СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ YERSINIA ENTEROCOLITICA Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/08 C12Q1/70 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике заболевания иерсиниозом, вызываемым Yersinia enterocolitica.

В связи с возрастающей ролью Y. enterocolitica в инфекционной патологии человека большое значение придают лабораторной диагностике возбудителя, и, в частности, фагодиагностике.

При схожести многих биологических свойств чумного, псевдотуберкулезного и кишечноиерсиниозного микробов отличительным их признаком является неодинаковая лизабельность гомо- и гетерологичными фагами.

В настоящее время для идентификации Y. enterocolitica диагностический фаг не был разработан. В отличии от чумного и псевдотуберкулезного микробов, устойчивость к препаратам (МПК 100-2500 мкг/мл) пенициллинового ряда является видовым признаком у Y. enterocolitica. К ампициллину бактерии Y. enterocolitica устойчивы до 1600 мкг/мл.

Поиск новых методов в бактериологической диагностике Y. enterocolitica актуален и в первую очередь связан с необходимостью выделить специфические свойства микроорганизма эффективным, простым и надежным способом.

Известен способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (см. пат. RU №2385941, кл. C12Q 1/00, опубликовано 10.04.2010 г.), заключающегося в использовании метода мультиплексной ПЦР с последующим гель-электрофорезным анализом длин амплифицированных фрагментов, при этом дифференциальную диагностику непатогенных видов рода Yersinia от патогенных видов рода, проводят с помощью набора праймеров [V-F (SEQID NO:1), Y-R (SEQ ID NO:2), YP-R (SEQ ID NO:5)], образуя только один специфический ПЦР-продукт, а у патогенных видов иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) образуются два специфических ПЦР-продукта.

Недостатком известного способа является его сложность в осуществлении, так как требуются смысловые родоспецифические пары праймеров, кодирующие пептид RLGFAGhK, и антисмысловые видоспецифические праймеры, обладающие гомологией на 95-100% с нуклеотидной последовательностью.

За прототип нами выбран наиболее близкий по технической сущности способ идентификации холерных вибрионов O1 двух биоваров (см. МУК 4.2.2 218-07 «Лабораторная диагностика холеры». Москва, 2007, с.40-41), заключающийся в том, что определяют чувствительность холерных вибрионов к полимиксину В и диагностическим холерным фагам (классическому и эльтор). При этом холерные вибрионы биовара cholerae чувствительны к полимиксину и не растут на агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина, у холерных вибрионов биовара eltor наблюдается устойчивость к нему. Далее определяют биовар на основании лизабельности одним из диагностических фагов (эльтор или классическим).

Недостатком способа является невозможность его применения для диагностики возбудителя иерсиниоза Y. enterocolitica, что связано с отсутствием роста на щелочном агаре при pH 7,6-7,8, которым требуется агар Хоттингера (pH 7,1-7,2); оптимальной температуре выращивания вибрионов при 37°C, что не соответствует условиям роста иерсиний при 28°C; холерные фаги специфически лизируют холерные вибрионы и не активны к бактериям Y. enterocolitica. Препарат полимиксин (50 мкг/мл) не оказывает бактериостатического действия на холерные вибрионы биовара eltor, в то же время ингибирует рост иерсиний в концентрации 0,4-25,6 мкг/мл.

Таким образом, фагодиагностика, используемая в известном способе, требует для Y. enterocolitica определенного специфического фага, чувствительного к данному виду иерсиний.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в повышении эффективности идентификации Y. enterocolitica за счет изыскания простого способа путем применения бактериофага, специфически лизирующего только бактерии этого вида иерсиний на среде с ампициллином.

Поставленная задача достигается тем, что применяют кишечноиерсиниозный фаг ФК-100, который наносят в виде дорожки на двухслойный газон, нижний слой которого представляет собой агаровую среду (pH 7,1) с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, а верхний получают из исследуемого штамма, который выращивают на 1,5% агаре Хоттингера при 28°C в течение суток и засевают в 4 мл бульона Хоттингера, сутки инкубируют при температуре 28°C до конечной концентрации n·10⁸ м.к./мл, после чего 0,3 мл полученной культуры смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Хоттингера с 50 мкг/мл ампициллина и выливают вторым слоем на пластинки агара, после этого посев инкубируют при 28°C в течение 20-24 часов и проводят идентификацию по наличию зоны фаголизиса на выросшей культуре, которая подтверждает наличие в исследуемой пробе Y. enterocolitica.

Для проведения способа заявителем использован бактериофаг кишечноиерсиниозный 1999, который депонирован в коллекции лаборатории бактериофагов РостНИПЧИ под номером ФК-100.

В качестве контроля для проверки литического действия фага применяются два вида микроорганизмов иерсиний: фагочувствительный и ампициллиноустойчивый индикаторный штамм Y. enterocolitica 2012 (депонированный в ГКПБ РНИПЧИ «Микроб» г.Саратов под номером КМ-206) и фагорезистентный и ампициллиночувствительный штамм Y. pseudotuberculosis 10368 (депонированный в ГКПБ РНИПЧИ «Микроб» г.Саратов под номером КМ-207).

Штамм Yersinia enterocolitica 2012 (KM-206) выделен от человека (Бельгия), получен в 1966 году музеем живых культур РостНИПЧИ и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Подвижные при 22°C палочки имеют жгутики, грамотрицательны. Спор и капсул не образуют. На плотной питательной среде (агар Хоттингера, pH 7,2) образует мелкие, выпуклые, прозрачные колонии через 18-20 часов выращивания при 25-28°C. В бульоне Хоттингера, pH 7,2, дает равномерное помутнение среды.

Физиолого-биохимические свойства. Тест на оксидазу отрицательный. Разлагает до кислоты без газа глюкозу, маннит, сахарозу, глицерин, ксилозу, сорбит, не активен к рамнозе, лактозе, рафинозе. Проба на уреазную активность -, Кристенсен ++++. Питательные потребности - прототроф. Отношение к видовым диагностическим сывороткам - биотип 3. Антигенные свойства штамма - серотип 3. Устойчив к ампициллину (до 1600 мг/мл).

Отношение к гомо- и гетерологичным фагам. Штамм лизируется фагами, изолированными из лизогенных культур Yersinia enterocolitica 1, 3, 12 сероваров и устойчив к фагам: диагностическому чумному Л-413С, диагностическому чумному Покровской (П), диагностическому псевдотуберкулезному фагу. Штамм устойчив к пенициллину 1000 ед./мл; оксацилину 2500 ед./мл; левомицетину 10 ед./мл; тетрациклину 5 ед./мл. Штамм является индикаторным для фагов V морфогруппы. Титры фагов, размноженных на штамме, составляют n·10⁷-n·10⁸ частиц/мл. Штамм КМ 206 размножается в бульоне и на агаре Хоттингера (pH 7,2), хранят его в лиофилизированном состоянии. Способен выявлять и обеспечивать репродукцию умеренных фагов. С помощью штамма КМ 206 изолированы фаг 1998 - выделен из лизогенного штамма Y. enterocolitica 1 серовара; фаг 1999 - из штамма Y. enterocolitica 12 серовара; фаг 2010 - из штамма Y. enterocolitica 3 серовара.

Штамм Y. pseudotuberculosis 10368 (КМ-207) выделен от человека (Бурятская АССР) и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Подвижные, короткие палочки с закругленными концами, грамотрицательны. Спор и капсул не образуют. На плотной питательной среде (агар Хоттингера pH 7,2) образует круглые, слегка выпуклые колонии, серовато-желтого цвета через 18-20 часов выращивания при 25-28°C. В бульоне Хоттингера (pH 7,2) дает равномерное помутнение среды.

Физико-биохимические свойства. Разлагает до кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, рамнозу, глицерин. Не активен к инозиту, лактозе, сахарозе. Индол не продуцирует, уреазная активность +. Чувствителен к ампициллину (12,5 мкг/мл). Питательные потребности - прототроф.

Отношение к гомо- и гетерологичным фагам. Штамм устойчив к бактериофагу диагностическому чумному Л-413С, чувствителен к бактериофагу диагностическому чумному Покровской (П), диагностическому бактериофагу псевдотуберкулезному. Титры фагов, размноженных на штамме, составляют n·10⁷-n·10⁸ частиц/мл. Штамм KM 207 размножается в бульоне и на агаре Хоттингера (pH 7,2). Хранят его в лиофилизированном состоянии.

Способ осуществляют на штаммах Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis.

Пример 1. Лизис кишечноиерсиниозным бактериофагом штамма Y. enterocolitica на среде с ампициллином (50 мкг/мл)

Штамм Y. enterocolitica 2012 (КМ-206) выращивают на 1,5% агаре Хоттингера в чашке Петри при 28°С в течение суток. Одну петлю полученной суточной агаровой культуры засевают в 4 мл бульона Хоттингера и сутки выращивают при температуре 28°С до конечной концентрации n·10⁸ м.к./мл. Затем 0,3 мл бульонной культуры и 0,1 мл ампициллина в концентрации 50 мкг/мл вносят в 4 мл 0,7% агара Хоттингера, предварительно растопленного и охлажденного до 45-47°C.

Полученную смесь выливают вторым слоем на поверхность пластины 1,5% агара Хоттингера, заготовленную заранее и уже содержащую 50 мкг/мл ампициллина (pH 7,1-7,2). После застывания верхнего слоя на последний наносят кишечноиерсиниозный фаг ФК-100 в виде «дорожки» на газон засеянной культуры.

После этого посев инкубируют в термостате при 28°C в течение 20-24 часов и учитывают результат.

Таким образом, наблюдаем рост культуры и присутствие зоны лизиса культуры в месте нанесения фага, что подтверждает присутствие штамма Y. enterocolitica.

Пример 2. Посев штамма Y. pseudotuberculosis на агар с добавлением ампициллина

Посев штамма Y. pseudotuberculosis 10368 (КМ-207) выращивают на 1,5% агаре Хоттингера в чашке Петри при 28°C в течение суток и все последующие действия проводят также, как описано в примере 1, но без нанесения фага и с использованием ампициллина.

Посев инкубируют в термостате при 28°C в течение 20-24 часов и учитывают результат.

Наблюдаем отсутствие роста микроба Y. pseudotuberculosis на среде с ампициллином, то есть в пробе отсутствует микроб вида Y. enterocolitica.

Пример 3. Посев штамма Y. pseudotuberculosis на среду без антибиотика и проведение пробы с кишечноиерсиниозным фагом

Посев штамма Y. pseudotuberculosis на агар Хоттингера и проведение пробы с кишечноиерсиниозным фагом осуществляют, как в примере 2, без добавления ампициллина. Наличие роста штамма Y. pseudotuberculosis и отсутствие литического пятна, свидетельствующее о фагоустойчивости бактерий, расценивается в пользу микроба Y. pseudotuberculosis.

Заявителем на среде с ампициллином были идентифицированы 75 штаммов Y. enterocolitica (см. таблицу), а также в испытание вошли 80 штаммов Y. pseudotuberculosis. Штаммы Y. pseudotuberculosis не дали роста на агаровой среде с антибиотиком, а на агаре Хоттингера без добавления ампициллина были устойчивы к кишечноиерсиниозному фагу. В таблице представлены результаты эффективного использования способа у всех идентифицированных штаммов вида Y. enterocolitica.

Таким образом, представители рода Yersinia Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis различаются по чувствительности к кишечноиерсиниозному фагу и антибиотику ампициллину. Штаммы Y.pseudotuberculosis не способны расти на среде с антибиотиком и устойчивы к бактериофагу.

Исходя из вышеизложенного, применение лизабельности фагом ФК-100 на двойном слое питательной среды с усиленным ингибирующим действием ампициллина дает 100% эффективность идентификации Y. enterocolitica.

Использование предложенного способа позволяет эффективно применять его в лабораторной диагностике: так как выраженная зависимость чувствительности к фагу ФК-100 от вида у штаммов, на которых он культивируется, условия выращивания в присутствии антибиотика в среде позволяет использовать его в качестве дополнительного теста дифференциации возбудителей кишечного иерсиниоза, который может быть применен в лабораторной диагностике для того, чтобы:

- дифференцировать фагочувствительные штаммы Y. enterocolitica от резистентных к кишечноиерсиниозному фагу штаммов Y. pseudotuberculosis;

- применять для выявления Y. enterocolitica в смешанных пробах с Y. pseudotuberculosis признак устойчивости к ампициллину;

- проводить типирование Y. enterocolitica фагом ФК-100 штаммов различных O-сероваров.

Изобретение относится к лабораторной диагностике заболевания иерсиниозом, вызываемым Yersinia enterocolitica. Для идентификации возбудителя иерсиниоза применяют кишечноиерсиниозный фаг ФК-100, который наносят в виде дорожки на двухслойный газон, нижний слой которого представляет собой агаровую среду (рН 7,1) с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, а верхний получают из исследуемого штамма, который выращивают на 1,5% агаре Хоттингера при 28°С в течение суток и засевают в 4 мл бульона Хоттингера, инкубируют при температуре 28°С до конечной концентрации n·10⁸ м.к./мл, после чего 0,3 мл полученной культуры смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Хоттингера с 50 мкг/мл ампициллина и выливают вторым слоем на пластинки агара. Посев инкубируют при 28°С в течение 20-24 часов. Yersinia enterocolitica в исследуемой пробе идентифицируют от других видов иерсиний по наличию зоны фаголизиса на выросшей культуре. Способ обеспечивает 100%-ную эффективность идентификации. 1 табл., 3 пр.

Способ идентификации Yersinia enterocohlitica путем использования лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде и устойчивости его к антибиотику, отличающийся тем, что применяют кишечноиерсиниозный фаг ФК-100, который наносят в виде дорожки на двухслойный газон, нижний слой которого представляет собой агаровую среду (рН 7,1) с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, а верхний получают из исследуемого штамма, который выращивают на 1,5% агаре Хоттингера при 28°С в течение суток и засевают в 4 мл бульона Хоттингера, сутки инкубируют при температуре 28°С до конечной концентрации n·10⁸ м.к./мл, после чего 0,3 мл полученной культуры смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Хоттингера с 50 мкг/мл ампициллина и выливают вторым слоем на пластинки агара, после этого посев инкубируют при 28°С в течение 20-24 ч и проводят идентификацию по наличию зоны фаголизиса на выросшей культуре, которая подтверждает наличие в исследуемой пробе Y. enterocolitica.