СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПОКСИИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики гипоксии при различных патологических состояниях.

Гипоксия - типовой патологический процесс, который возникает вследствие недостаточного поступления кислорода в ткани и клетки организма или вследствие нарушения его использования в реакциях биологического окисления (Шевченко Ю.Л. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. СПб.: ООО «ЭЛБИ-СПб», 2000, с.12). В этой связи нарушения кислородного гомеостаза необходимо оценивать на нескольких уровнях, в частности на уровне количественного и модуляционного механизмов.

Известно, что гипоксия является ведущим повреждающим фактором при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, бронхо-легочной патологии, заболеваниях крови. Наиболее опасным является формирование гипоксии у женщин при физиологическом и осложненном течении беременности, так как это приводит к развитию различных форм фетоплацентарной недостаточности, что сопровождается внутриутробной гипоксией плода и в тяжелых случаях может привести к его антенальной гибели (Анастасьева В.Г. Морфофункциональные нарушения фетоплацентарного комплекса при плацентарной недостаточности. Новосибирск, 1997, с.506).

Высокая частота встречаемости экстрагенитальной патологии у беременных женщин и наличие большого числа осложнений, сочетающееся с несвоевременной диагностикой гипоксии, диктуют необходимость поиска новых современных способов диагностики этой патологии, что позволит осуществлять индивидуальную этиопатогенетически обоснованную терапию, направленную на снижение частоты заболеваемости. Поэтому разработка новых методов диагностики гипоксии является одной из фундаментальных и актуальных проблем здравоохранения.

Проведенные исследования по научно-медицинской и патентной литературе выявили различные способы диагностики гипоксии.

Авторским свидетельством СССР № 1175442 (1985 г., БИ № 32) защищен «Способ диагностики гипоксии мозга у новорожденных», заключающийся в определении содержания гомокарнозина в крови пациента с помощью электрофореза. Недостатком данного способа является то, что процесс его реализации вызывает определенные трудности, такие как наличие специальной аппаратуры и специально подготовленного персонала. Необходимо указать, что данный способ является длительным, поскольку для электрофоретического обнаружения гомокарнозина требуется не менее 21 часа.

В авторском свидетельстве СССР № 1215657 (1986 г., БИ № 9) описан «Способ диагностики нарушения кислородного обмена», заключающийся в определении парциального давления кислорода и коэффициента скорости его утилизации при ишемии ткани. Исследование проводят на полярографе в постоянном токовом режиме, для этого катод - платиновый электрод открытого типа вводят в мышцу предплечья на глубину 15-20 мм от поверхности кожи, а анод - хлорсеребряный электрод накладывают на тыльную поверхность кисти. По исходной силе тока рассчитывают величину напряжения кислорода в ткани, затем создают ишемию и определяют коэффициент скорости потребления кислорода, а после снятия ишемии - коэффициент скорости восстановления кислорода. На основе полученных результатов рассчитывают кислородный баланс ткани. Недостатком данного способа является то, что процесс его реализации вызывает определенные трудности, такие как наличие специальной аппаратуры и специально подготовленного персонала. Данный способ является технически сложным, поскольку требуется проводить определение кислородного обмена с помощью электродов, один из которых вводят в мышцу предплечья. Кроме того, для реализации данного способа требуется создание регионарной ишемии ткани, что в некоторых случаях может усугубить имеющуюся тканевую гипоксию.

Авторским свидетельством СССР № 1673041 (1991 г., БИ №32) защищен «Способ диагностики гипоксии», который заключается в определении количества гемоглобина и кислорода в артериальной крови пациента. По полученным данным рассчитывают должную кислородную емкость крови до и после дополнительного насыщения порции крови кислородом на сатураторе в стандартных условиях с последующим расчетом должного и фактического сердечного индексов, а также величины возможного транспорта и минутного индекса циркулирующего кислорода. Недостатком данного способа является его трудоемкость и сложность, так как необходимо использовать специальное оборудование для насыщения кислородом порции артериальной крови в стандартных условиях in vitro, что требует наличие специально подготовленного персонала.

В патенте РФ № 2241378 (2004 г., БИПМ № 34) описан «Способ определения степени утилизации кислорода тканями в организме», который заключается в определении величины насыщения кислородом артериальной и смешанной венозной крови с последующим вычислением коэффициента утилизации кислорода, при этом одновременное измерение величины насыщения кислородом артериальной и смешанной крови осуществляют методом отражательной спектрофотометрии, для чего катетеры с фиброоптическими датчиками устанавливают одновременно в бедренную и легочную артерии. Недостатком данного способа является то, что процесс его реализации вызывает определенные трудности, такие как наличие специальной аппаратуры и специально подготовленного персонала. Данный способ является технически сложным, поскольку требует одновременного введения датчиков в бедренную и легочную артерию. Кроме того, у данного способа недостаточная достоверность, так как он не учитывает особенности оксигенации гемоглобина крови кислородом.

В заявке РФ № 2007102560 (2008 г., БИПМ № 21) описан «Способ оценки гипоксии», который заключается в исследовании клеток небных миндалин, полученных путем соскоба. При увеличении количества пролиферирующих клеток с дискориозом до 92±2,6 и уменьшении количества лимфоцитов до 18±0,15% диагностируют гипоксию у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Недостатком данного способа является то, что он технически сложный и позволяет диагностировать гипоксию только у пациентов с хронической сердечной недостаточностью.

Наиболее близким техническим решением, выбранным нами в качестве прототипа диагностики гипоксии, является «Способ диагностик кислородной недостаточности», защищенный авторским свидетельством СССР № 545335 (1977 г., БИ № 5), заключающийся в исследовании венозной крови пациента, в которой определяют активность гликолитических ферментов для выявления начальной стадии кислородной недостаточности в эритроцитах с помощью электрофореза на основе дополнительной анодной фракции изофермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ), расположенной между ЛДГ₂ и ЛДГ₃, при содержании которой более 4% от общей активности ЛДГ диагностируют гипоксию. Однако у данного способа имеется ряд недостатков. В частности, он является длительным, поскольку для электрофоретического обнаружения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы требуется не менее 16 часов. Необходимо указать так же на недостаточную достоверность данного способа, так как осуществляется анализ только изоферментного спектра лактатдегидрогеназы эритроцитов, который позволят выявить нарушения кислородного гомеостаза только на эритроцитарном уровне и не учитывает сродство кислорода к гемоглобину, а также возможность утилизации молекулярного кислорода в дыхательной цепи переноса электронов.

Целью изобретения является сокращение времени исследования и повышение достоверности диагностики гипоксии.

Поставленная цель достигается тем, что у пациента исследуют венозную кровь, в плазме которой определяют активность цитохромоксидазы, а в эритроцитах - концентрацию 2,3-дифосфоглицерата и концентрацию молочной кислоты. Затем рассчитывают величину коэффициента оксигенации К по формуле:

K=(C₁+C₂):A,

где А - активность цитохромоксидазы плазмы, моль/л;

C₁ - концентрация 2,3-дифосфоглицерата эритроцитов, моль/л;

С₂ - концентрация молочной кислоты эритроцитов, моль/л.

Если коэффициент оксигенации К>1,0, то диагностируют гипоксию.

Подробное описание способа.

У пациента берут из вены 4,5 мл крови в центрифужную пробирку, затем добавляют 0,5 мл гепарина. Центрифугируют на центрифуге, например типа ЦЛК-1 при 3000 об/мин в течение 10 минут. В результате центрифугирования крови выделяют плазму и эритроциты.

В полученной плазме крови определяют активность цитохромоксидазы спектрофотометрическим методом по Кривченковой Р.С. (Кривченкова Р.С. Определение активности цитохромоксидазы в суспензии митохондрий. Современные методы в биохимии. М., 1977, с.47-49) в реакции с диметил-парафенилаланином при длине волны 536 нм. Активность выражают в моль/л.

В полученных эритроцитах колориметрическим способом определяют концентрацию 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) по методу Лугановой И.С. и Блинова М.Н. (Луганова И.С., Блинов М.Н. Определение 2,3-ДФГ неэнзиматическим методом и АТФ в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом. // Лабораторное дело. 1975, № 7, с.652-654.). Расчет производят по калибровочному графику, полученные результаты выражают в моль/л.

Концентрацию молочной кислоты в эритроцитах определяют колориметрическим методом по Меньшикову В.В. (Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования к клинике. М., 1987, с.368). Расчет производят по калибровочному графику, результат выражают в моль/л.

Затем рассчитывают величину коэффициента оксигенации К по формуле:

K=(C₁+C₂):A,

где А - активность цитохромоксидазы плазмы, моль/л;

C₁ - концентрация 2,3-дифосфоглицерата эритроцитов, моль/л;

С₂ - концентрация молочной кислоты эритроцитов, моль/л.

Если коэффициент оксигенации К>1,0, то диагностируют гипоксию.

Известно, что кислородное снабжение организма в значительном мере определяется функциональным состоянием системы крови, ее способностью связывать кислород в легких и отдавать его в тканевых капиллярах (Олемпиева Е.В., Логинов И.А., Бобырева И.В. Особенности кислородтранспортной функции крови и углеводно-энергетического обмена у женщин с гипертонической болезнью. Материалы VII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2008, с.104-107). В этой связи в качестве показателей оксигенации крови нами были выбраны параметры, отражающие сродство гемоглобина к кислороду, а именно концентрация 2,3-дифосфоглицерата, а также отражающий выраженность гипоксии субстрат углеводного обмена эритроцитов, а именно концентрация молочной кислоты (Микашинович З.И., Олемпиева Е.В., Шлык С.В., Логинов И.А. Метаболические аспекты внутриутробной гипоксии плода при сердечно-сосудистой патологии у беременных. Ростов-на-Дону, 2008, с.41-51). Для оценки эффективности переноса электронов от окисляемого субстрата на молекулярный кислород в дыхательной цепи переноса электронов в качестве показателя оксигенации крови нами была выбрана активность цитохромоксидазы (Северин Е.С. Биохимия: учебник для вузов. М., ГЭОТАР-МЕД, 2004, с.274-296).

Практическое применение заявляемого способа иллюстрируется примером из клинической практики.

Пример.

Пациентка П., 29 лет, история болезни № 18926 поступила в родильное отделение МУЗЛ ГБ № 1 им. Н.А.Семашко г.Ростова-на-Дону на плановые роды. На основании результатов допплерометрии плодового кровотока и сосудов пуповины на аппарате ультразвуковой диагностики типа TOSHIBA SSA-550A выявили нарушения маточно-плацентарной гемодинамики: индекс резистентности (Vs/Vd) правой маточной артерии (a. uterine dexstra) = 1,95; индекс резистентности (Vs/Vd) левой маточной артерии (a. uterine sinistra) = 2,12; индекс резистентносту (Vs/Vd) пуповинной артерии (a. umbilicalis) = 2,27; индекс резистентности (Vs/Vd) срединной мозговой артерии плода (a. cerebri medium) = 3,35, и был поставлен диагноз: беременность 39 недель, фетоплацентарная недостаточность.

Согласно заявляемому способу у пациентки взяли из вены 4,5 мл крови в центрифужную пробирку, затем добавили 0,5 мл гепарина. Полученную кровь центрифугировали на центрифуге типа ЦЛК-1 при 3000 об/мин в течение 10 минут. В результате центрифугирования крови выделили плазму и эритроциты. В плазме крови определили активность цитохромоксидазы А по методу Кривченковой Р.С. (Кривченкова Р.С.Определение активности цитохромоксидазы в суспензии митохондрий. Современные методы в биохимии. М., 1977, с.47-49) в реакции с диметил-пара-фенилаланином при длине волны 536 нм. А=13,95 моль/л. В эритроцитах определили концентрацию 2,3-дифосфоглицерата C₁ по методу Лугановой И.С. и Блинова М.Н. (Луганова И.С., Блинов М.Н. Определение 2,3-ДФГ неэнзиматическим методом и АТФ в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом. // Лабораторное дело. 1975., № 7. - с.652-654). Расчет производят по калибровочному графику. C₁=10,81 моль/л. В эритроцитах определили концентрацию молочной кислоты С₂ по методу Меньшикова В.В. (Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования к клинике. М., 1987, с.368). Расчет производят по калибровочному графику. С₂=7,38 моль/л. Затем рассчитали величину коэффициента оксигенации К по формуле:

K=(C₁+C₂):A=(10,81+7,38):13,95=l,3;

Так как коэффициент оксигенации К=1,3>1,0, то была диагностирована гипоксия и назначено медикаментозное лечение. Результаты проведенного лечения и отсутствие осложнений подтвердили достоверность поставленного, согласно заявляемому способу, диагноза.

Ретроспективный анализ 20 историй болезней беременных, которым проводили исследования согласно прототипу, показал, что гипоксия была диагностирована 17 пациенткам, то есть достоверность диагностического способа составила 85%, а среднее время, затраченное на проведение исследования, составило 16 часов. Выбор историй болезни беременных женщин был обусловлен тем, что развитие даже физиологической беременности сопровождается, как правило, гипоксией вследствие формирования дополнительного фетоплацентарного круга кровообращения.

С помощью предлагаемого «Способа диагностики гипоксии» были обследованы 70 беременных женщин. У 100% пациенток была диагностирована гипоксия и назначено лечение, результаты которого подтвердили правильность диагноза. Среднее время, затраченное на проведение исследования, составило 4 часа.

Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый «Способ диагностики гипоксии» позволяет повысить достоверность диагностики гипоксии на 15% и сократить время исследования с 16 часов до 4 часов.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики гипоксии при различных патологических состояниях. Для осуществления способа в плазме крови определяют активность цитохромоксидазы, в эритроцитах концентрацию 2,3-дифосфоглицерата и концентрацию молочной кислоты. Затем рассчитывают величину коэффициента оксигенации К по формуле: K=(C₁+C₂):A,

где А - активность цитохромоксидазы плазмы, моль/л;

C₁ - концентрация 2,3-дифосфоглицерата эритроцитов, моль/л;

C₂ - концентрация молочной кислоты эритроцитов, моль/л.

При коэффициенте оксигенации К>1,0 диагностируют гипоксию. Предлагаемый способ позволяет на 15% повысить достоверность диагностики гипоксии и сократить время исследования до 4 часов.

Способ диагностики гипоксии, заключающийся в исследовании венозной крови, отличающийся тем, что в плазме крови определяют активность цитохромоксидазы, в эритроцитах - концентрацию 2,3-дифосфоглицерата и концентрацию молочной кислоты, после чего рассчитывают величину коэффициента оксигенации К по формуле:
K=(C₁+C₂):A,
где А - активность цитохромоксидазы плазмы, моль/л;
C₁ - концентрация 2,3-дифосфоглицерата эритроцитов, моль/л;
С₂ - концентрация молочной кислоты эритроцитов, моль/л;
и при К>1,0 диагностируют гипоксию.