Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 Российский патент 2017 года по МПК C07K14/47 C12P21/02 C12N15/63 C12N15/12 A61K38/17 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2634408C1

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3, являющегося производным человеческого гистона Н1.3. Природный гистон Н1.3 - это высококонсервативный белок с выраженными антипролиферативными свойствами в отношении раковых клеток различного происхождения. Бисметионилгистон - молекула гистона, имеющая на N-концевой части дополнительные два остатка аминокислоты метионина, является производным природного гистона и проявляет аналогичные биологические свойства. В связи с этим рекомбинантный бисметионилгистон является аналогом лекарственного средства Ритуксимаб для изготовления лекарственных препаратов, применяемых для терапевтического лечения злокачественных опухолевых образований лимфоидного и миелоидного происхождения.

В Российской Федерации терапевтическое лечение злокачественных опухолей лимфоидного и миелоидного происхождения, рецидивирующих и часто устойчивых к химиотерапии, осуществляется за счет импортных коммерческих препаратов Ритуксимаба. Однако в некоторых случаях препараты Ритуксимаба могут не вызывать должного терапевтического эффекта, причины чего изучены плохо (Cartron, G., et al. Blood. 2002. V. 99(3). P. 754-758). Кроме того, терапия Ритуксимабом может приводить к образованию в организме больного антиидиотипических антител, приводя к аутоиммунному ответу (Smith, М. Oncogene. 2003. V. 22(47). Р. 7359-7368). Известно, что аналоги Ритуксимаба на основе линкерньгх или ядерных гистонов или их производных лишены подобных недостатков. В связи с этим разработка способа получения активной фармацевтической субстанции гистонов или их производных является актуальной задачей.

Известен способ получения рекомбинантного гистона H1.5, состоящий в культивировании штамма-продуцента E. coli B121(DE3), продуцирующего гистон H1.5. Способ заключается в разрушении бактериальных клеток, выделении целевого компонента с помощью катионообменной хроматографии, очистки выделенного белка последовательно на гидроксиапатитной и катионообменной хроматографии, доочистки от бактериальных эндотоксинов тангенциальной фильтрацией и лиофилизацией до получения активной фармацевтической субстанции (Руо, S.-H., et al. Prot. Exp. Purif. 2001. V. 23. P. 38-44).

К недостаткам данного способа следует отнести большое количество стадий очистки и, следовательно, крайне низкий суммарный выход процесса (около 16%).

Известен способ получения рекомбинантного гистона HI, состоящий в культивировании дрожжевого штамма S. cerevisiae ENY.WA-4D, продуцирующего ряд подтипов гистона HI. Способ заключается в лизировании бактериальных клеток ферментом зимолиазой Т20, выделении целевого компонента с помощью экстракции перхлорной кислотой, очистке выделенного белка многостадийным осаждением с помощью ацетона с последующим перерастворением осадка и повторным осаждением с помощью сульфата аммония (Albig, W., et al. FEBS lett. 1998. V. 435. P. 245-250).

К недостаткам данного способа следует отнести большое количество стадий осаждения и перерастворения, а также недостаточную чистоту получаемого раствора, содержащего ряд подтипов гистона H1.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения производного гистона Н1.3, бисметионилгистона Н1.3, описанный в европейской патентной заявке (European Patent Application ЕР 1985628), в международной патентной заявке (International Patent Application WO 2008/122434) и патенте Российской Федерации RU 2498997. Способ заключается в:

1) культивировании штамм-продуцент E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок;

2) разрушении биомассы дезинтегратором;

3) экстракции целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой;

4) денатурации белка мочевиной до финальной концентрации 8 М;

5) очистке методом анионообменной хроматографии на сорбенте Q-Sepharose в денатурирующих условиях;

6) очистке методом катионнообменной хроматографии на сорбенте Macro-prep High S в денатурирующих условиях;

7) концентрировании диафильтрацией с одновременной сменой буферной системы раствора белка;

8) финишной стерильной фильтрации с получением раствора очищенного бисметионилгистона Н1.3 в качестве фармацевтической субстанции.

К недостаткам описанного способа следует отнести несоответствие получаемой активной фармацевтической субстанции фармакопейным требованиям по чистоте действующего компонента (требования составляют не менее 97%), что отмечено в комментариях авторов (Gross, P., et al. World Intellectual Property Organization Patent Application, WO 2008/122434 A1, 2008; European Patent Application EP 1985628).

Техническим результатом изобретения является повышение чистоты конечного продукта не менее 98,5%, сокращение стадий производства благодаря исключению процесса денатурации целевого белка и неочевидному снижениб бактериальных эндотоксинов на стадии катионообменной хроматографии, что дополнительно приводит увеличению срока службы ВЭЖХ-сорбента Kromasil и, соответственно, к экономической выгоде.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 используют штамм-продуцент E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S. (Штамм депонирован в коллекции штаммов-продуцентов ИБХ РАН, № MSP-H1.3.)

Биосинтез продуцента проводят культивированием.

При культивировании клеток штамма-продуцента для получения инокулята питательную среду на основе экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в колбах, который используют для засева ферментера. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 10 ОЕ, с последующей индукцией синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штамма-продуцента целевого белка (биомассу) отделяют центрифугированием и разрушают на дезинтеграторе Гаулин. Выделение целевого бисметионилгистона Н1.3 проводят с помощью экстракции 2,5% перхлорной кислотой в течение 1 ч, в результате чего осаждают балластные белки, а надосадочную жидкость, содержащую бисметионилгистон Н1.3, отделяют центрифугированием, доводят рН до 2,0-4,0 с помощью 4 М гидроксида натрия и отфильтровывают через фильтр 0,45 микрон.

Полученный белковый раствор наносят на предварительно уравновешенную колонну, упакованную катионообменным сорбентом. Проводят промывку сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины, что приводит к неочевидному снижению бактериальных эндотоксинов, за счет их частичного высвобождения из комплекса бисметионилгистон Н1.3 - эндотоксин (как сильно положительно и сильно отрицательно заряженных молекул). Проводят очистку, элюируя с увеличением ионной силы подвижной фазы. Собирают основную фракцию, прибавляют к ней пропиловый спирт до его концентрации 10% об. и наносят полученный раствор на предварительно уравновешенную колонну, упакованную ВЭЖХ сорбентом. Проводят очистку, элюируя с увеличением содержания органического модификатора в подвижной фазе и/или с понижением рН подвижной фазы. Собирают основную фракцию. При этом использование промывки раствором 4 М мочевины на предыдущей стадии помимо неочевидного снижения количества бактериальных эндотоксинов, связанных с бисметионилгистоном Н1.3, позволяет реже проводить регенерацию ВЭЖХ-сорбента и в менее жестких условиях, что продлевает срок его службы. Полученный белковый раствор подвергают ультрафильтрации с использованием системы для тангенциальной ультрафильтрации, что приводит к доочистке и уменьшению объема раствора бисметионилгистона Н1.3. Полученный раствор подвергают лиофильной сушке под вакуумом до получения активной фармацевтической субстанции.

Таким образом, проводят следующие стадии очистки:

1) культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок;

2) разрушение биомассы дезинтеграцией;

3) экстракцию целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой;

4) очистку методом катионообменной хроматографии на сорбенте с использованием промывки сорбента 4 М мочевиной;

5) очистку методом ВЭЖХ;

6) концентрирование ультрафильтрацией с одновременной сменой буферной системы раствора белка;

7) лиофильную сушку с получением порошка очищенного бисметионилгистона Н1.3 в качестве фармацевтической субстанции.

Таким образом, техническим результатом изобретения является

- уменьшение стадий технологического процесса;

- проведение стадий очистки без применения денатурирующих условий;

- повышение чистоты конечного продукта до 98,5%;

- получение фармацевтической субстанции бисметионилгистона Н1.3 в качестве лиофильно высушенного порошка, более стабильного при хранении.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Культивирование клеток штамм-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание посевной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и канамицин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания рН 7,0, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 10 ОЕ (измерение проводят при длине волны 550 нм) проводят индукцию синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. Последующий биосинтез рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 проводят в течение 2 ч.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента в виде суспензии собирают на сепараторе. Клетки разрушают дезинтеграцией.

Из полученной суспензии разрушенных клеток выделяют целевой компонент с помощью экстракции 2,5%-ным водным раствором перхлорной кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре. Образованный осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием. В надосадочной жидкости доводят рН до 3,0 с помощью 4 М гидроксида натрия. Полученный белковый раствор очищают с помощью катионообменной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом BioPro S75 (YMC Со, Германия), колоночный объем (КО) 60 мл. Готовят подвижную фазу «А», содержащую 10 мМ лимонной кислоты в воде для инъекций, рН 3,0. Готовят промывочный раствор «П» на основе фазы «А», содержащий 4 М мочевину, рН 3,0. Готовят подвижную фазу «Б», содержащую 10 мМ лимонной кислоты и 2 М хлорида натрия в воде для инъекций, рН 3,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч, пропуская через колонну не менее 3 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 6 КО/ч. Затем промывают сорбент с нанесенным белком промывочным раствором «П» 1 КО со скорость 6 КО/ч, промывают вновь 1 КО подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч. После этого элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 6 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Б» от 0 до 100% в течение 15 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПАГЭ) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Фракции с чистотой не менее 95% объединяют, добавляют к ним этиловый спирт до его концентрации 10% об., очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом YMC Butil-15 микрон-30 нм (YMC Со, Германия), колоночный объем (КО) 80 мл. Готовят подвижную фазу «В», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 20% об. этилового спирта в воде для инъекций, рН 4,0. Готовят подвижную фазу «Г», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 50% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 2,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «В» со скоростью 7 КО/ч, пропуская через колонну не менее 1 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 5 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 5 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Г» от 0 до 100% в течение 10 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют. Полученный раствор насосом подают в систему тангенциальной ультрафильтрации, концентрируют до объема 20 мл, затем доливают в систему воды для инъекций (ВДИ) до объема 200 мл, концентрируют до 20 мл и эту операцию повторяют несколько раз. Полученный раствор анализируют на содержание высокомолекулярных примесей (методом Э-ВЭЖХ) и бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). После раствор подвергают лиофильной сушке до получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3.

Пример 2

Культивирование клеток штамм-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание посевной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 200 л на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и канамицин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания рН 7,0, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 10 ОЕ (измерение проводят при длине волны 550 нм) проводят индукцию синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. Последующий биосинтез рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 проводят в течение 2 ч.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамм-продуцента в виде суспензии собирают на сепараторе до объема 70-80 л. Клетки разрушают на дезинтеграторе Гаулин.

Из полученной суспензии разрушенных клеток выделяют целевой компонент с помощью экстракции 2,5% перхлорной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. Образованный осадок отделяют от надосадочной жидкости центирфугированием. В надосадочной жидкости доводят рН до 3,0 с помощью 4 М гидроксида натрия. Полученный белковый раствор очищают с помощью катионообменной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом Macro-prep HS (Bio-Rad lab., США), КО 5 л. Готовят подвижную фазу «А», содержащую 10 мМ лимонной кислоты в воде для инъекций, рН 3,0. Готовят промывочный раствор «П» на основе фазы «А», содержащий 4 М мочевину, рН 3,0. Готовят подвижную фазу «Б», содержащую 10 мМ лимонной кислоты и 2 М хлорида натрия в воде для инъекций, рН 3,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч, пропуская через колонну не менее 3 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 6 КО/ч. Затем промывают сорбент с нанесенным белком промывочным раствором «П» 1 КО со скорость 6 КО/ч, промывают вновь 1 КО подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 6 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Б» от 0 до 100% в течение 15 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 95% объединяют, добавляют к ним этиловый спирт до его концентрации 10% об., очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом Kromasil С4-16 микрон-30 нм (Eka Chemicals, Швеция), колоночный объем (КО) 3,5 л. Готовят подвижную фазу «В», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 20% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 4,0. Готовят подвижную фазу «Г», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 50% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 2,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «В» со скоростью 2 КО/ч, пропуская через колонну не менее 1 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 2 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 2 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Г» от 0 до 100% в течение 10 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют. Полученный раствор насосом подают в систему тангенциальной ультрафильтрации, концентрируют до объема 0,4 л, затем доливают в систему воды для инъекций (ВДИ) до объема 4 л, концентрируют до 0,4 л и эту операцию повторяют несколько раз. Полученный раствор анализируют на содержание высокомолекулярных примесей (методом Э-ВЭЖХ) и бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). После раствор подвергают лиофильной сушке до получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 с хроматографической чистотой не ниже 98,5% (по результатам Э-ВЭЖХ) и содержанием эндотоксинов не выше 0,5 EU/мг (по ЛАЛ-тесту).

Похожие патенты RU2634408C1

название год авторы номер документа
Способ получения пептида, модулирующего активность пуринергических рецепторов 2019
  • Степаненко Василий Николаевич
  • Макаров Дмитрий Александрович
  • Зинченко Алексей Алексеевич
  • Опарин Пётр Борисович
  • Соколова Ирина Владимировна
  • Воробьева Татьяна Владимировна
  • Левандовская Кристина Георгиевна
  • Павленко Даниил Михайлович
  • Нокель Елена Адамовна
  • Пучков Илья Александрович
  • Гордеева Елена Анатольевна
  • Мирошников Анатолий Иванович
  • Мягких Игорь Валентинович
  • Василевский Александр Александрович
RU2714114C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Костецкий Игорь Евгеньевич
  • Лисовский Игорь Леонидович
  • Луцив Владимир Романович
  • Маркеева Наталья Владимировна
RU2447149C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНГИБИТОРА С1-ЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ 2020
  • Шукуров Рахим Рахманкулыевич
  • Шамонов Николай Алексеевич
  • Морозов Антон Николаевич
  • Тихонов Роман Владимирович
  • Хамитов Равиль Авгатович
  • Шустер Александр Михайлович
RU2769201C2
СПОСОБ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА 2010
  • Чугунов Александр Михайлович
  • Скатова Галина Евгеньевна
  • Морозов Дмитрий Валентинович
  • Ефанов Юрий Георгиевич
  • Денисов Лев Александрович
  • Гончарова Ольга Владимировна
  • Черновская Татьяна Вениаминовна
  • Морозова Елена Леонидовна
RU2487885C2
СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОЙ ОЧИСТКИ РОМИПЛОСТИМА 2021
  • Ершов Александр Викторович
  • Ершова Ольга Анатольевна
  • Анисимов Роман Львович
  • Каторкин Сергей Александрович
RU2804622C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ERWINIA CAROTOVORA 2010
  • Карасев Виктор Семенович
  • Бочкова Ольга Петровна
  • Чугунов Александр Михайлович
  • Мелик-Нубаров Николай Сергеевич
  • Гроздова Ирина Дмитриевна
  • Черновская Татьяна Вениаминовна
  • Денисов Лев Александрович
  • Руденко Елена Георгиевна
  • Морозова Елена Леонидовна
  • Богуш Владимир Григорьевич
  • Сидорук Константин Васильевич
  • Колтун Игорь Олегович
  • Скатова Галина Евгеньевна
  • Абакумова Ольга Юрьевна
  • Подобед Ольга Владимировна
  • Соколов Николай Николаевич
RU2441914C1
СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИЛ-36РА (ВАРИАНТЫ) 2018
  • Колобов Алексей Александрович
  • Протасов Евгений Александрович
  • Полоцкий Александр Евгеньевич
  • Антипова Татьяна Олеговна
  • Синева Светлана Адамовна
RU2700751C1
ПРЕПАРАТ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭНДОСТАТИНА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2004
  • Гороховец Неонила Васильевна
  • Дигтярь Антон Васильевич
  • Корженевский Дмитрий Андреевич
  • Луценко Елена Валерьевна
  • Луценко Сергей Викторович
  • Макаров Владимир Алексеевич
  • Позднякова Наталья Владимировна
  • Северин Евгений Сергеевич
  • Северин Сергей Евгеньевич
  • Соловьев Андрей Иванович
  • Фельдман Наталия Борисовна
RU2278688C1
Рекомбинантная плазмидная ДНК pSMT3_HCRG21, кодирующая гибридный белок SMT3-HCRG21, штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 - продуцент анальгетического пептида HCRG21 и способ получения рекомбинантного анальгетического пептида HCRG21 2022
  • Терешин Михаил Николаевич
  • Степаненко Василий Николаевич
  • Лейченко Елена Владимировна
  • Козловская Эмма Павловна
  • Подволоцкая Анна Борисовна
  • Текутьева Людмила Александровна
  • Козлов Сергей Александрович
RU2798545C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ БЕТА-N-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИНИДАЗЫ STRH ИЗ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE 2018
  • Ершов Александр Викторович
  • Ершова Ольга Анатольевна
  • Леонов Вячеслав Сергеевич
RU2693660C1

Реферат патента 2017 года Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к способу получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3. Настоящий способ предусматривает культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок, разрушение биомассы дезинтегратором, экстракцию целевого белка перхлорной кислотой и последующую очистку целевого белка. Указанный способ отличается тем, что очистка белка включает очистку методом катионообменной хроматографии с использованием промывки сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины и очистку методом ВЭЖХ. Настоящий способ также включает концентрирование очищенного бисметионилгистона ультрафильтрацией и лиофилизацию с получением порошка очищенного бисметионилгистона фармакопейного качества с чистотой 98,5%. Настоящее изобретение позволяет получать бисметионилгистон Н1.3 фармакопейного качества. 2 пр.

Формула изобретения RU 2 634 408 C1

Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3, включающий культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок; разрушение биомассы дезинтегратором; экстракцию целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой; очистку методом катионообменной хроматографии с использованием промывки сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины; очистку методом ВЭЖХ; концентрирование ультрафильтрацией и лиофилизацию с получением порошка очищенного бисметионилгистона Н1.3 фармакопейного качества c чистотой 98,5%.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2634408C1

БИС-Met-ГИСТОНЫ 2008
  • Тири Мишель
  • Гросс Петер
  • Йернвалль Ханс
  • Формика-Цеппецауэр Грацина
  • Цеппецауэр Михель
RU2498997C2
SHIM Y et al
Polycistronic coexpression and nondenaturing purification of histone octamers, Analytical biochemistry, 2012
KLINKER H et al
Rapid purification of recombinant histones, PloS one, 2014.

RU 2 634 408 C1

Авторы

Соколова Ирина Владимировна

Воробьева Татьяна Владимировна

Косарев Сергей Анатольевич

Шибанова Елена Дмитриевна

Гусаров Дмитрий Алексеевич

Гусарова Валентина Дмитриевна

Свешникова Елена Васильевна

Даты

2017-10-26Публикация

2016-10-03Подача