СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано в экспресс-идентификации штаммов, принадлежащих к виду Y.pseudotuberculosis, и их дифференциации от близкородственных видов, а именно: Y.pestis и Y.enterocolitica.

В настоящее время в лабораторной диагностике предпочтение отдано методам полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанной на выявлении специфических фрагментов ДНК.

Известен способ идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica (см. А.М.Стенкова, М.П.Исаева и др. «Разработка многопраймерной ПЦР для идентификации бактерий рода Yersinia и патогенных видов Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica», Журнал «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология». Москва, Медицина, №3, 2008, стр.18), заключающийся в том, что используют шесть различных праймеров, два из которых родоспецифические, а четыре - видоспецифические.

Однако известный способ требует много времени и затрат, что повышает его стоимость и срок выполнения, а кроме того, диагностическая достоверность требует доработки на большом числе образцов, что в итоге позволяет сделать вывод о низкой эффективности способа.

Наиболее близким по технической сущности является способ идентификации штаммов вида Yersinia pestis и Y.pseudotuberculosis (см. патент RU №2422535, кл. C12Q 1/68, 27.06.2011), заключающийся в том, что исследуемую пробу изучают двумя методами, путем постановки реакции иммунофлюоресценции (НИМФ) и ПЦР, причем первый метод включает обнаружение капсульного антигена F1 и поверхностного белка PEV с помощью моноклональных антител к этим белкам, а второй - идентификацию бактерий на основе родо- и и видоспецифических праймеров в ПЦР, при этом синтез специфических фрагментов ДНК, направляемых парой праймеров vlm33for/JSrev1759, подтверждает наличие в пробе штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.

Однако использование реакции непрямой иммунофлюоресценции с помощью МКА, с одной стороны, снижает чувствительность метода, поскольку для обнаружения искомых бактерий в поле зрения при визуальном обследовании мазков необходимо содержание бактерий в исследуемой пробе не менее 10⁶ м.к., а с другой стороны - использование МКА двух видов (к капсульному антигену F1 и поверхностному белку чумного микроба) приводит к удорожанию тест-системы в целом, двухэтапная постановка увеличивает срок выполнения.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового простого и эффективного способа, позволяющего с высокой степенью достоверности проводить идентификацию штаммов вида Y.pseudotuberculosis и дифференциацию этого вида с близкородственными видами Y.pestis и Y.enterocolitica.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе видовой идентификации и дифференциации штаммов Yersinia pseudotuberculosis от Yersinia pestis и Yersinia enterocolitica, включающем ПЦР диагностику иерсиний псевдотуберкулеза путем использования видоспецифических праймеров, которые представлены в виде двух нуклеотидных последовательностей htr03-htr04, последние осуществляют детекцию возбудителя псевдотуберкулеза путем амплификации участка специфического гена htrB, детерминирующих продукцию специфического фрагмента размером 229 п.н., учет результатов исследуемых штаммов оценивают как положительный при обнаружении специфического фрагмента размером 229 п.н., который подтверждает принадлежность штамма к Y.pseudotuberculosis, а его отсутствие дает возможность идентифицировать и дифференцировать последний от близкородственных Y.pestis и Y.enterocolitica.

Кроме того, нуклеотидные праймеры htr03-htr04 имеют следующие последовательности:

htr03 CGCGACCACCACTGGCACTT

htr04 AAAGCGACGGTGCAGCCACA

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа предварительно конструируют праймеры к фрагменту специфического гена htrB (YPTB2490), детерминирующему продукцию lipid A biosynthesis lauroyl acyltransferase. Из известных источников информации htrB содержится только в штаммах Y.pseudotuberculosis и отсутствует у близкородственных видов Y.pestis. (1) У близкородственных Y.enterocolitica этот ген имеет некоторые отличия (Perez-Gutierrez, 2010) (2).

Для конструирования специфических праймеров нуклеотидные последовательности генов htrB Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica были проанализированы с помощью пакета авторских программ ALINMENT. В ходе компьютерного анализа в структуре гена htrB Y.pseudotuberculosis был идентифицированы видоспецифические участки, к которым были сконструированы комплементарные олигонуклеотидные праймеры htr03 и htr04.

Последние обладают полной гомологией с геном htrB Y.pseudotuberculosis. Указанные праймеры детерминируют продукцию специфического фрагмента размером 229 нуклеотидов и имеют следующие последовательности:

htr03 CGCGACCACCACTGGCACTT

htr04 AAAGCGACGGTGCAGCCACA

Кроме того, предварительным этапом проведения способа является выделение ДНК-мишени, которая может включать нуклеотидную последовательность гена гена htrB.

Перед постановкой ПНР проводят предварительную подготовку материала (выделение ДНК). Массу бактерий, сформировавших колонию или газон, стерильной палочкой перемещают в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл дистиллированной воды, после чего выделяют ДНК как принято МУ 1.3.1791-9 (3).

Далее проводят амплификацию исследуемой ДНК со специфическими праймерами htr03 и htr04.

Условия проведения реакции амплификации.

Амплификацию проводитят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 60°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 7 мин (1 цикл).

Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК - матрицы, 0,25 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК, полученную из разных штаммов бактерий рода Yersinia.

Анализ продуктов амплификации проводят с помощью электрофореза в 2% агарозном или 10% полиакриламидном геле.

Учет результатов, а именно идентификацию проводят по анализу длин амплифицированных фрагментов. В случае появления специфического ампликона длинной 229 пар нуклеотидов оценивают результат как положительный, подтверждающий обнаружение специфического гена htrB, и поэтому делают вывод о принадлежности исследуемого штамма к Y.pseudotuberculosis. Отсутствие специфического ампликона дает отрицательный результат, позволяя дифференцировать близкородственные виды Y.pestis и Y.enterocolitica от Y.pseudotuberculosis.

Пример 1.

Подтверждающий видовую идентификацию и дифференциацию Y.pseudotuberculosis (штаммы 5343, 10358, 12309, 12312, 19049, 1992, 1993, 1995, 1985, 1988, 1991) от Y.pestis (EV 1290, 1255, 13287, 12259, 14710). Штаммы взяты из коллекции Ростовского противочумного института.

Предварительно выделяют ДНК исследуемых штаммов (МУ 1.3.1791-9) и далее проводят ПЦР с видоспецифическими олигонуклеотидными праймерами htr03-htr04. Затем проводят амплификацию по вышеуказанной схеме.

Результат электрофоретического разделения фрагментов ДИК в 10% геле полиакриламида представлен на фото, на котором показано, что лунки 1-11 содержат препарат ДНК из штаммов Y.pseudotuberculosis, а лунки 13-17 содержат препарат ДНК из штаммов Y.pestis. Лунка 12 содержит препарат ладдеров ДНК. Стрелка указывает на локализацию целевого специфического фрагмента 229 п.н.

Таким образом, только штаммы возбудителя псевдотуберкулеза формируют в ПЦР с видоспецифичными олигонуклеотидными праймерами htr03-htr04 целевой фрагмент массой 229 п.н.

Пример 2.

ПЦР-анализ штаммов Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis.

Манипуляции проводят как в примере 1, но в качестве объекта исследования используют штаммы возбудителя чумы и кишечного иерсиниоза (см. Таблицу).

Из данных таблицы видно, что только штаммы возбудителя чумы и кишечного иерсиниоза не формируют в ПЦР с видоспецифичными олигонуклеотидными праймерами htr03-htr04 целевой фрагмент массой 229 п.н. Указанный фрагмент образуется только в случае исследования ДНК Yersinia pseudotuberculosis

Следовательно, предложенный способ позволяет проводить дифференциации штаммов Y.pseudotuberculosis от Y.pestis и Y.enterocolitica.

Использование предлагаемого изобретения, основанного на монолокусной ПЦР с последующим гель-электрофоретическим анализом длин амплифицированных фрагментов, дает возможность в режиме тест-системы с высокой степенью достоверности определять видовую принадлежность и проводить дифференциацию близкородственных штаммов Y.pseudotuberculosis от Y.pestis и Y.enterocolitica.

Предложенный способ можно использовать в практической деятельности лабораторий Ростпотребнадзора, использующих в своей практической деятельности методы генной диагностики для постановки правильного диагноза и определения стратегии проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Источники информации

1. Pouillot F., Fay lle С., Carniel E. Characterization of chromosomal regions conseroed in Yersinia pseudotuberculosis and lost by Yersinia pestis.

Jnfect. Jmmun 2008, 76(10): 4692-4599.

2. Perez-Gutierrez C., Llobet E., Llomport C. et al Role of lipida acylation in Yersinia enterocolitica.

Jnfect. Jmmun. 2010, 78(6): 2768-2781.

3. Методические указания МУ 1.3.1791-9 «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1 и 2 группы патогенности» - М., 2003 - 38 с.

Таблица № Штамм Результат в ПЦР 1 Y.enterocolitica 1999 отрицат 2 Y.enterocolitica 2000 отрицат 3 Y.enterocolitica 2012 отрицат 4 Y.enterocolitica 5508 отрицат 5 Y.enterocolitica 5515 отрицат 6 Y.pestis 231 отрицат 7 Y.pestis 1912 отрицат 8 Y.pestis 5191 отрицат 9 Y.pestis C-540 отрицат 10 Y.pestis 1709 отрицат 11 Y.pestis 1300 отрицат 12 Y.pestis 14771 отрицат 13 Y.pestis 3466/2 отрицат 14 Y.pestis 1213 отрицат 15 Y.pestis 1706 отрицат 16 Y.pestis 11695 отрицат 17 Y.pestis 1468 отрицат 18 Y.pestis 13280 отрицат 19 Y.pestis 1254 отрицат 20 Y.pestis 1687 отрицат 21 Yersinia pseudotuberculosis 5343 положит

Изобретение касается экспресс-идентификации штаммов, принадлежащих к виду Yersinia pseudotuberculosis, и их дифференциации от близкородственных видов, а именно Y.pestis и Y.enterocolitica. Сущность способа заключается в использовании видоспецифических праймеров, состоящих из двух нуклеотидных последовательностей htr03-htr04, осуществляющих детекцию возбудителя псевдотуберкулеза путем амплификации участка специфического гена htrB и детерминирующих продукцию специфического фрагмента размером 229 п.н. Учет результатов исследуемых штаммов оценивают как положительный при обнаружении специфического фрагмента размером 229 п.н. При наличии данного фрагмента определяют принадлежность штамма к Y. pseudotuberculosis. Нуклеотидные последовательности праймеров htr03-htr04 приведены в формуле изобретения и описании. Использование способа позволяет с высокой степенью достоверности идентифицировать штаммы вида Yersinia pseudotuberculosis и дифференциацию этого вида с близкородственными видами Y.pestis и Y.enterocolitica. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил., 2 пр.

1. Способ видовой идентификации и дифференциации штаммов Yersinia pseudotuberculosis от Yersinia pestis и Yersinia enterocolitica, включающий ПЦР диагностику иерсиний псевдотуберкулеза путем использования видоспецифических праймеров, отличающийся тем, что видоспецифические праймеры состоят их двух нуклеотидных последовательностей htr03-htr04, которые осуществляют детекцию возбудителя псевдотуберкулеза путем амплификации участка специфического гена htrB, детерминирующих продукцию специфического фрагмента размером 229 п.н., учет результатов исследуемых штаммов оценивают как положительный при обнаружении специфического фрагмента размером 229 п.н., который подтверждает принадлежность штамма к Y.pseudotuberculosis, а его отсутствие дает возможность идентифицировать и дифференцировать последний от близкородственных Y.pestis и Y.enterocolitica.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидные праймеры htr03-htr04 имеют следующие последовательности:
htr03 CGCGACCACCACTGGCACTT,
htr04 AAAGCGACGGTGCAGCCACA.