СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ СИСТЕМНОГО АМИЛОИДОЗА И ЕГО НЕФРОПАТИЧЕСКОЙ ФОРМЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2013 года по МПК G09B23/28 A61K31/502 A61P13/12 

Данное изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, кровообращения, минерального обмена и других показателей.

Амилоидоз - системное заболевание с поражением многих органов и различных тканевых структур, характеризующееся нарушением белкового обмена и внеклеточным отложением в них сложного белково-полисахаридного комплекса. (Серов В.В. // Клин. герант. - 1995. №1. - С.3-8). Амилоид представляет собой гликопротеид, основным компонентом которого являются фибриллярные белки. Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает γ-глобулин (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan-Mar. - 6 (1 Pt 2). P. - 107-116). Амилоид накапливается в органах и тканях в больших количествах, что приводит к атрофии, склерозу и функциональной недостаточности органов.

Одним из проявлений генерализованного амилоидоза является амилоидоз почек с яркой клинико-морфологической и нозологической спецификой. Микроскопически в почках амилоид обнаруживается по ходу прямых сосудов и собирательных трубок. В интермедиальной зоне и пирамидах строма пропитывается белками плазмы. Амилоид откладывается не только в пирамидах, но и в клубочках.

Специфическое лечение амилоидоза не разработано, что связано с отсутствием окончательных представлений об этиологии и патогенезе этого заболевания. В связи с этим возникла необходимость разработки и создания способов профилактики амилоидоза и его нефропатической формы.

Известен способ профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экпериментальных животных (патент РФ на изобретение №2386415, Пухова И.У., Брин В.Б., Козырев К.М., Бабаниязов Х.Х., Пронина Н.В., зарегистрированный 20.04.2010, заявка №2008144050/13 от 05.11.2008 МПК A61D 99/00, А61К 35/16 А61К 31/15), заключающийся в введении белкового препарата и амилоидопротектора. В качестве белкового препарата сирийским хомякам вводили нативную свиную плазму подкожно из расчета 0,025 мл/г массы тела, а в качестве амилоидопротектора одновременно вводили ацизол ежедневно через зонд в дозе 30 мг/кг в течение 60 дней, который был взят нами за прототип как наиболее близкий способ.

Недостатком указанного прототипа является то, что для получения экспериментального амилоидоза требуется многократное введение нативной свиной плазмы, а с адъювантом Фрейнда достаточно однократного введения в пять точек биообъекта. Антигенная стимуляция, приводящая к амилоидозу, нативной человеческой плазмой у сирийских хомяков дает возможность изучения механизмов развития данного процесса у человека. Недостатком лекарственного препарата является то, что его надо вводить ежедневно через зонд, что приводит к частой травматизации и гибели животных в эксперименте.

Галавит является достаточно простым веществом и в химическом отношении - производным фтальгидразида. Химическое название 5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ид натрия, дигидрат. Ближайшим аналогом его являются люминол, известный в биологии своей способностью к энергопереносу и люминесценции, участию в окислительных и восстановительных реакциях ввиду наличия двойных связей в двух циклах его молекулы.

Важнейшим механизмом галавита считают его эффекты на неспецифическую иммунную защиту - фагоцитоз макрофагов и продукцию ими активных форм кислорода. Галавит оказался способен выраженно влиять на продукцию макрофагами регуляторных цитокинов, а также на другие клетки иммунной системы (Рябчиков и др., 1999, Калюжин, Абидов, 1999).

Таким образом, в настоящее время появился отечественный, доступный и безопасный, новый иммунорегулятор с противовоспалительным и регенерирующим эффектом, показавший свою эффективность на многих экспериментальных системах и при многих клинических патологиях.

Первым эффектом препарата является, видимо, обратимое мягкое иммунокорегирующее влияние на начальное макрофагальное звено иммунитета, по-видимому, связанное с влиянием на антиоксидантную систему этого типа клеток, выражено генерирующих активные формы кислорода в процессе своей естественной функции.

Исследование токсических свойств галавита сразу же вывели его в ряд ведущих препаратов, так как до настоящего времени у него практически не выявлено ни токсических, ни побочных свойств (обзор - Абидов, 1999). (В.И.Донцов, А.А.Подколзин, В.Н. Крутько, Б.М.Мрикаев. Клинические и экспериментальные эффекты Галавита. Национальный Геронтологический Центр. Московский государственный медико-стоматологический университет).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы.

Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, динамики показателей ПОЛ при экспериментальном генерализованном амилоидозе и других показателей экспериментальных животных.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что в качестве белкового препарата сирийским хомякам вводят нативную человеческую плазму, смешанную с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, инъекции осуществляют в симметричные подмышечные и паховые области, внутрибрюшинно из расчета 0,1 мл в каждую точку, однократно, а в качестве амилоидопротектора используют галавит, вводимый им через день, одновременно с вышеописанной смесью, подкожно в дозе 0,28 мг/кг в течение 60 дней.

Между признаками заявляемого способа и результатом существует следующая причина - можно предположить, что через механизм действия галавит может способствовать в некоторой степени амилоидоклазии и торможению отдельных звеньев амилоидогенеза, в частности снижению плазматического пропитывания и деполимеризации гликозаминогликанов (компонентов, составляющих амилоид), тем самым ограничивая процесс дальнейшего накопления субстрата.

Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется

вышеуказанная возможность получения способа профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, включающего введение амилоидопротектора подкожно, отличающегося тем, что в качестве амилоидопротектора вводят сирийским хомякам галавит через день из расчета 0,28 мг/кг массы тела в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществлялся следующим образом.

Для получения системного амилоидоза и его нефропатической формы животным вводили нативную человеческую плазму смешанной с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, инъекции осуществляют в симметричные подмышечные и паховые области, и внутрибрюшинно из расчета 0,1 мл в каждую точку, однократно. Путем растворения 100 мг галавита в 2 мл 0,9% натрия хлорида, который вводим подкожно из расчета 0,056 мг/200 г массы тела, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.

В конце первого и второго месяца эксперимента определяли показатели: электролитоводовыделительной функции почек, ПОЛ.

Для гистологических исследований образцы тканей (печень, почка, сердце, селезенка) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашивались гемотоксилином и эозином и Конго красным. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа МИКМЕД-1 под увеличением 80×200×400.

Пример 1. Двум группам золотистых сирийских хомяков-самцов (№1 - контроль, №2 - опыт) массой 90-150 г вводили нативную человеческую плазму, смешанную с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, инъекции осуществляют в симметричные подмышечные и паховые области, и внутрибрюшинно из расчета 0,1 мл в каждую точку, однократно.

Галавит вводили ежедневно, подкожно в дозе 0,28 мг/кг в группе №2. Через 1 и 2 месяца определяли некоторые показатели водоэлектролитовыделительной функции почек при спонтанном шестичасовом диурезе: уровень диуреза, клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции, уровень экскреции натрия, калия, кальция, также определяли концентрацию белка в моче, в крови показатели ПОЛ (МДА, гидроперекисей, каталаза).

Анализ данных показал (табл.1, 2), что в условиях спонтанного диуреза на фоне введения вышеописанного амилоидогена отмечалось увеличение диуреза через 1 месяц и его восстановление через 2 месяца. Уменьшение диуреза было обусловлено снижением скорости клубочковой фильтрации. В течение второго месяца спонтанный диурез восстанавливался до контрольных цифр, при этом канальцевая реабсорбция воды продолжала снижаться. Экскреция натрия, калия и кальция в условиях спонтанного диуреза была резко сниженной на протяжении всего эксперимента, особенно по истечении 2 месяца. Отмечалось прогрессивное увеличение протеинурии почти в 3 раза на протяжении 2 месяцев.

В группе №2, получавших подкожно галавит через день в течение двух месяцев на фоне введения нативной человеческой плазмы, смешанной с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, через 1 и 2 месяца эксперимента наблюдалось уменьшение объема спонтанного диуреза. Снижение диуреза было обусловлено увеличением канальцевой реабсорбции воды через 1 и 2 месяца, при этом скорость клубочковой фильтрации воды во все сроки эксперимента увеличивалась.

Профилактическое применение галавита выявило тенденцию к постепенному увеличению экскреции натрия, калия и кальция на протяжении двух месяцев, по сравнению с группой №1. Применение галавита выявило через 2 месяца снижение содержания белка в моче до фонового уровня.

Таблица 1 Изменения объема спонтанного диуреза и основных процессов мочеобразования при формировании амилоидной нефропатии и влиянии галавита Условия опыта Статистич. показатель Процессы мочеобразования Содержание белка, мг/мл Диурез мл/ч/100 СКФ м/ч/100 Реабсорбция, % Фон M±m 0,13±0,004 21,00±0,220 99,39±0,016 0,98±0,030 Фон Галавит 1 мес. M±m 0,14±0,004 21,79±0,436 99,35±0,010 0,97±0,072 Фон Галавит 2 мес. M±m 0,15±0,003 23,04±0,294 99,34±0,005 0,89±0,086 Плазма, ад. Фрейнда 1 мес. Группа №1
M±m 0,16±0,004 22,06±0,304 99,28±0,013 1,71±0,079 Плазма, ад. Фрейнда 2 мес. 0,12±0,003 12,48±0,389 99,07±0,013 2,62±0,043 Галавит + плазма, ад. Фрейнда 1 мес. Группа №2
M±m 0,12±0,002 21,22±0,298 99,44±0,008 1,59±0,086 Галавит + Плазма, ад. Фрейнда 2 мес. 0,14±0,006 21,21±0,939 99,32±0,017 0,73±0,098

Таблица 2 Изменения экскреции электролитов с мочой при формировании амилоидной нефропатии и влиянии галавита Условия опыта Статистич. показатель Электролитовыделительная функция Экскреция Na Экскреция К Экскреция Са Фон М±m 10,68±0,367 7,54±0,381 0,26±0,014 Фон Галавит 1 мес. М±m 10,07±0,233 7,84±0,211 0,25±0,005 Фон Галавит 2 мес. М±m 9,63±0,249 7,58±0,276 0,24±0,004 Плазма, ад. Фрейнда 1 мес. Группа №1
М±m 8,61±0,186 8,59±0,279 0,32±0,012

Плазма, ад. Фрейнда 2 мес.   6,54±0,268 5,21±0,226 0,20±0,010 Галавит + плазма, ад. Фрейнда 1 мес. Группа №2
M±m 8,61±0,186 8,59±0,279 0,32±0,012 Галавит + Плазма, ад. Фрейнда 2 мес. 10,76±0,531 10,02±0,505 0,34±0,021

В группе №1 (табл.3) на фоне однократного введения нативной человеческой плазмы, смешанной с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, статистически увеличились показатели гидроперекисей и МДА, что отражает степень интенсивности процессов ПОЛ, а активность каталазы эритроцитов достоверно снижается, что свидетельствует об угнетении ферментативного звена антиоксидантной системы.

В группе №2, получавших подкожно галавит в дозе 0,28 мг/кг через день в течение двух месяцев, одновременно с введением нативной человеческой плазмы, смешанной с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, отмечалось статистически достоверное увеличение каталазы эритроцитов, что свидетельствовало об активации ферментативного звена антиоксидантной системы на фоне статистически достоверного снижения уровня гидроперекисей, малонового диальдегида, отражающего степень интенсивности процессов ПОЛ.

Таблица 3 Динамика параметров свободнорадикальных процессов и состояния антиоксидантной защиты при формировании амилоидной нефропатии и влияние галавита Условия опыта Статистич. показатель Показатели ПОЛ Гидроперекисей (мкмоль/л) МДА (мкмоль/л) Каталаза (*10*4 ME/rHb) Фон М±m 1,12±0,058 48,48±0,499 8,47±0,177 Фон Галавит М±m 1,18±0,233 46,10±0,612 7,86±0,319 Плазма, ад. Фрейнда Группа №1
М±n 3,40±0,130 69,16±1,448 6,03±0,104 Галавит + плазма, ад. Фрейнда Группа №2
M±m 1,23±0,148 52,83±2,288 8,05±0,143

Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически.

Фиг.1. Пролиферация эндотелия капилляров и мезангиоцитов клубочка (а). Уменьшение плазматического пропитывания стенок капилляров клубочка и интеркапиллярного отека. Уменьшение гиперемии плазматического пропитывания и отека межуточного вещества. Снижение признаков конгофилии кортикальных и медуллярных сосудов (б). Очаговая периваскулярная пролиферация лимфогистиоцитарных элементов коркового и мозгового вещества почки.

Фиг.2. Снижение конгофилии межуточного вещества и сосудистых стенок печени (а). Гиперемия центральных дольковых вен. Очаговая периваскулярная гистиоцитарная реакция.

Фиг.3. Уменьшение признаков гиперемии, плазматического пропитывания стенок сосудов системы микроциркулляции (прекапилляров, капилляров) селезенки (а). Снижение количества фибриллярного белка амилоида в виде рассеянных очаговых скоплений (б).

Для наглядности изменений в органах микрофотографии повторяются в цветном виде в приложении.

Из вышеизложенного видно, что профилактическое введение галавита является эффективным способом коррекции проявлений нефропатической формы генерализованного амилоидоза.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения возможности профилактики системного амилоидоза и его проявления в виде нефропатической формы. Для этого моделируют указанную патологию путем введения сирийским хомякам однократно подкожно нативной человеческой плазмы, смешанной с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях. Инъекции осуществляют в симметричные подмышечные и паховые области, а также внутрибрюшинно из расчета 0,1 мл в каждую точку. В качестве амилоидопротектора используют галавит, который вводят животным через день подкожно в дозе 0,28 мг/кг в течение 60 дней. Способ, являясь легко воспроизводимым, обеспечивает эффективную коррекцию проявлений нефропатической формы генерализованного амилоидоза, способствуя амилоидоклазии. 3 табл., 3 ил.

Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, включающий введение сирийским хомякам белкового препарата подкожно и амилоидопротекторного препарата, отличающийся тем, что в качестве белкового препарата вводят нативную человеческую плазму, смешанную с адъювантом Фрейнда в равных пропорциях, инъекции осуществляют в симметричные подмышечные и паховые области и внутрибрюшинно из расчета 0,1 мл в каждую точку однократно, а в качестве амилоидопротектора используют галавит, вводимый им одновременно через день подкожно в дозе 0,28 мг/кг в течение 60 дней.