СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/16 C12N13/00 

Изобретение относится к способам культивирования дрожжей и получения синтезируемого ими метаболита - этанола.

Известен способ культивирования дрожжей для спиртового производства [1]. Предлагаемый способ ставит целью получение чистой дрожжевой культуры с высокой концентрацией дрожжевых клеток и высокой бродильной активностью. Культивирование ведут в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло или сахарозу до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 500-1000 млн/мл, после чего культуральную жидкость последней ступени выдерживают в анаэробных условиях в течение 2-3 ч, в процессе культивирования ведут подпитку стерильным суслом или раствором сахарозы в продукте декантации послеспиртовой барды до содержания сахара в питательной среде 4-6%.

Известен также способ [2] ведения ферментационного процесса, в котором биомассу дрожжей готовят в хемостатном аэробном процессе, достигая высокой концентрации клеток - 19 г/л.

Биомассу, подготовленную по этим вариантам, используют в анаэробном процессе.

Недостатками способов является экстенсивный в основном подход к подготовке посевного материала для анаэробного процесса, связанный с повышением концентрации дрожжевых клеток, не приводятся подробные физиологические показатели ведения анаэробного процесса, не уделяется должное внимание поддержанию высокой физиологической активности клеток в течение всего анаэробного процесса, анаэробные процессы ведутся с высокой концентрацией биомассы, хотя удельная бродильная активность их мала.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения биомассы дрожжей, который можно использовать для подготовки посевного материала анаэробного процесса, включающий культивирование дрожжей на углеводсодержащем субстрате в присутствии пероксида водорода с предварительной адаптацией клеток дрожжей к пероксиду водорода [3]. Отмечено, что при использовании в микробиологических процессах предварительно адаптированных к пероксиду водорода микроорганизмов происходит повышение бродильной активности (до 10-20%) по скорости сбраживания.

Недостатком способа является недостаточная воспроизводимость положительного эффекта и игнорирование режимов аэрации при подготовке посевного материала.

Задачей изобретения является получение биомассы дрожжей с воспроизводимо высокой физиологической активностью с целью интенсификации процесса брожения и поддержание высокой физиологической активности культуры в течение анаэробного процесса.

Поставленная задача решается тем, что для подготовки посевного материала проводят адаптацию дрожжей для спиртового производства к стрессовому агенту в аэробных или микроаэрофильных условиях при освещении суспензии выращиваемых дрожжей видимым светом с интенсивностью не менее 40 мВт/л, путем периодических пересевов культуры дрожжей с воздействием стрессового агента, а последующую стадию брожения при засевании подготовленным посевным материалом ведут при уровне освещения не менее 40 мВт/л.

В настоящем изобретении культивирование дрожжей проводили в колбах на качалке и в биореакторе.

Объектами экспериментов являлись дрожжи Saccharomyces cerevisiae штаммы SL-100 и Meyen расы Т 985. При культивировании оптимальная температура для роста дрожжей S. cerevisiae 28-30°C, рН от 3,0 до 6,0.

Эксперименты с дрожжами в колбах 250 мл при объеме среды 50 мл проводились на термостатируемой качалке с числом оборотов 220 об/мин при начальном значении рН среды 5,5. Компоненты среды стерилизовали при 0,5 ати в автоклаве в течение 30 мин. Посевной материал составлял 10 об.%, Н₂O₂ (пергидроль) вносили в различные фазы роста в количестве 0,15-1,2 г/л. В ряде экспериментов вместо Н₂О₂ использовали облучение дрожжей мягким ультрафиолетом - 100-400 Дж/л в течение 5 сек. Время культивирования составляло 24-28 часов.

Состав среды для культивирования дрожжей S. cerevisiae, г/л: (NH₄)₂SO₄ - 5,0, КН₂РO₄ - 1,0, КСl - 0,15, MgSO₄·7H₂O - 0,2 г/л, CaCl₂ - 0,05 г/л, дрожжевой экстракт - 0,5, сахароза - 30 или 150, вода - водопроводная, рН 5,8.

Опыты в лабораторном биореакторе с обечайкой из стекла, рабочим объемом 3 л проводили в режиме глубинного культивирования в стерильных условиях с автоматическим контролем рН, рO₂, Т. Компоненты среды стерилизовали при 0,5 ати в автоклаве в течение 30 мин. Посевной материал составлял 10 об.%. Облучение мягким УФ осуществлялось через выносной контур с кварцевой кюветой.

Колбы и биореактор освещали лампами дневного света, интенсивность освещения определяли с помощью люксметра - УФ-радиометра ТКА-01/3. В вариантах культивирования без освещения содержимое колб или биореактора экранировалось от видимого света светонепроницаемым материалом. В колбах путем ведения последовательных пассажей (пересевов) в асептических условиях в зависимости от исследуемых факторов получали линии дрожжей при различном освещении и без освещения среды, в аэробных, микроаэрофильных или анаэробных условиях, при внесении разных концентраций Н₂O₂ в среду культивирования, при разном содержании дрожжевой биомассы и субстрата (сахарозы) в ферментационной среде.

В предварительных опытах на колбах в различных режимах при начальной концентрации субстрата 30 г/л были определены дозы внесения пероксида - 0,3-0,6 г/л и воздействия мягкого ультрафиолета 200-250 Дж/л в течение 5 сек, при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л, остаточной концентрации субстрата <5 г/л, при этом не происходило полного вьмирания культуры. С воздействием найденных сублетальных доз стрессовых воздействий были проведены серии пассажей.

Параметры, найденные выше, не являются определяющими. Так, для другого штамма S. cerevisiae необходима другая доза H₂O₂ или мягкого УФ, при другой концентрации биомассы, культивирование может происходить при другой начальной концентрации субстрата. Нахождение сублетальных доз стрессовых воздействий - индивидуально для каждой культуры дрожжей. Общими определяющими параметрами служат режимы аэрации и освещения при проведении процессов.

Следующие примеры иллюстрируют сущность изобретения.

Пример 1

Подготовка посевного материала

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,6 г/л или воздействии мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 сек, при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л при освещении видимым светом интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л в аэробном режиме.

Пример 2

Подготовка посевного материала

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,6 г/л или воздействии мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 сек, при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л при освещении видимым светом интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л в микроаэрофильном режиме.

Пример 3

Подготовка посевного материала

Ведение пассажей (пересевов) в колбах при внесении пероксида 0,6 г/л или воздействии мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 сек., при содержании дрожжевых клеток в среде культивирования 2,2-2,4 г/л при освещении видимым светом интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л в анаэробном режиме.

Примеры 4-6

Подготовка посевного материала

То же, что в примерах 1-3, но без освещения.

Примеры 7-9

Подготовка посевного материала

То же, что в примерах 1-3, но при освещении видимым светом интенсивностью 30 мВт/л.Сравнение доли мертвых клеток различных вариантов ведения пассажей (пересевов) с контрольным вариантом без воздействия стрессового агента по окончании культивирования приведено в табл.1. Контрольные варианты велись для каждого примера, и результаты оказались идентичными, поэтому контрольный вариант в табл.1 представлен одной строкой.

Таблица 1 N примера 1-й пассаж 5-й пассаж 10-й пассаж 1 60-70% 30-35% 25-30% 2 60-65% 30-35% 25-30% 3 85-90% 90-95% 90-95% 4 85-90% 70-75% 70-75% 5 85-90% 70-74% 70-75% 6 90-95% 95-100% 95-100% 7 70-75% 60-65% 55-60% 8 65-70% 55-60% 50-65% 9 85-90% 90-95% 90-95% Контроль 30-35% 30-35% 30-35%

Видно, что в анаэробных условиях клетки не адаптируются к стрессору (примеры 3, 6, 9).

Доля мертвых клеток, подвергнутых действию пероксида либо мягкого УФ в аэробных либо микроаэрофильных условиях, при последующем нахождении в темноте составляет более 85% соответственно для 1-го пассажа. Без освещения доля мертвых остается высокой и к 10-му пассажу примерно 75% (примеры 4, 5).

При освещении же среды доля мертвых клеток падает до уровня в контроле (без воздействия стресс-фактора) уже к 5-му пассажу для аэробных и микроаэрофильных условий (примеры 1,2). При этом возрастание интенсивности освещения выше 40 мВт/л не сказывается существенно на выживаемости и скорости адаптации клеток. Таким образом, достаточно рассеянного света с интенсивностью 40 мВт/л, чтобы восстановить жизнеспособность клеток. Свет в данном случае выступает как антистрессор, помогающий клеткам дрожжей преодолевать последствия окислительного стресса, вероятно, через механизм фоторепарации. Снижение уровня освещения видимым светом ниже 40 мВт/л приводит к росту доли мертвых клеток (примеры 7,8 по сравнению с примерами 1, 2).В примерах 1, 2 наблюдается также явная корреляция между падением доли мертвых клеток, уменьшением лаг-фазы, увеличением удельной скорости роста и устойчивостью к рН (с приобретением устойчивости к Н₂О₂ либо мягкому УФ клетки становятся устойчивыми к более низким рН) по мере пересевов в линиях со стрессовыми воздействиями, т.е. наблюдается адаптация популяции к стрессору с изменением показателей культивирования в благоприятную сторону, при этом повышается и устойчивость клеток к внесению повышенных доз Н₂О₂ либо воздействию мягкого УФ: адаптированные клетки выдерживают внесение 1,8-2,4 г/л пероксида, тогда как в контрольном варианте клетки полностью погибают при внесении 1,2 г/л пероксида.

Опыты в реакторе с ведением линий примеров 1 либо 2 показали падение доли мертвых клеток в середине экспоненциальной фазы с 8-10% в контроле, до 4-5% в 5-ом и 10-ом пассажах (пересевах), лаг-фаза уже к 5-му пассажу уменьшилась примерно в 2 раза. Добавление пероксида водорода приводит к лизису клеток в контрольном варианте: на момент окончания опыта после воздействия стрессора доля мертвых клеток достигает 65-70%, уровень биомассы падает на 35-40% по сравнению с тем же вариантом без внесения пероксида. При культивировании же адаптированных дрожжей наблюдается даже некоторое увеличение выхода биомассы после воздействия стрессора. К концу опыта после внесения, например, пероксида водорода при культивировании дрожжей 5-го пассажа доля мертвых клеток составляет 30-35%, а 10-го пассажа- 20-25%.

Пример 10

Подготовка посевного материала

Как и при культивировании в колбах, при выращивании адаптированных к пероксиду или мягкому УФ линий дрожжей в реакторе для возникновения физиологически благоприятных изменений важно освещение содержимого ферментационной среды видимым светом интенсивностью не менее 40 мВт/л. В темноте после внесения Н₂О₂ 0,6 г/л или воздействия мягкого УФ 250 Дж/л в течение 5 с к концу культивирования доля мертвых клеток составляла 70-75%, а на свету 30-35%, что происходило при культивировании адаптированных дрожжей 5-го и 10-го пассажей примеров 1,2 в аэробных или микроаэрофильных условиях.

Посевной материал примеров 1,2 после адаптации к пероксиду или мягкому УФ при освещении видимым светом не менее 40 мВт/л можно использовать в качестве посевного для анаэробного культивирования в биореакторе.

Все варианты анаэробного культивирования в биореакторе велись при концентрации субстрата (сахарозы) 150 г/л. Посевной материал составлял 10 об.%.

Пример 11

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята неадаптированных дрожжей (контрольный вариант) при освещении интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л и без него.

Пример 12

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята дрожжей 5-го пассажа примеров 1,2 при освещении интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л.

Пример 13

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята дрожжей 10-го пассажа примеров 1,2 при освещении интенсивностью 40 мВт/л, 90 мВт/л, 150 мВт/л, 220 мВт/л, 400 мВт/л, 500 мВт/л, 700 мВт/л, 1000 мВт/л.

Пример 14

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование без освещения при использовании в качестве инокулята дрожжей примера 10 (после внесения Н202 в аэробном или микроаэрофильном режимах и культивировании в темноте).

Пример 15

Анаэробное культивирование

Анаэробное культивирование при использовании в качестве инокулята дрожжей, подготовленных по прототипу в условиях изменения освещенности лабораторного помещения естественным видимым светом при смене дня и ночи.

Таблица 2 N примера Удельная скорость роста, ч^-1 % мертвых в середине эксп. фазы % мертвых в конце эксперимента Наибольшая бродильная активность (мл СO₂/л·ч) Время брожения, ч Выход спирта, % Выход биомассы, г/л 11 0,046 15-20% 75% 680-700 73 6,2-6,4 4 (контроль)               12 0,059 10-12% 60-65% 880-900 57 6,2-6,4 4,1 13 0,067 8-10% 60-65% 980-1000 52 6,2-6,4 4,2 14 0,044 40-45% 90-95% 480-500 93 4,0-4,1 2,2 15 0,05-0,06 10-15% 65-70% 830-850 59 6,2-6,4 4,1

Исследование роли освещения и аэрации при подготовке посевного материала и освещения при анаэробном культивировании позволило предложить новый вариант ведения процесса спиртового брожения по сравнению с прототипом (пример 15), в котором при подготовке посевного материала вышеозначенные параметры не учитывались.

Таким образом, показана возможность существенного улучшения показателей роста дрожжевых культур и процесса спиртового брожения при сочетанном воздействии на дрожжи дозами стрессорных факторов (пероксида водорода или мягкого ультрафиолета) и антистресс-фактором, в частности видимым светом, что позволяет предложить новый способ ведения процесса спиртового брожения. По предлагаемому способу для поддержания высокой физиологической активности дрожжей-сахаромицетов посевной материал получают при росте дрожжей в аэробных или микроаэрофильных условиях и совместном воздействии видимого света и Н₂О₂ или мягкого ультрафиолета диапазона УФА/УФБ при пассивировании (пересевах) культуры.

Предложенный способ позволяет поддерживать высокую физиологическую активность клеток дрожжей и способствует повышению производительности процесса - сокращению времени брожения на 30% по сравнению с контролем, и на 12% по сравнению с прототипом.

Литература

1. Патент РФ N 2136746 Способ культивирования дрожжей для спиртового производства, приоритет 17.08.1998.

2. Патент WO 2007038833 ETHANOL FERMENTATION PROCESS AND PRODUCTS, приоритет 03.10.2005.

3. Патент РФ N 2268924 Способ получения биомассы дрожжей, приоритет 23.11.2004.

Способ включает подготовку посевного материала и стадию брожения. Для подготовки посевного материала проводят адаптацию дрожжей к стрессовому агенту в аэробных или микроаэрофильных условиях при освещении видимым светом 40-90 мВт/л путем периодических пересевов. Брожение осуществляют при использовании подготовленного посевного материала и уровне освещения 40-90 мВт/л. Способ обеспечивает высокий выход биомассы дрожжей. Выход биомассы дрожжей составляет 2,2-4,2 г/л. 2 табл.

Способ культивирования дрожжей для спиртового производства, включающий подготовку посевного материала и стадию брожения, отличающийся тем, что для подготовки посевного материала проводят адаптацию дрожжей к стрессовому агенту в аэробных или микроаэрофильных условиях при уровне освещения видимым светом 40-90 мВт/л путем периодических пересевов культуры дрожжей с воздействием стрессового агента, а последующую стадию брожения при засевании подготовленным посевным материалом ведут при уровне освещения 40-90 мВт/л.