СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Yersinia И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ ИЕРСИНИЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и ветеринарии, а именно к лабораторной генодиагностике, и представляет собой способ для детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Род Yersinia включает 11 видов бактерий, среди которых медицинское значение однозначно установлено только для трех видов (Y. pestis - возбудитель чумы, Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза и Y. enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза) [1]. Первый микроорганизм является причинным агентом острого инфекционного заболевания человека, бубонной и легочной форм чумы [2]. Два других вызывают острые бактериальные энтериты. У некоторых больных при наличии факторов риска могут развиться такие серьезные внекишечные осложнения как реактивный артрит, узловатая эритема, септицемия, абсцессы внутренних органов [3].

Принято подразделять Y. pestis на три биовара (Y. antique, Y. medievalis, Y.orientalis) [4]. Кроме того, существует группа «атипичных» чумных штаммов, так называемых пестоидов и Microtias, которые вызывают эпизоотии у различных грызунов, но не вызывают заболеваний у человека или других крупных млекопитающих [5]. Наиболее гетерогенной по биохимическим и серологическим свойствам является Y. enterocolitica, в соответствии с которыми выделяют 6 биоваров и более 50 серотипов. Среди них представители 5 биоваров (1В, 2, 3, 4 и 5) и 11 серогрупп (главным образом, O:3, O:8, O:9 и O:5,27) наиболее часто вызывают инфекцию у человека [6]. В Y. pseudotuberculosis выделяют 6 серологических групп, в каждой из которых встречаются вирулентные штаммы, но наиболее часто в 1 (1В) и 2 группах [7]. Клиническое значение остальных видов (Y. bercovieri, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri и Y. aldovae) и вариантов иерсиний, ранее относящихся к энтероколитикоподобным видам (К frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii), остается до сих пор неясным. В литературе имеются отдельные сообщения о выделении непатогенных иерсиний из клинического материала. Они могут составлять до 20% от всех изолятов иерсиний [8]. Показано, что непатогенные иерсиний могут обладать некоторыми факторами патогенности, в частности продуцировать энтеротоксины [9], и, следовательно, быть причиной пищевого отравления. Кроме того, некоторые варианты способны проникать внутриклеточно и, следовательно, избегать фагоцитоза [10]. Определение роли этих бактерий в возникновении острой кишечной инфекционной болезни возможно только в результате совершенствования диагностики иерсиниоза.

Лабораторная диагностика иерсиний включает бактериологические, биохимические, серологические и молекулярно-генетические методы исследования. Бактериологическая диагностика иерсиний достаточно трудоемка и занимает много времени. Ряд методик по выделению иерсиний предусматривают предварительное культивирование бактерий в средах обогащения при 4-25°С в течение 1-28 дней с последующим пересевом в селективные среды и культивированием при 22-30°С в течение 1-7 дней [7, 11, 12].

Видовую идентификацию иерсиний проводят с помощью биохимических реакций, в основном по ферментации сахаров. Следует отметить, что эффективность культуральных методов достаточно низкая, в большей степени это касается патогенных штаммов, и составляет 15-20% положительных результатов. Для серологической диагностики иерсиний разработано много методов: реакция торможения непрямой гемагглютинации (РТГА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция агглютинации (РА), иммуноферментный анализ (ИФА). Этими методами в ранние сроки заболевания антиген иерсиний выявляется в 40-60% случаев. Антитела в диагностически значимых титрах в основном определяются только на второй неделе заболевания. В РНГА этот показатель составляет в среднем 40-50%, в РА - 60-80% случаев. Кроме того, серологические методы имеют серьезный диагностический недостаток - перекрестные реакции не только в пределах рода (близкое антигенное родство, отсутствие моноклональных антител), но и с представителями других родов [7, 12, 13].

К молекулярно-генетическим методам исследования относятся метод гибридизации нуклеиновых кислот и метод ПЦР амплификации нуклеиновых кислот. Второй метод находит более широкое применение ввиду высокой специфичности, высокой чувствительности, относительной простоты и быстроты выполнения анализа. Описано много способов ПЦР диагностики иерсиний, однако, все они касаются идентификации патогенных штаммов на основе выявления вирулентных генов, имеющих плазмидную (virF, yadA, yopN/lcrE, yopT) и/или хромосомную локализацию (ail, inv, yst) [12]. Недостатком методов, основанных на идентификации плазмидных маркеров, является возможность элиминации вирулентных плазмид при культивировании и хранении бактериальных штаммов. Недостатком хромосомных генов патогенности является наличие их у представителей разных видов. Разработаны праймеры и способы детекции видов Yersinia на основе амплификации генов 16S и 23S рибосомальных РНК [14]. Получены ряд патентов на праймеры, зонды, последовательности и методы для детекции отдельных видов иерсиний [15, 16, 17].

Известен способ детекции и идентификации бактерий рода Yersinia, согласно которому мишенями для амплификации служат нуклеотидные последовательности 16S, 23S и межгенного участка 16S-23S рибосомальных генов [18]. Для детекции представителей рода Yersinia используются fd2 и r23s праймеры. Видовая идентификация иерсиний осуществляется с помощью рестрикционного анализа путем ферментативной обработки полученных ПЦР продуктов различными мелкощепящими рестрикционными эндонуклеазами по отдельности или в смеси. Кроме того, дополнительно разработана пара праймеров (fl6s и yerl) для детекции патогенных для человека видов иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) с последующей видовой идентификацией иерсиний с помощью рестрикционной эндонуклеазы AluI.

К недостаткам этого метода относятся необходимость постановки нескольких последовательных или параллельных амплификационных реакций, а также проведение дополнительных анализов (рестрикционного анализа) для идентификации патогенных и непатогенных видов. В некоторых случаях такой анализ может потребовать проведение двух амплификационных реакций и нескольких ферментативных обработок продуктов реакций. Такой подход является достаточно трудоемким и приводит к значительному увеличению времени анализа. Использование рестрикционных эндонуклеаз также увеличивает стоимость анализа.

Вышеупомянутые известные способы детекции иерсиний и диагностики инфекций, вызываемых иерсиниями, недостаточно эффективны для клинического применения, т.к. в большинстве случаев возникает вопрос о дифференциальной диагностике и установлении причинного микроорганизма, вызвавшего заболевание. Ни один из вышеуказанных методов не позволяет одновременно детектировать в большом масштабе бактерии рода Yersinia, происходящие из большинства или из всех известных биосеротипов, и в то же время идентифицировать патогенные виды, что в первую очередь важно для постановки правильного этиологического диагноза. Более того, один из представителей рода Yersinia, а именно Y. pestis, рассматривается как один из возможных агентов биотеррористических атак. В связи с вышесказанным существует необходимость в разработке эффективных методов быстрой диагностики и видовой идентификации патогенных иерсиний.

Задачей настоящего изобретения является разработка специфичного, чувствительного и экономичного способа, позволяющего определять принадлежность микроорганизмов к роду Yersinia, а также идентифицировать и дифференцировать патогенные для человека виды иерсиний.

Заявляемый способ основан на мультиплексной ПЦР с последующим гель-электрофорезным анализом длин амплифицированных фрагментов, и заключается в:

1) детекции нуклеиновых кислот иерсиний путем амплификации участка гена OmpF порина иерсиний с помощью праймеров Y-F (SEQ ID N0:1) и Y-R (SEQ ID NO:2) на основе образования ПЦР-продукта, длина которого составляет 427-472 п.н.;

2) идентификации и дифференциации патогенных видов иерсиний путем:

а) амплификации участка гена OmpF порина Y. pestis с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и YP-R (SEQ ID NO:3) и образования ПЦР-продукта, длина которого составляет 754 п.н.;

б) амплификации участка гена OmpF порина Y. pseudotuberculosis с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и YPS-R (SEQ ID NO:4) и образования ПЦР-продукта, длина которого составляет 503 п.н.;

в) амплификации участка гена OmpF порина Y. enterocolitica с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и YE-R (SEQ ID NO:5) и образования ПЦР-продукта, длина которого составляет 270 п.н.;

3) дифференциальной диагностики непатогенных видов рода Yersinia от патогенных видов этого рода, согласно которой у непатогенных видов иерсиний с помощью набора праймеров (Y-F (SEQ ID NO:1), Y-R(SEQ ID NO:2), YP-R, (SEQ ID NO:3) YPS-R (SEQ ID NO:4) и YE-R (SEQ ID NO:5)) образуется только один специфичный ПЦР-продукт, а у патогенных видов иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) образуются два специфичных ПЦР-продукта.

Набор олигонуклеотидных праймеров охарактеризован в заявке №2006118406, опубл. 10.12.2007. Набор состоит из следующих нуклеотидных последовательностей:

- Y-F (SEQ ID NO: 1) - 5'-GTCTGGGCTTTGCTGGTCTG-3' - смысловой родоспецифичный праймер;

- Y-R (SEQ ID NO:2) - 5'-GCGTCGTATTTAGCАССAACG-3' - антисмысловой родоспецифичный праймер;

- YP-R (SEQ ID NO:3) - 5'-GTGTTCAGACCGTTTGCGAT-3' - антисмысловой видоспецифичный праймер;

- YPS-R (SEQ ID NO:4) - 5'-GATGGTGAAATCATAAAAACCG-3' - антисмысловой видоспецифичный праймер;

- YE-R (SEQ ID NO:5) - 5'-CGTTTGCAACAGCGCTGCGAT-3' - антисмысловой видоспецифичный праймер.

Настоящее изобретение позволяет усовершенствовать технику ПЦР-анализа иерсиний для рутинного использования в диагностике иерсиниозных инфекций, так как нет необходимости прибегать к использованию дополнительных методов анализа (рестрикционный анализ, гибридизация со специфическими зондами), тем самым сокращается продолжительность выполнения анализа и снижается его себестоимость и трудоемкость.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в следующем:

- одновременная детекция и дифференциальная диагностика патогенных и непатогенных видов иерсиний, а также видовая идентификация патогенных для человека видов бактерий рода Yersinia;

- более высокая специфичность диагностики;

- уменьшение времени проведения анализа (менее 3,5 час, не включая подготовку пробы). Известный метод [18] требует на диагностику 48-72 час.

- упрощение анализа (3 процедуры, а в известном способе - 6-9 процедур);

- уменьшение стоимости диагностики;

- возможность использования в скрининговых исследованиях.

В качестве мишени выбран ген, кодирующий OmpF порин, порообразующий белок наружной мембраны грамотрицательных бактерий, нуклеотидная последовательность которого имеет консервативные и вариабельные для иерсиний участки.

Длины ПЦР-продуктов, образованных в мультиплексной ПЦР с помощью набора праймеров, указаны выше в пп.1) и 2) (а, б, в) и представлены в таблице 1.

Таблица 1 Длины ПЦР-продуктов, образованных в мультиплексной ПЦР Род/вид Антисмысловой праймер Смысловой праймер Y-F (SEQ ID NO:1) Число специфичных ПЦР-продуктов Длина ПЦР продукта (п.н.) Yersinia spp.непатогенные Y-R (SEQ ID NO:2) 427-472 1 Y. pestis YP-R (SEQ ID NO:3) 754 430 2 Y. pseudotuberculosis YPS-R (SEQ ID NO:4) 503 430 2 Y. enterocolitica YE-R (SEQ ID NO:5) 270 465 2

Отработка условий амплификации проводилась при использовании ДНК 4-х штаммов Y. pseudotuberculosis, 3-х штаммов Y.enterocolitica, по одному штамму Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii и Y. pestis. В качестве контроля бактерий, не входящих в род Yersinia, - E.coli (таблица 2).

Таблица 2 Штаммы, использованные в работе Название штамма/плазмиды Описание генотипа Откуда получены 3260(82-, 48-) Y. pseudotuberculosis IB серотип НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г.Владивосток М4835, М4836 Y. pseudotuberculosis IB серотип М3159 Y. pseudotuberculosis III серотип М3747 Y. pseudotuberculosis IV серотип 164 Y. enterocolitica 1234 Y.enterocolitica 6579 Y. enterocolitica 4849 Y. frederiksenii 253/8744 Y. intermedia 991 Y. kristensenii EV Y.pestis ГНЦ прикладной микробиологии, г.Оболенск DH5α E.coli штамм для клонирования Gibco-Life BRL

Примеры конкретного осуществления изобретения.

Пример 1. Мультиплексный ПЦР-анализ.

Способ осуществляется следующим образом:

условия проведения реакции:

Амплификация проводится с горячим стартом с использованием Hot Start Taq ДНК полимеразы («Сибэнзим», г.Новосибирск) по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 60°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 7 мин (1 цикл).

Инкубационная смесь конечным объемом 25 мкл содержит: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ дНТФ, 2,5 мкМ праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера: Y-F (SEQ ID NO:1), Y-R (SEQ ID NO:2), YP-R (SEQ ID NO:3), YPS-R (SEQ ID NO:4) и YE-R (SEQ ID NO:5)), 25 нг ДНК-матрицы, 0,25 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК, полученную из разных штаммов бактерий рода Yersinia.

Анализ продуктов амплификации

Анализ продуктов амплификации проводится в 2% агарозном геле.

На фиг.1 представлен результат электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных после мультиплексной ПЦР при использовании родо- и видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров.

Видно, что все иерсинии, патогенные для человека, образуют характеристичные по размеру фрагменты ДНК. Все четыре штамма Y. pseudotuberculosis, принадлежащие IB, III и IV серотипам, показывают два фрагмента длиной 430 и 503 п.н. (дорожки 1-4). Все три штамма Y.enterocolitica показывают два фрагмента длиной 270 и 465 п.н. (дорожки 5-7). Штамм Y. pestis показывают два фрагмента длиной 430 и 754 п.н. (дорожка 10). Другие виды иерсиний детектируются и показывают только один фрагмент длиной 430-470 п.н. (дорожки 8, 9 и 11). В отрицательном контроле (реакционная смесь, не содержащая ДНК матрицу) продукты амплификации отсутствуют (дорожка 12).

Пример 2. Анализ клинического материала методом мультиплексной ПЦР.

Апробацию набора праймеров Y-F (SEQ ID NO:1), Y-R(SEQ ID NO:2), YP-R(SEQ ID NO:3), YPS-R(SEQ ID NO:4) и YE-R(SEQ ID NO:5) проводили с использованием образцов клинического материала (кровь) от 5 больных. ДНК образцы приготовлены из цельной крови с помощью набора «ДНК-сорб-В-50» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводили мультиплексную амплификацию фрагментов гена OmpF порина бактерий рода Yersinia, как указано в примере 1.

Электрофоретическое разделение амплификатов выполнялось в 2% агарозном геле. На фиг.2 представлен результат исследования образцов клинического материала методом мультиплексной ПЦР. ДНК Y.enterocolitica обнаружена в 3 образцах (клинические образцы №1, №2 и №4), ДНК непатогенных иерсиний в 1 образце (клинический образец №3).

Литература

1. Bockemuhl J., Wong J. Yersinia. In: Murray P.R., et al. Manual of clinical microbiology. 8th ed. Washington (DC): ASM Press; 2003. P.672-83.

2. Butler, T. 1998. Yersiniosis and plague, p.281-293. In S. R. Palmer, L. Soulsby, and D. I. H. Simpson (ed.), Zoonoses. Oxford University Press, Oxford, United Kingdom.

3. Schiemann, D. A. 1989. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis, p.601-672. In M. P. Doyle, (ed.), Foodborne bacterial pathogens. Marcel Dekker, New York, N.Y.

4. Achtman M., Morelli G., Zhu P., Wirth Т., Diehl I., Kusecek В., et al. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis. PNAS. 2004. vol.101, no.51. P.17837-17842.

5. Anisimov, A.P., Lindler, L.E., Pier, G.B. Clin. Microbiol. Rev. 2004. V. 17, C.434-464.

6. Bottone, E.J. 1999. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microbes Infect. 1:323-333.

7. Псевдотуберкулез. Под ред. Сомова Г.П., Покровского В.И., Беседновой Н.Н. -М.: Медицина. 1990.

8. Loftus C.G., Harewood G.C., Cockerill F.R., Murray J.A. Clinical Features of Patients with Novel Yersinia Species. In Digestive Diseases and Sciences. Publisher: Springer Netherlands. 2002. Vol.47, N.12, P.2805-2810.

9. Singh I, Virdi J.S. Production of Yersinia stable toxin (YST) and distribution of yst genes in biotype 1A strains of Yersinia enterocolitica. Journal of Medical Microbiology (2004), 53, 1065-1068.

10. Grant, Т., Bennett-Wood, V. & Robins-Browne, R.M. (1999). Characterization of the interaction between Yersinia enterocolitica biotype 1A and phagocytes and epithelial cells in vitro. Infect Immun 67, 4367-4375.

11. RU 2264455 С1, 28.01.2004.

12. Fredriksson-Ahomaa M., Korkeala H. Low Occurrence of Pathogenic Yersinia enterocolitica in Clinical, Food, and Environmental Samples: a Methodological Problem. Clinical microbiology reviews. 2003. P.220-229.

13. Куляшова Л.Б., Ценева Г.Я., Буйневич Ю.Б. Роль антигенов наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis в патогенезе и диагностике псевдотуберкулеза. - Журн. Микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. 1997. №1. С.14-18.

14. Trebesius, К., D. Harmsen, A. Rakin, J. Schmelz, and J. Heesemann. Development of rRNA-targeted PCR and in situ hybridization with fluorescently labeled oligonucleotides for detection of Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 1998. V.36. C.2557-2564.

15. EP 0645460 B1, 17.03.1989.

16. US 6197514 B1, 12.04.1999.

17. US 0197789 A1, 21.05.2002.

18. US 5654144, 24.04.1995.

Изобретение относится к биотехнологии. Разработан способ экспресс диагностики бактерий рода Yersinia, который основан на методе мультиплексной ПЦР с последующим анализом длин амплифицированных фрагментов и предусматривает родовую идентификацию бактерий рода Yersinia и видовую идентификацию патогенных для человека видов (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica). В качестве мишени выбран ген, кодирующий OmpF порин. Изобретение позволяет осуществлять одновременную детекцию и дифференциальную диагностику патогенных и непатогенных видов иерсиний, а также видовую идентификацию патогенных для человека видов бактерий рода Yersinia, при этом повышается специфичность диагностики, уменьшается временя проведения анализа, происходит упрощение анализа, уменьшается стоимость диагностики. Изобретение может быть использовано в медицине для диагностики острых и хронических форм инфекций, вызываемых бактериями рода Yersinia; в ветеринарной практике для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, вызываемых иерсиниями, и бактерионосителей, а также для проведения исследований бактериальной обсемененности иерсиниями эпидемиологически значимых объектов (теплиц, овощехранилищ, пищеблоков и т.п.). 2 ил., 2 табл.

Способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом мультиплексной ПЦР с последующим гель-электрофорезным анализом длин амплифицированных фрагментов, заключающийся в том, что детекцию иерсиний осуществляют путем амплификации участка гена OmpF порина иерсиний с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и Y-R (SEQ ID NO:2) на основе образования ПЦР-продукта, длина которого составляет 427-472 п.н.; идентификацию и дифференциацию патогенных видов иерсиний путем: а) амплификации участка гена OmpF порина Y. pestis с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и YP-R (SEQ ID NO:3) и образования ПЦР-продукта с длиной 754 п.н.; амплификации участка гена OmpF порина Y. pseudotuberculosis с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и YPS-R (SEQ ID NO:4) и образования ПЦР-продукта с длиной 503 п.н.; в) амплификации участка гена OmpF порина Y. enterocolitica с помощью праймеров Y-F (SEQ ID NO:1) и YE-R (SEQ ID NO:5) и образования ПЦР-продукта с длиной 270 п.н.; дифференциальную диагностику непатогенных видов рода Yersinia от патогенных видов этого рода, согласно которой у непатогенных видов иерсиний с помощью набора праймеров (Y-F (SEQ ID NO:1), Y-R (SEQ ID NO:2), YP-R (SEQ ID NO:3), YPS-R (SEQ ID NO:4) и YE-R (SEQ ID NO:5)) образуется только один специфичный ПНР-продукт, а у патогенных видов иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) образуются два специфичных ПЦР-продукта.