO₂/гO₂], в период интенсивного роста (последующие 10-12 часов), в экспоненциальной фазе, дыхательный коэффициент поддерживают на уровне 2 [гCO₂/гO₂].

В процессе культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae проводят подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) с добавлением в него стерильного 10% водного раствора проксанола в концентрации 0,0075 г/л, возвращая содержание сахара в питательной среде к начальному значению.

При достижении концентрации дрожжевых клеток, равной 2000 млн/мл, дрожжевую культуру направляют на следующую ступень в ферментер объемом 500 литров и ведут процесс в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 5%, аналогично предыдущей степени.

На последней ступени культивирования при достижении концентрации дрожжевых клеток 2000 млн/мл дрожжи выдерживают в питательной среде с содержанием сахара 5% в течение 2,5 часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента равным 27 [гСO₂/гO₂], для переключения дрожжевых клеток с дыхательного на анаэробный тип жизнедеятельности.

Качество выращенных дрожжей - хорошее.

Пример 4. Культивирование дрожжей ведут так же, как и в примере 3, но без добавления неионогенного ПАВ - проксанола. Концентрация дрожжевых клеток составляет 1700 млн/мл. Качество дрожжей - хорошее.

Дрожжи, полученные по примерам 1-4, обладают высокой бродильной активностью и хорошим качеством. При выборе запредельных границ концентраций ПАВ, значений дыхательного коэффициента, процентного содержания сахара в питательной среде, значений времени выдержки на последней ступени культивирования поставленная задача (уровень концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн/мл) не обеспечивается, чем и обусловлен выбор предельных значений данных параметров.

Концентрация и качество дрожжей по примерам 1-4 представлены в табл.1.

Таблица 1 Показатели Примеры 1 2 3 4 По прототипу Концентрация клеток дрожжевой культуры на каждой ступени культивирования, млн/мл 1500 1700 2000 1700 500-1000 Качество выращенных дрожжей на последней ступени хорошее хорошее хорошее хорошее хорошее

Таким образом, предлагаемый способ культивирования дрожжей позволяет вырастить чистую дрожжевую культуру в любых объемах путем последовательного пересева с предыдущей ступени на последующую, к тому же с высокой концентрацией дрожжевых клеток 1500-2000 млн/мл и хорошим качеством дрожжей. Заявленный способ прост в технологическом исполнении, питательная среда, используемая в способе, содержит основной компонент - продукт декантации послеспиртовой барды, являющейся отходом спиртового производства.

Предлагаемое изобретение «Способ культивирования дрожжей для спиртового производства» по сравнению с прототипом обеспечивает увеличение концентрации спиртовых дрожжей до 2000 млн/мл с хорошим качеством.

Способ предусматривает культивирование дрожжей в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%. В качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло. Культивирование ведут с подпиткой стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4-6%. В культуральную жидкость при достижении в ней концентрации дрожжевых клеток 700 млн кл./мл вносят неионогенный ПАВ - проксанол в количестве 0,005-0,01 г/л. Осуществляют управление аэрацией и перемешиванием по дыхательному коэффициенту дрожжей. Дыхательный коэффициент поддерживают в период лаг-фазы в пределах 3,5-10 [гСО₂/гО₂], в период экспоненциальной фазы - в пределах 1,5-2,5 [гСО₂/гО₂], на последней ступени культивирования в пределах 20-35 [гCO₂/гO₂], выдерживая культуральную жидкость в течение 2-3 ч. Культивирование ведут до достижения концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн кл./мл. Способ позволяет получить дрожжи с высокой концентрацией клеток 1500-2000 млн кл./мл и с высокой бродильной активностью. 1 табл.

Способ культивирования дрожжей для спиртового производства в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6% с использованием в качестве питательной среды продукта декантации послеспиртовой барды и сусла, с подпиткой в процессе культивирования дрожжей стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4-6% и ведением культивирования до достижения заданной концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени, культивирования, отличающийся тем, что при культивировании дрожжей в культуральную жидкость при достижении в ней концентрации дрожжевых клеток 700 млн кл./мл вносят неионогенный ПАВ - проксанол в количестве 0,005-0,01 г/л, осуществляют управление адрацией и перемешиванием по дыхательному коэффициенту дрожжей, поддерживая его в период лаг-фазы в пределах 3,5-10 [гСО₂/гО₂], в период экспоненциальной фазы роста - в пределах 1,5-2,5 [гСО₂/гО₂] и на последней ступени культивирования культуральную жидкость выдерживают в течение 2-3 ч, поддерживая значение дыхательного коэффициента в пределах 20-35 [гСО₂/гО₂], до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн кл./мл.