СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-3 В ПЛАЦЕНТЕ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 

Цель изобретения заключается в оценке повышения активности каспазы-3 в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции в третьем триместре беременности.

В настоящее время указывается на центральную роль протеаз в запуске и развитии апоптоза. Каспазы функционируют как медиаторы сигнала смерти (Hengartner М.О., 2000; Boldin М.Р., 1996; Saraste A., Pulkki К., 2000; Denault J., Salvesen G., 2008; Kaufmann S., Lee S., 2008; Earnshaw W.C., Martins L.M., 1999). Активизацию каспазы-3 отмечают при развитии лейкемии (Feng Y., Нu J., 2005) и гибели кардиомиоцитов (Saraste A., Pulkki К., 2008; Malhotra R., 1999; Bristow M.R., 1999).

Однако при изучении литературы мы не нашли указаний на повышение активности каспазы-3 в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации, что угрожает морфофункциональному состоянию синцитиотрофобласта. В отличие от описанных прототипов приводятся исследования, свидетельствующие, что при обострении герпес-вирусной инфекции в третьем триместре беременности (титр антител к вирусу герпеса - 1:12800) в гомогенате плаценты резко увеличивается активность каспазы-3.

Заявленный способ имеет следующие приемы.

а) Исследовались плаценты после родов у 20 беременных, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции и 20 беременных, не болевших в течение всего периода гестации (контроль). Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г., №266.

б) Для оценки содержания каспазы-3 в плаценте приготовляли гомогенат плаценты, взятой через 10-15 мин после родов. Плацента отмывалась физраствором (ФР). Кусочки плаценты помещались для просушивания на фильтровальную бумагу, взвешивались. Затем их растирали в ступке и к полученному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл ФР). Гомогенат замораживали при -20°C в течение суток. Затем его размораживали и центрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°C. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°C до проведения ИФА.

В размороженном супернатанте каспазу-3 определяли на ридере «Stat-Fax-2100» (USA) с помощью «Human Caspase-3 instant ELISA BMS20121NST. Bender MedSystems GmbH» (Austria). Титр антител к вирусу герпеса (1:1600; 1:6400; 1:12800) определяли на ридере «Stat-Fax-2100» (USA).

Полученные данные показали, что содержание каспазы-3 в гомогенате плаценты у беременных, перенесших герпес-вирусную инфекцию, резко нарастает по мере агрессивности инфекции. Содержание каспазы-3 в гомогенате плаценты при титре 1:1600 к вирусу герпеса увеличивается до 26,7±0,09 нг/мл; при титре 1:6400 - до 79,5±0,34 нг/мл, а при титре 1:12800 - до 103,7±0,8 нг/мл (контроль - 19,0±0,8 нг/мл).

Полученные данные позволяют считать, что обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности способствует накоплению в плаценте каспазы-3, что становиться причиной, приводящей к повреждению ДНК ядер синцитиотрофобласта.

Статистический анализ дискриминантной функции при титре антител 1:12800 (+54,10) больше граничного значения (+23,31) позволяет прогнозировать, что при дискриминантной функции меньше 54,10 нарастает угроза повреждения синцитиотрофобласта плаценты.

Литература

1. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wallach D. Involvement of MACH, a novel MORTI / FADD - interacting protease, in Fas/APO-1-and TNF receptor - induced cell death. // Cell. 1996. 85. 817-827.

2. Bristow M.R. Tumor necrosis factor and cardimyopathy. // Circulation. 1999. 97. 1340-1341.

3. Denault J., Salvesen G. Apoptotic caspase activation and activity. / Methods Mol. Biol. 2008. 414. 191-220.

4. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S. Mammalian caspases: structure, activation, substrates and function during apoptosis. // Annu. Rev. Biochem. 1999. 68. 383-424.

5. Feng Y., Hu J., Xie, Oin J. Subcellular localization of caspases-3 activation correlates with changes in apoptotic morphology in MOLT-4 leukemia cells exposed to X-ray. // Int. Oncol. 2005. 27(3). 699-704.

6. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis. // Nature. 2000. 407. 216.

7. Kaufmann S., Lee S., Meng X.W. Apoptosis - associated caspases activation assays. // Methods Mol. Biol. 2008. 44(3). 262-272.

8. Malhotra R. Glucose uptake and glycolisis reduce hypoxia - indced apoptosis in cultured neonatal rat cardiac myocytes. // J. Biol. Chem. 1999. 274. 12567-12575.

9. Saraste A., Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. // Cardiovas. Res. 2000. 45(3). 528-537.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам, и касается способа определения структурно-функционального состояния плаценты у беременных при обострении герпес-вирусной инфекции на плаценту. Способ заключается в определении каспазы-3 и титра антител к вирусу герпеса методом ИФА в плаценте. При титре антител к вирусу герпеса 1:12800 и содержании каспазы-3 103,7±0,8 нг/мл судят об увеличении риска повреждающего действия каспазы-3 на синцитиотрофобласт планценты. Способ обладает высокой чувствительностью и позволяет прогнозировать морфофункциональное повреждение синцитиотрофобласта плаценты в случае обострения во время беременности герпес-вирусной инфекции.

Способ определения структурно-функционального состояния плаценты у беременных при обострении герпес-вирусной инфекции на плаценту, включающий приготовление гомогената плаценты, определение методом ИФА содержания каспазы-3 и титра антител к вирусу герпеса, и при титре антител 1:12800 и содержании каспазы-3 103,7±0,8 нг/мл судят об увеличении риска повреждающего действия каспазы-3 на синцитиотрофобласт плаценты.