СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА Советский патент 1969 года по МПК C12P13/22 

Известны способы получения L-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его дрожжей штамма Candida utilis 295 в водно питательной среде, содерл ащей источник углевода, с добавлением необходимых для роста минеральных солей фосфора, магния, кальция, азота в присутствии антраниловой кислоты как предшественника триптофана, с последующим выделением триптофана из культуральной жидкости одним из известных способов. Предлагаемый способ сокращает процесс и увеличивает выход L-триптофана. Для этого процесс выращивания L-т.ри.птофана ведут в две стадии. В первой стадии производят максимальное накопление биомассы при аэрации среды, а во второй - непосредственный биосинтез L-триптофана при снижении расхода кислорода воздуха и дробном добавлении антраниловой кислоты как предшественника триптофана. Для интенсификации процесса желательно первую стадию проводить при интенсивности аэрации не ниже 120 мг .мин, температуре 28-30°С и рН среды 7,5-8,0, а вторую - при интенсивности аэрации 60-80 мг .мин, той же температуре и том же значении рН. С целью получения L-тpИlПтoфaнa для кормовых целей полученную культуральную жидкость после окончания процесса выращивания можно обезвоживать одним из известных способов. Для уменьшения объема культуральной жидкости, полученной в процессе выращивания, и 110,вышеция концентрации L-трцптофана цосле первой стадии целесообразно концентрировать биомассу одним из известных способов, например сепарированием, а микробную суспензию антисептировать, например, при помощи этилового спирта с последующим разбавлением стерильной средой. Сущность способа состоит в следующем. Культуру Candida utilis 295 поддерживают на скошенном сусло-агаре. Готовят питательную среду в следующем составе: Меласса85,0 г/47,2% (сахара) Фосфат калия двузамещенный 0,1 г Сульфат магния0,05 „ Хлористый кальций0,1 „ Мочевина5,0 ,, Водадо 1 л

Candida utilis 295 с сусло-агарового «осяка переносят в колбы круговой качалки для размножения культуры, после чего максимальное накопление биомассы - первую стадию - проводят в заранее простерилизованных ферментаторах с питательной средой для осуществления глубинного культивирования. Количество засевного материала при последовательных посевах составляет не менее 8% абсолютно сухой биомассы от концентрации перерабатываемого сахара. Температура ферментации 28-30°С, рН 7,5-8,0. Интенсивность аэрации не менее 120 мг Qz/л.мин (л о сульфитному методу). После размножения необходимого количества биомассы (не менее 18 г/л абсолютно сухого вещества дрожжей) ведут вторую стадию процесса - биосинтез Ь-трИ1Птофана.

К дрожжевой суспензии равномерными порциями добавляют 40% по объему раствора мелассы или глюкозы с содержанием 2% сахара. Длительность интервала подачи раствора при периодическом процессе 6-24 час. К суспензии через 0,5-2 час после каждой задачи сахара порциями добавляют 0,3-0,4% антраниловой кислоты в виде 5%-ного спиртового раствора или 5%-ного водного раствора антранилата натрия и 0,8-0,9% мочевины в виде водного раствора, рН культуральной жидкости во время процесса поддерживают 7,5-8,0, температуру 28-30°С, интенсивность аэрации 60-80 мг 0-2/л.мин. Общая продолжительность ферментации 6-8 суток.

Культуральную жидкость сепарируют из фугата при помощи ионнообменных смол, выделяют Ь-триптофа« в кристаллическом виде. Выход продукта в неочищенном виде 90%, после перекристаллизации 65-70%.

Пример. Пример составлен для работы в 100-литровом ферментаторе. Активный штамм дрожжей Candida utilis 295 сохраняют на скощенном сусло-агаре и пересевают один раз в месяц. После пересева выдерживают 48 час ,в термостате при 28-30°С, а затем сохраняют в холодильнике. Далее проводят подготовку посевного материала для ферментации. Культуру смывают с косого агара в пробирку 3 мл стерильной ниже указанной средой и высевают на чащки с сусло-агаром по 0,1-0,2 мл на чащку, размазывают шпателем и выдерживают в термостате при 28-30°С 48 час. Выросшие на сусло-агаре дрожжи снимают с поверхности чашек стеклянной лопаточкой и переносят в колбу со стерильной средой. Полученную густую суспензию дрожжей с соблюдением условий стерильности переносят в количестве 15-20 мл в конические колбы емкостью 250 мл, содержащие по Q мл питательной среды следующего состава (в г1л): меласса 104, мочевина 5, КгПРО 0,1; MgSOi 0,05, CaClg 0,1, рН 7,5-8,0. Колбы выдерживают на качалке 24 час при 28-30°С. После 24 час выращивания содержимое колб в стерильных условиях переносят в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие по 100 мл питательной среды вышеуказанного состава.

На качалке колбы выдерживают 24 час при 28-30°С. После 24 час выращивания на качалке биомасса дрожжей используется для дальнейшего накопления дрожжевой массы в ферментаторе.

Процесс ферментации в ферментерах проводят следующим образом. Производственную питательную среду следующего состава (в г/л): меласса 62,3, мочевина 5, К2ИРО4 0,1,

СаСЬ 0,1, M.gSO4 0,05 стерилизуют при 1 атм 30 мин, рН среды 7,5-8,0.

После охлаждения до 30°С туда в стерильных условиях переносят посевной материал, который составляет не менее 3-5 г/л сухого

вещества. В ферментере в течение 24 час дрожжи культивируются при аэрации не менее 120 мг Oz/л.мин.

В качестве пеногасителя можно использовать подсолнечное масло, кашалотовый жир

или кремнийорганическое соединение.

Через 24 час в культуральную жидкость добавляют антраниловую кислоту в виде 5%ного спиртового раствора в количестве 175 мл и мочевину в виде 50%-лого раствора 50 мл.

После доОавки антраниловой кислоты начинается вторая стадия ферментации - биосинтез L-триптофана. Уровень аэрации снижается до 50 мг О-2/л.мин. По-сле добавления в среду антраниловой кислоты или мочевины через

4 час добавляют мелассу в виде 25%-кого раствора до 840 мл. Па дальнейшем этапе ферментации добавки проводят в следующем порядке: мелассный раствор добавляют через каждые 12 час ферментации, антраниловую

кислоту одновременно с источником азота добавляют через каждые 6 час ферментации. Все растворы добавляются по вышеуказанным количествам.

Через 144 час ферментацию прекращают.

Биомассу отделяют, культуральную жидкость используют для выделения кристаллического триптофана.

Предмет изобретения

1. Способ получения Ь-трилтофааа путем глубинного выращивания продуцирующих его дрожжей штамма Candida utilis 295 в водной (Питательной среде, содержащей источник углевода, с добавлением необходимых для роста минеральных солей фосфора, магния, кальция, азота в присутствии антраииловой кислоты как предшественника триптофана, с последующим выделением L-троптофана из культуральной жидкости одним из известных способов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода L-T;pИlПтoфaнa и .сокращения времени для его .получения, выращивание дрожжей ведут в две стадии, в первой из которой производят максимальное накопление биомассы при аэрации среды, а во второй - непосредственный биосинтез L-триптофана при снижении расхода кислорода воздуха и дрО|бном добавлении антраниловой кислоты 5 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, первую стадию проводят при интенсивности аэрации не ниже 120 мг .мин, а вторую - три интенснвности аэрации 60-80 мг .мин.5 6 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что первую стадию проводят при температуре 28-30°С и рН среды 7,5-8,0, а вторую - при той же температуре и том же значении рН.