СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СИСТЕМНОГО АМИЛОИДОЗА И ЕГО НЕФРОПАТИЧЕСКОЙ ФОРМЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/15 A61P13/12 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для профилактики и лечения амилоидоза и его нефропатической формы.

Амилоидоз - стромально-сосудистый диспротеиноз, характеризующийся отложением в тканях и органах аномальных фибриллярных белков, предшественников амилоида - сложного гликопротеина. Выраженный амилоидоз приводит к атрофии и склерозу органов, что сопровождается развитием их функциональной недостаточности (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann Ital Med Int. 1991 Jan-Mar; 6(1 Pt2):107-16.).

Одним из проявлений генерализованного амилоидоза является амилоидоз почек с яркой клинико-морфологической и нозологической спецификой. Микроскопически в почках амилоид обычно обнаруживается по ходу прямых сосудов и собирательных трубок. В интермедиарной зоне и пирамидах строма пропитывается белками плазмы. Амилоид откладывается не только в пирамидах, но и в клубочках. (Tinaztepe К. Renal amyloidosis in childhood. An overview of the topic with 25 years experience. // Turk J Pediatr. 1995 Oct-Dec; 37(4):357-73.).

Клиническим выражением морфологических изменений при амилоидной нефропатии считают мочевой синдром, характеризующийся протеинурией, цилиндрурией, микрогематурией, лейкоцитурией (Тареев Е.М., 1958; Ковалив Б.М., 1970). Помимо мочевого синдрома выявляются изменения фильтрационно-реабсорбционных процессов в почках, нарушается электролитный баланс, возникает гипонатриурия и гипокалиурия (Ковалив Б.М., 1970), сопровождающиеся задержкой жидкости. Смерть больных при амилоидозе почек наступает обычно вследствие хронической почечной недостаточности и уремии в финальной стадии заболевания.

В связи с этим возникла насущная необходимость создания и разработки способов профилактики и лечения амилоидоза и его нефропатической формы.

Специфическое лечение амилоидоза не разработано, что связано с отсутствием окончательных представлений об этиологии и патогенезе этого заболевания.

Известен способ лечения вторичного амилоидоза почек диметилсульфоксидом, взятый нами за аналог (Loffler HJ, Brass H, Thoenes W, Linke RP. Familial Mediterranean fever with amyloidosis. Recent pathogenetic and therapeutic aspects // Dtsch Med Wochenschr. 1983 Feb 11; 108(6):210-5.; Murav'ev IuV The efficacy of dimethyl sulfoxide in secondary amyloidosis in patients with rheumatic diseases // Revmatologia (Mosk). 1990 Jan-Mar; (1):4-8.).

Недостатками аналога является то, что в ряде случаев диметилсульфоксид может вызывать фатальные аритмии сердца (Zenhausern R, Tobler A, Leoncini L, Hess ОМ, Ferrari P. Fatal cardiac arrhythmia after infusion of dimethyl sulfoxide-cryopreserved hematopoietic stem cells in a patient with severe primary cardiac amyloidosis and end-stage renal failure. // Ann Hematol. 2000 Sep; 79(9):523-6.). Некоторые авторы считают сомнительным лечебный эффект диметилсульфоксида при амилоидозе (Gruys E, Sijens RJ, Biewenga WJ. Dubious effect of dimethylsulphoxide (DMSO) therapy on amyloid deposits and amyloidosis. // Vet Res Commun. 1981 Sep; 5(1):21-32.).

Известен способ профилактики и лечения амилидоза почек (Sobh M, Moustafa F, Hamed S, Ghoneim M. Effect of colchicine on schistosoma-induced renal amyloidosis in Syrian golden hamsters. // Nephron. 1995; 70(4):478-85.), заключающийся в применении колхицина, назначаемого длительно (до 5 лет и более) по 1 мг в сутки, который был взят нами за прототип как наиболее близкий способ.

Недостатком прототипа является то, что колхицин обладает антимитотической активностью, оказывает кариокластическое действие, влияет угнетающе на лейко- и лимфопоэз, могут появиться тошнота и рвота. В случае передозировки возможно сильное угнетение кроветворения. Возможны также понос и временная алопеция, появление примеси крови в рвотных массах и дегтеобразный стул. В процессе лечения колхицином периодически необходимо проводить исследование кала на скрытую кровь. Препарат противопоказан при почечной и печеночной недостаточности, гнойных заболеваниях, беременности (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - Харьков «Торсинг», 1998. С.463). В ряде случаев развивается вакуольная рабдомиопатия и некротическая миопатия (Fernandez С, Figarella-Branger D, Alla P, Harle JR, Pellissier JF. Colchicine myopathy: a vacuolar myopathy with selective type I muscle fiber involvement. An immunohistochemical and electron microscopic study of two cases. // Acta Neuropathol (Berl). 2002 Feb; 103(2):100-6. Epub 2001 Dec 01.; Himmelmann F, Schroder JM. Colchicine myopathy in a case of familial Mediterranean fever: immunohistochemical and ultrastructural study of accumulated tubulin-immunoreactive material. // Acta Neuropathol (Berl). 1992; 83(4):440-4; Stefanidis I, Bohm R, Hagel J, Maurin N. Toxic myopathy with kidney failure as a colchicine side effect ifn familial Mediterranean fever // Dtsch Med Wochenschr. 1992 Aug 14; 117(33):1237-40.). Описаны также случаи мионейропатии у детей при лечении колхицином (Harel L, Mukamel M, Amir J, Straussberg R, Cohen AH, Varsano I. Colchicine-induced myoneuropathy in childhood. // Eur J Pediatr. 1998 Oct; 157(10):853-5.). Колхицин малоэффективен при выраженном амилоидозе почек (Mery JP. The curative effect of colchicine in renal amyloidosis cannot currently be held to have been proven. // Presse Med. 1984 Nov 3; 13(39):2393; Lagrue G, Koeger AC, Benaym JC, Sobel A. Colchicine treatment of renal amylosis in familial paroxysmal polyserositis. // Ann Med Interne (Paris). 1981; 132(7):496-500.).

Длительное применение этих синтетических препаратов может вызвать различные побочные эффекты: расстройства ЖКТ, аллергические реакции, лейкопению, тромбоцитопению, мионейропатию, рабдомиолиз, вызывать нарушение обменных процессов, что затрудняет их длительное и профилактическое применение.

В связи с этим, целью нашей работы явилась разработка эффективного способа профилактики и лечения амилоидоза и его нефропатической формы на основе экспериментальных исследований.

Нами предпочтение было отдано уникальному по своим фармакологическим свойствам и широте использования милдронату, представляющему собой азоаналог γ-бутиробетаина - предшественника карнитина. Милдронат ингибирует γ-бутиробетаингидроскилазу (фермент, ответственный за синтез карнитина) карнитинацилтрансферазу - фермент, определяющий образование комплекса карнитин - активированные жирные кислоты, что обусловливает снижение синтеза карнитина, выключение β-окисления жирных кислот, стимуляцию гликолиза и усиление продукции, а также накопление эндогенного γ-бутиробетаина во всех клетках. Переключение с аэробного типа энергоснабжения на анаэробный предотвращает накопление детергентных продуктов незавершенного β-окисления жирных кислот. Под влиянием милдроната в ЦНС увеличивается содержание ГАМК и снижается синтез норадреналина, нормализуется концентрация адреналина, кортизола, тестостерона, АКТГ, Т₃ и Т₄ и стимулируется функциональная активность нейроэндокринной регуляции. Препарат хорошо зарекомендовал себя в качестве средства для профилактики, лечения и улучшения адаптации при запредельных физических и психических нагрузках, а также интоксикациях (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г.,1988; Сутулов Ю.Л., Логунова Л.В., 1999 и др.). По данным некоторых исследователей (Калвиньш И.Я., 1991; Симхович Б.З., Мейрена Д.В., Хаги Х.Б., 1984), милдронат, способствуя расширению микроциркуляторного русла, уменьшает плазматическое пропитывание стенок сосудов, снижая выход плазменных белков в тканевые пространства.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение выраженности амилоидоза путем уменьшения его накопления и улучшения функционального состояния поражаемых органов.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных имеет следующие существенные признаки: животным проводятся подкожные инъекции 10% раствора милдроната из расчета 50 мг/кг в течение 14 дней.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что впервые применяется фармакологический препарат - милдронат с целью профилактики и лечения амилоидоза и его нефропатической формы. Милдронат не оказывает токсического воздействия на организм человека и животных, не имеет нежелательных побочных эффектов. Милдронат предотвращает накопление детегрентных продуктов незавершенного β-окисления жирных кислот, оказывает иммуномодулирующее и цитомембраностабилизирующее действия, повышает устойчивость тканей и органов при токсических воздействиях и гипоксии. Под влиянием милдроната стимулируется функциональная активность нейроэндокринной регуляции. Милдронат, способствуя расширению и стабилизации стенок сосудов микроциркуляторного русла, уменьшает процесс патологического выхода плазменных белков (непосредственных компонентов амилоида) в тканевые пространства, что нарушает один из механизмов патогенеза образования амилоидных масс.

Введение 10% раствора милдроната через день из расчета 50 мг/кг в течение последних 14 дней эксперимента приводит к уменьшению накопления амилоидных масс в органах и тканях, а также улучшению функционального состояния поражаемых патологическим процессом органов, в частности почек экспериментальных животных. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения системного экспериментального амилоидоза и его нефропатической формы проводят подкожные инъекции альбумина по 1 мл через день из расчета на среднюю массу белых мышей самцов в возрасте 5-6 мес - 23,3 г (0,05 мл/г массы тела) в течение 30 дней двум группам животных (№2 и №3) с соблюдением асептики. Одновременно, с 16 дня введения альбумина, группе №3 вводится милдронат 10% раствор в виде подкожных инъекций из расчета 50 мг/кг через день. Группе животных №2 в качестве инъекционного контроля вводится 0,9% раствор натрия хлорида в том же объеме и сроках, что и милдронат мышам группы №3. Группу №1 составляют интактные животные.

По истечении времени эксперимента (1 мес.) для изучения функции почек в условиях спонтанного диуреза животные помещаются в обменные клетки на 6 часов, в течение которых собирается моча. В моче исследуется содержание натрия, калия, кальция, креатинина, белок мочи. Для исследования плазмы на эндогенный креатинин животные забиваются под наркозом в сроки 30-40 дней. Морфологическому исследованию на предмет амилоидоза (окраска гематоксилином, эозином и конго-красным) кроме почек подвергаются селезенка, печень, сердце. Образцы тканей фиксируются в 10% нейтральном формалине, с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго-красным. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.

Полученные результаты патофизиологического и гистологического исследования в группе №3 сравнивали с показателями группы №2 и интактной группы №1.

Пример. Проведены серии опытов из 3-х групп:

1-я группа - интактная (20 белых мышей).

2-я группа (10 мышей) - (амилоидная) - животным проводились подкожные инъекции альбумина по 1 мл через день и 0,9% раствор в качестве инъекционного контроля в течение 30 дней.

3-я группа (10 мышей) - (амилоидная-леченая) - проводились подкожные инъекции альбумина по 1 мл через день в течение 30 дней и 10% раствора милдроната, вводимого животным п/к из расчета 50 мг/кг в течение последних 14 дней эксперимента.

Для изучения функции почек в условиях спонтанного диуреза животные помещались в обменные клетки на 6 часов, в течение которых собиралась моча. В моче исследовалось содержание натрия, калия, кальция, креатинина, белка. Для исследования плазмы на эндогенный креатинин животные забивались под наркозом в сроки 30-40 дней. Морфологическому исследованию на предмет амилоидоза (окраска конго-красным) кроме почек подвергнуты селезенка, печень, сердце.

В результате проведенных исследований получены клинико-морфологические и патофизиологические доказательства эффективности применения милдроната для профилактики и комплексной терапии амилоидоза.

Гистологически у 2-й группы мышей в почках амилоид обнаруживался по ходу прямых сосудов и собирательных трубок. В интермедиарной зоне и пирамидах строма пропитывалась белками плазмы. Амилоид откладывался не только в пирамидах, но и в клубочках. Изменения клубочков состояли в утолщении и двухконтурности мембран и капилляров, просветы которых аневризматически расширены с резко выраженным плазматическим пропитыванием стенок. Амилоидные отложения обнаруживались во многих капиллярных петлях большинства клубочков, в артериолах и артериях, по ходу собственной мембраны канальцев. Цитоплазма эпителия канальцев, в большей степени проксимальных, и просветы канальцев заполнены белковыми гранулами. В селезенке амилоид откладывался перифолликулярно, отмечалась гиперплазия лимфоидной ткани. В печени амилоид откладывался преимущественно в центрах долек вокруг сосудов. Миокард на данных сроках эксперимента был свободен от конгофильных отложений.

У животных 3-й группы отмечались аналогичные патоморфологические изменения, однако они были выражены значительно меньше и соответствовали более ранней стадии заболевания.

При исследовании основных показателей функции почек (Таблица 1) у 2-й группы мышей выявлены следующие достоверные (р<0,05) изменения. Уровень спонтанного диуреза достоверно снизился на 52% по сравнению с контролем.Клубочковая фильтрация достоверно снизилась на 87%. Канальцевая реабсорбция достоверно уменьшилась на 6,7%. Экскреция Na⁺, K⁺ и Са⁺ также достоверно снизились на 46,5%, 52% и 68% соответственно. Резко увеличился уровень протеинурии более чем в 15 раз по сравнению с контролем.

У животных 3-ей группы мышей выявлены следующие достоверные (р<0,05) изменения. Уровень диуреза достоверно снизился на 25% по сравнению с контролем, а по сравнению со 2-ой группой достоверно увеличился на 55%. Клубочковая фильтрация достоверно снизилась на 60% относительно контроля, а по сравнению со 2-ой группой достоверно увеличилась в 2 раза. Канальцевая реабсорбция достоверно уменьшилась на 2,3% относительно контроля, а по сравнению со 2-ой группой достоверно увеличилась на 4,7%. Экскреция Na⁺, K⁺ и Са⁺ также достоверно снизились на 14%, 16% и 26% относительно контроля. По сравнению со 2-ой группой экскреция Na⁺ K⁺ достоверно увеличилась на 61% и 76% соответственно. При этом отмечалось недостоверное (р=0,317) снижение экскреции Са⁺⁺ на 17,3% по сравнению с группой экспериментального амилоидоза. Увеличился уровень протеинурии более чем 9 раз относительно контроля, а по сравнению со 2-ой группой достоверно уменьшился на 32,7%.

На фоне применения милдроната отмечается существенное восстановление морфо-функционального состояния почек, пораженных амилоидозом, в частности достоверно улучшаются нарушенные клубочковая фильтрация, канальцевая реабсорбция, экскреция Na⁺ и К⁺ повышается диурез, что объясняется многофакторными положительными фармакологическими свойствами данного лекарственного препарата. Милдронат предотвращает накопление детергентных продуктов незавершенного β-окисления жирных кислот, оказывает иммуномодулирующее и цитомембраностабилизирующее действия, повышает устойчивость тканей и органов при токсических воздействиях и гипоксии. Под влиянием милдроната стимулируется функциональная активность нейроэндокринной регуляции. Милдронат, способствуя расширению и стабилизации стенок сосудов микроциркуляторного русла, уменьшает процесс патологического выхода плазменных белков (непосредственных компонентов амилоида) в тканевые пространства, что нарушает звенья патогенеза образования амилоидных масс.

Исходя из указанных положительных многофакторных свойств милдроната и полученных результатов исследования обосновывается использование препарата для коррекции структурно-функциональных нарушений почек не только при экспериментальном амилоидозе почек, но и в клинической практике.

Таблица 1
Лечебно-профилактическое влияние милдроната на функциональное состояние почек при экспериментальном амилоидозеПоказатели, единицы измеренияПолученные данные, М±mГр. №1 (контроль)Гр. №2 (альбумин)Гр. №3 (альб.+милдр.)Диурез, мл/час·10 г массы тела0,02048±0,0006520,009914±0,0003710,01538±0,000492Клубочковая фильтрация, мл/час·10 г массы тела0,8366±0,0207740,112285±0,0069920,3348±0,020373Канальцевая реабсорбция, %97,527±0,04284591±0,28535795,296±0,417152Экскреция Na⁺, ммоль/час·10 г массы тела3,195±0,0848821,71±0,2058802,758±0,179677Экскреция К⁺, ммоль/час·10 г массы тела0,7733±0,0391320,3678±0,0209000,6468±0,022186Экскреция Са++, ммоль/час·10 г массы тела0,0140±0,0006400,0045±0,0003020,00372±0,000645Протеинурия, мг/мл0,0705±0,0039731,092±0,0566920,735±0,066144

Из вышеизложенного следует, что лечебно-профилактическое применение милдроната является эффективным способом профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии, и может быть использовано для лечения нефропатической формы системного амилоидоза, индуцируемого у экспериментального животного. Для этого животным вводят подкожно 10% раствор милдроната через день из расчета 50 мг/кг в течение последних 14 дней эксперимента. Данный способ обеспечивает эффективное лечение заболевания за счет одновременного воздействия на различные звенья патогенеза образования амилоидных масс в почках. 1 табл.

Способ лечения нефропатической формы системного амилоидоза у экспериментальных животных, включающий введение лекарственных препаратов, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата животным вводят подкожно 10%-ный раствор милдроната через день из расчета 50 мг/кг в течение последних 14 дней эксперимента.