МАТРИЦА, КЛЕТОЧНЫЙ ИМПЛАНТАТ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК C08J9/26 A61L27/56 A61L27/58 A61L27/14 A61L27/38 

Настоящее изобретение относится к пористым матрицам, основой которых являются биологически приемлемые полимер либо полимерная смесь, к клеточным имплантатам, которые формируют на последних, к другим клеточным имплантатам, основой которых являются клеточные смеси, образованные из гепатоцитов и клеток островков Лангерганса, к способу получения пористых матриц и к матрицам, которые можно получить при использовании данного способа, и к специальному способу получения клеток для посева на имплантируемой матрице.

Тканевая инженерия представляет собой междисциплинарную область, которая сочетает инженерию и материаловедение с медициной. Цель заключается в восстановлении поврежденной ткани либо в улучшении ее функции.

Принцип тканевой инженерии является чрезвычайно простым: прежде всего у пациента удаляют некоторые клетки и размножают их в искусственных условиях вне организма. После этого размноженные клетки можно внедрить в каркасное вещество с получением в результате полного заменителя живой ткани, который снова трансплантируют пациенту. В противоположность обычно используемому аллогенному трансплантированию, которое в качестве предварительного условия предполагает наличие подходящего донора и, как правило, требует проведения пожизненной лекарственной иммуносупрессии, данный способ позволяет добиться кардинального преимущества, заключающегося в возможности использования эндогенных (аутологичных) клеток.

Природа и структура используемого каркасного вещества, которое также называют матрицей в тексте, который последует далее, имеют особенное значение для приживающихся и способных функционировать имплантатов. Помимо используемого материала, который, как правило, именно и является биологически разлагающимися полимерами, для последующего развития клеток, которые внедряют в каркасное вещество, и, в конечном счете, для формирования трехмерной структуры восстанавливаемых ткани либо органа, критическую роль играют размер пор, пористость и поверхность, точно так же, как форма пор, морфология стенки пор и степень наличия соединений между порами.

Способы получения биоматриц данной природы уже были описаны. Таким образом, для получения тканых и нетканых волокнистых биоматриц уже использовали методики из области текстиля. Еще один общий способ, в котором кристаллы соли, прежде всего, подвергают обработке в биологически разлагающемся полимере, а после этого растворяют еще раз, делает возможными управление размером пор при помощи размера частиц соли и управление пористостью при помощи соотношения количеств соль/полимер (WO 98/44027). В одной модификации данного способа биологически разлагающиеся полимеры, которые растворяют в растворителе, наносят на то, что называют порогенным материалом, который после этого снова растворяют, удаляя из композитного материала, с получением в результате пор, имеющих форму, полученную по принципу негативного изображения упомянутого порогенного материала (WO 01/87575 A2). Также уже были описаны и матрицы с нанесенным покрытием (смотрите, например, работу WO 99/09149 A1).

Тем не менее, биоматрицы, которые к настоящему времени были произведены с использованием данного способа, в любом случае не являются удовлетворительными, в частности, в отношении приживления и функциональной способности имплантатов, которые формируются на данных матрицах. В частности, никаких приживающихся заменителей органов до сих пор не было получено при использовании имплантатов печени и поджелудочной железы.

Изобретение достигает цели, лежащей в основе настоящего изобретения, а именно, предоставления функционального имплантата, путем использования конкретных биоматриц и соответствующих имплантатов, которые можно получать при использовании специального способа.

Поэтому настоящее изобретение относится к объекту, который определен в формуле изобретения патента.

Степень пористости представляет собой численную величину в % доли общего объема матрицы, которая соответствует объему пор.

Слово «поры» используют для обозначения полостей, которые присутствуют в матрице, соответствующей изобретению, и которые в настоящем случае имеют угловатую, в частности восьмиугольную, форму в двумерном сечении и/или скошенную форму, если рассматривать их в трехмерном пространстве. Кроме того, форма предпочтительно характеризуется наличием протяженностей, таких, что форму полостей можно сопоставлять с формой нервных клеток. Размер поры можно указать с использованием диаметра, который представляет собой среднюю величину для наибольшего и наименьшего диаметров пор, которые можно выявить в двумерном сечении.

Матрица, соответствующая изобретению, обладает порами, характеризующимися различными размерами, при этом размеры распределены (распределение пор по размерам) в пределах конкретного диапазона. В соответствии с изобретением важно, чтобы матрица характеризовалась бы широким распределением пор по размерам. Данное распределение должно простираться от пор, характеризующихся размером в диапазоне, приблизительно соответствующем 150 мкм, до пор, характеризующихся размером в диапазоне, приблизительно соответствующем 300 мкм, либо быть более широким, чем данное. В соответствии с этим, матрица, соответствующая изобретению, в соответствии с одним аспектом должна обладать порами, характеризующимися размером, соответствующим 150 мкм либо менее. Предпочтительными являются матрицы, которые обладают порами, характеризующимися размером, равным 140 мкм либо менее. В особенности выгодными являются матрицы, которые обладают порами, характеризующимися размером, равным 130 мкм либо менее. В соответствии с еще одним аспектом матрица, соответствующая изобретению, должна обладать порами, характеризующимися размером, равным 300 мкм либо более. Предпочтительными являются матрицы, которые обладают порами, характеризующимися размером, равным 350 мкм либо более. В особенности выгодными являются матрицы, которые обладают порами, характеризующимися размером, равным 370 мкм либо более. Изобретение включает матрицы, которые обладают как порами, характеризующимися размером, равным 150, 140 либо 130 мкм или же меньшим, так и порами, характеризующимися размером, равным 300, 350 либо 370 мкм или же большим. Данные значения можно скомбинировать любым произвольным образом с получением минимальных диапазонов, в границах которых должно простираться распределение пор по размерам, при этом диапазонами, заслуживающими упоминания, в частности, являются диапазоны от 150 до 300, от 140 до 350 и от 130 до 370 мкм. Особенное предпочтение отдается данному распределению пор по размерам, обладающему частотными максимумами, расположенными вне пределов диапазона от 150 до 300 мкм, то есть, частотным максимумом, превышающим размер пор, равный 300 мкм, и еще одним частотным максимумом, уступающим по величине размеру пор, равному 150 мкм.

Обычная матрица, соответствующая изобретению, обладает нижеследующим распределением пор по размерам. Приблизительно от 0,5% до 6%, предпочтительно приблизительно от 1% до 5%, еще более предпочтительно приблизительно от 2% до 4% и, в частности, приблизительно 3% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; приблизительно от 2% до 8%, предпочтительно приблизительно от 3% до 7%, еще более предпочтительно приблизительно от 4% до 6% и, в частности, приблизительно 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; приблизительно от 2% до 8%, предпочтительно приблизительно от 3% до 7%, еще более предпочтительно приблизительно от 4% до 6% и, в частности, приблизительно 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; приблизительно от 1% до 7%, предпочтительно приблизительно от 2% до 6%, еще более предпочтительно приблизительно от 3% до 5% и, в частности, приблизительно 4% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; приблизительно от 11% до 23%, предпочтительно приблизительно от 13% до 21%, еще более предпочтительно приблизительно от 15% до 19% и, в частности, приблизительно 17% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; приблизительно от 4% до 10%, предпочтительно приблизительно от 5% до 9%, еще более предпочтительно приблизительно от 6% до 8% и, в частности, приблизительно 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; приблизительно от 5% до 17%, предпочтительно приблизительно от 7% до 15%, еще более предпочтительно приблизительно от 9% до 13% и, в частности, приблизительно 11% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; приблизительно от 7% до 19%, предпочтительно приблизительно от 9% до 17%, еще более предпочтительно приблизительно от 11% до 15% и, в частности, приблизительно 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; приблизительно от 3% до 9%, предпочтительно приблизительно от 4% до 8%, еще более предпочтительно приблизительно от 5% до 7% и, в частности, приблизительно 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; приблизительно от 12% до 24%, предпочтительно приблизительно от 14% до 22%, еще более предпочтительно приблизительно от 16% до 20% и, в частности, приблизительно 18% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и приблизительно от 5% до 17%, предпочтительно приблизительно от 7% до 15%, еще более предпочтительно приблизительно от 9% до 13% и, в частности, приблизительно 11% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм. Поэтому, как правило, получают распределение пор по размерам, характеризующееся более чем одним максимумом, причем это соответствует группированию пор в более чем одном диапазоне размеров. Это имеет особое значение для свойств матриц, соответствующих изобретению.

Объем полостей и, таким образом, степень пористости необходимо определять методом порометрии известным способом.

Размеры пор и, таким образом, также и распределение пор по размерам, можно определить, например, с использованием сканирующей электронной микроскопии. Для этого получали тонкие срезы исследуемой матрицы и на них наносили покрытие из золота. Оценку фотографий, полученных методом сканирующей электронной микроскопии, получали, проводя измерение всех пор в определенной области, то есть, определение наибольшего и наименьшего диаметров для каждой поры, определение суммы двух значений и деление суммы на 2.

Термин «матрица» обозначает трехмерный носитель, который является подходящим для формирования колоний клеток. В этом смысле матрицу используют в качестве трехмерного темплата, который может быть колонизован клетками либо тканью. Данное формирование колонии может протекать в искусственных условиях вне организма либо в естественных условиях в организме. Кроме того, в связи с трансплантациями, матрицу используют для локализации трансплантата, а также в качестве метки допустимых границ для ткани, которая постепенно будет образовываться в естественных условиях в организме.

Полимером, в принципе, может быть любой полимер, который можно использовать в сфере медицины и, в частности, в трансплантационной медицине. В соответствии с этим, полимеры, которые организм «хозяина» будет распознавать как чужеродные, но отторжение которых можно будет подавить при использовании подходящей иммуносупрессии, также являются биологически совместимыми. Существует возможность использования и полимеров, которые по существу не являются биологически разлагающимися. Однако предпочтение отдается полимерам, которые, по меньшей мере, преимущественно являются биологически разлагающимися.

Выражение «биологически разлагающийся» обозначает материал, который живые организмы (либо жидкости организма, либо клеточные культуры, которые могут образоваться из живых организмов) способны преобразовывать в продукты, трансформируемые в ходе обмена веществ. Биологически разлагающиеся полимеры включают, например, полимеры, которые являются биорассасывающимися и/или биоразмывающимися. «Биоразмывающиеся» обозначает способность к растворению либо суспендированию в биологических жидкостях. «Биорассасывающийся» обозначает способность к всасыванию клетками, тканями либо жидкостями живого организма.

В принципе, биологически разлагающиеся полимеры, которые являются подходящими в соответствии с изобретением, включают любые полимеры, которые можно использовать в сфере медицины, при этом, в дополнение к полимерам, которые уже адаптированы к сфере тканевой инженерии, также включаются и полимеры, которые стали адаптированы к средствам высвобождения активных веществ, таким как пластыри и имплантаты активных веществ.

Подходящие природные полимеры включают, например, полипептиды, такие как альбумин, фибриноген, коллаген и желатин, а также полисахариды, такие как хитин, хитозан, альгинат и агароза. Данные природные полимеры также могут быть модифицированными, тогда, когда это будет уместно; например, белки, такие как коллаген, могут быть сшитыми.

Подходящие синтетические полимеры включают, например, конкретные полиангидриды, в частности сополимер себациновая кислота/гексадекановая двухосновная кислота, поли(ε-капролактон), сложные поли(ортоэфиры) и, в особенности, сложные поли(α-гидроксиэфиры), такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота и сополимер гликолевая кислота/молочная кислота. Таким образом, основой матриц и имплантатов, соответствующих изобретению, предпочтительно являются биологически разлагающиеся полимеры, которые содержат повторяющиеся элементарные звенья, описываемые формулой (I):

в которой R¹ представляет собой водород либо метил. Что касается элементарных звеньев молочной кислоты, то предпочтительной является L-форма (S-энантиомер). В особенности предпочтительным для упоминания полимером является сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, характеризующийся соотношением звеньев гликолевой кислоты и молочной кислоты в диапазоне от 99:1 до 1:99, предпочтительно от 10:90 до 90:10, например, равным 15:85% моль.

Равным же образом подходящими могут оказаться и смеси, образованные из двух либо более чем двух, полимеров.

В дополнение к природе полимера свойства получающейся в результате матрицы может определять и молекулярная масса последнего. В общем случае имеет место ситуация, когда по мере того, как молекулярная масса используемого полимера будет увеличиваться, пористость матрицы будет уменьшаться. Это имеет место, в частности, тогда, когда при получении матрицы материал подвергают вспениванию, то есть, его добавляют под давлением совместно с газом, таким как СО₂, который первоначально растворяется в полимере и образует поры тогда, когда давление будет уменьшено.

В дополнение к этому на свойства получающейся в результате матрицы оказывает влияние степень кристалличности используемого полимера. В данном случае имеет место ситуация, когда пористость получающейся в результате матрицы в общем случае будет увеличиваться по мере того, как будет уменьшаться степень кристалличности, по причине чего предпочтительным является аморфный полимер, в частности, в случае матриц, которые характеризуются высокой пористостью. Данный аспект также имеет особенное значение тогда, когда во время получения матрицы материал подвергают вспениванию.

Кроме того, настоящее изобретение относится к пористым матрицам, основой которых является биологически разлагающийся полимер, и которые характеризуются тем, что на поверхность матрицы наносят покрытие по меньшей мере, из одного белка внеклеточного матрикса.

Белки внеклеточного матрикса хорошо известны. Те, которые в соответствии с изобретением являются предпочтительными, представляют собой коллагены, в частности, коллагены типа I и IV, ламинин и фибронектин. Данные белки можно получать в очищенной форме по известному способу или же получать коммерчески. В соответствии с одним вариантом реализации покрытия матриц, соответствующих изобретению, в качестве белка межклеточного матрикса содержат фибронектин. В соответствии с еще одним вариантом реализации покрытия матриц, соответствующих изобретению, в качестве белка межклеточного матрикса содержат смесь коллагена типа I, ламинина и коллагена типа IV, при этом в данном случае предпочтение отдается смеси, содержащей белки с приблизительно равными содержаниями, выраженными в массовых процентах.

В соответствии с изобретением особенное предпочтение отдается матрицам, на которые наносят покрытие по описанному выше способу, и которые отвечают, по меньшей мере, одному из нижеследующих дополнительных критериев:

- поры матриц демонстрируют указанные выше размеры пор либо распределение пор по размерам;

- степень пористости находится в диапазоне от 93 до 98%;

- поры характеризуются указанной выше формой;

- биологически разлагающийся полимер представляет собой один из указанных выше природных, либо синтетических полимеров, в частности, сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, характеризующийся содержанием звеньев молочной кислоты, приблизительно равным 85% моль, и содержанием звеньев гликолевой кислоты, приблизительно равным 15% моль.

Матрицы, на которые наносят покрытия таким способом, можно получать, например, в результате погружения матрицы, не имеющей покрытия, в раствор, который содержит белок либо смесь белков, которые предполагаются для нанесения покрытия, а после этого высушивания матрицы, которая была смочена раствором. В данной связи, как правило, имеет место ситуация, когда в зависимости от размеров тела матрицы, на которое наносят покрытие, раствор, в частности, смачивает наружные области тела матрицы, в то время как сравнительно небольшое количество раствора проникает во внутренние области тела матрицы. Это может в результате привести к тому, что вся толща поверхностного слоя матрицы не будет иметь однородного покрытия, а вместо этого плотность нанесенного покрытия будет уменьшаться в направлении от наружных областей к внутренним.

В качестве альтернативы нанесенному покрытию либо в дополнение к нему можно добиться впитывания полимером биологически активных веществ либо даже связывания последних с первым. Данные вещества включают, например, синтетические активные вещества (неорганические либо органические молекулы), белки, полисахариды и другие сахара, липиды и нуклеиновые кислоты, которые, например, оказывают влияние на рост клеток, миграцию клеток, деление клеток, дифференциацию клеток и/или рост ткани или же обладают терапевтическим, профилактическим либо диагностическим действием. Те из них, которые можно упомянуть в качестве примера, представляют собой вазоактивные активные вещества, нейроактивные активные вещества, гормоны, факторы роста, цитокины, стероиды, антикоагулянты, активные вещества противовоспалительного действия, активные вещества иммуномодулирующего действия, цитотоксические активные вещества, антибиотики и антивирусные активные вещества.

Настоящее изобретение также относится к способу получения пористой матрицы, основой которой являются биологически совместимый полимер либо полимерная смесь, и который характеризуется тем, что смесь, состоящую из частиц полимера и частиц хлорида натрия, характеризующихся определенным размером частиц, уплотняют, а после этого хлорид натрия удаляют в результате растворения.

Частицы полимера, характеризующиеся размером частиц в диапазоне от приблизительно 20 до 950 мкм, в выгодном случае в диапазоне от приблизительно 20 до 760 мкм и, в частности, в диапазоне от приблизительно 108 до 250 мкм, и частицы хлорида натрия, характеризующиеся размером частиц в диапазоне от приблизительно 90 до 670 мкм, в выгодном случае в диапазоне от приблизительно 110 до 520 мкм и, в частности, в диапазоне от приблизительно 250 до 425 мкм, как было доказано, являются подходящими для формирования желательных размеров пор либо распределения пор по размерам. Кроме того, для формирования желательной пористости, как было доказано, подходящим является массовое соотношение между количествами частиц полимера и частиц хлорида натрия в диапазоне от 1:100 до 1:10, в выгодном случае в диапазоне от 1:50 до 1:15 и, в частности, в диапазоне от приблизительно 1:20 до 1:18.

Кроме того, как было доказано, подходящим является использование соли и полимера, характеризующихся специфическим распределением частиц по размерам. Что касается хлорида натрия, который используют для получения матрицы, то выгодным является, чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 250 мкм до 320 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 15% до 50%, в выгодном случае от приблизительно 18% до 42%, а предпочтительно от приблизительно 22% до 28%; чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 330 мкм до 380 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 20% до 65%, в выгодном случае от приблизительно 30% до 52%, а предпочтительно от приблизительно 42% до 46%; и чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 390 мкм до 425 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 15% до 62%, в выгодном случае от приблизительно 25% до 42%, а предпочтительно от приблизительно 29% до 33%, при этом величины, выраженные в процентах, относятся к совокупной массе соли, использованной для получения. Таким образом, это не исключает фракции, характеризующиеся размерами частиц, превышающими указанные диапазоны и/или уступающими им по величине.

В соответствии со специальным вариантом реализации, как было доказано, выгодным является, чтобы содержание частиц хлорида натрия, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 108 мкм до 140 мкм, было бы заключено в пределах от 1% до 15% масс., предпочтительно от 4% до 12% масс. и, в частности, от 7% до 9% масс., чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 145 мкм до 180 мкм, было бы заключено в пределах от 1% до 11% масс., предпочтительно от 3% до 9% масс. и, в частности, от 5% до 7% масс., чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 185 мкм до 220 мкм, было бы заключено в пределах от 3% до 21% масс., предпочтительно от 7% до 17% масс. и, в частности, от 10% до 14% масс., чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 225 мкм до 250 мкм, было бы заключено в пределах от 1% до 11% масс., предпочтительно от 3% до 9% масс. и, в частности, от 5% до 7% масс., чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 250 мкм до 320 мкм, было бы заключено в пределах от 15% до 50% масс., предпочтительно от 18% до 42% масс. и, в частности, от 22% до 28% масс., чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 330 мкм до 380 мкм, было бы заключено в пределах от 15% до 50% масс., предпочтительно от 18% до 42% масс. и, в частности, от 22% до 28% масс., и чтобы содержание соли, характеризующейся размером частиц в диапазоне от 390 мкм до 425 мкм, было бы заключено в пределах от 5% до 29% масс., предпочтительно от 10% до 24% масс. и, в частности, от 15% до 19% масс..

Что касается полимера, который используют для получения матрицы, то выгодным является то, чтобы содержание полимера, характеризующегося размером частиц в диапазоне от 108 мкм до 140 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 5% до 50%, в выгодном случае от приблизительно 10% до 30% и предпочтительно от приблизительно 14% до 18%; чтобы содержание полимера, характеризующегося размером частиц в диапазоне от 145 мкм до 180 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 10% до 55%, в выгодном случае от приблизительно 15% до 40% и предпочтительно от приблизительно 20% до 24%; чтобы содержание полимера, характеризующегося размером частиц в диапазоне от 185 мкм до 220 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 18% до 88%, в выгодном случае от приблизительно 32% до 76% и предпочтительно от приблизительно 43% до 49%, и чтобы содержание полимера, характеризующегося размером частиц в диапазоне от 225 мкм до 250 мкм, было бы заключено в пределах от приблизительно 5% до 45%, в выгодном случае от приблизительно 10% до 28% и предпочтительно от приблизительно 14% до 18%, при этом величины, выраженные в процентах, относятся к общей массе полимера, используемого для получения.

Для того чтобы получить частицы соли и/или полимера, характеризующиеся желательным распределением частиц по размерам, как правило, подходящим является, прежде всего, измельчение коммерчески доступного продукта. Это можно реализовать в устройствах, которые являются обычными для достижения данной цели, например, в системах с ударным воздействием либо размалывающих установках. Однако тем, что определяет желательное распределение частиц по размерам, является последующее просеивание при использовании обычных аналитических сит.

Уплотнение предпочтительно осуществляют под действием давления. Для этого смесь полимер/хлорид натрия можно спрессовать в обычно используемом гидравлическом прессе при давлении поршня в диапазоне от приблизительно 780 фунт/дюйм² до 1450 фунт/дюйм², в выгодном случае в диапазоне от приблизительно 840 фунт/дюйм² до приблизительно 1230 фунт/дюйм² и, в частности, в диапазоне от приблизительно 900 фунт/дюйм² до 1100 фунт/дюйм². Как было доказано, подходящим является реализация действия давления в течение промежутка времени продолжительностью от приблизительно 10 сек до 360 сек, в выгодном случае от приблизительно 40 сек до 180 сек и, в частности, от приблизительно 50 сек до 70 сек, при температуре в диапазоне от 18°С до 25°С.

Хлорид натрия удаляют из материала в результате растворения, например, пользуясь водой либо водными растворами. Во-первых, уплотненную смесь (заготовку для матрицы) можно подвергать пропитыванию в течение промежутка времени продолжительностью от приблизительно 1 часа до 80 часов, в выгодном случае от приблизительно 12 часов до 62 часов и, в частности, от приблизительно 36 часов до 60 часов.

Кроме того, выгодным является то, чтобы уплотненную смесь первоначально хранили бы в атмосфере СО₂ перед тем, как в результате растворения произвести удаление хлорида натрия. Таким образом, например, уплотненную смесь можно насыщать газом при давлении СО₂ в диапазоне от приблизительно 140 фунт/дюйм² до 1650 фунт/дюйм², в выгодном случае в диапазоне от приблизительно 360 фунт/дюйм² до приблизительно 1120 фунт/дюйм² и, в частности, в диапазоне от приблизительно 800 фунт/дюйм² до 900 фунт/дюйм², причем, как было доказано, подходящими в данной связи являются времена продолжительностью в диапазоне от приблизительно 1 часа до 180 часов, в выгодном случае в диапазоне от приблизительно 3 часов до 60 часов и, в частности, в диапазоне от приблизительно 12 часов до 36 часов. После этого давление уменьшают с такой скоростью, при которой уменьшение давления будет оказывать влияние на порообразование. Несмотря на то, что предпочтительным является использование СО₂, равным же образом подходящими могут оказаться и другие газы, такие как воздух, азот, гелий, неон, криптон, аргон, ксенон либо кислород. После этого с целью высушивания воду либо водный раствор удаляют известным способом. Для того, чтобы этого добиться, матрицу, например, можно выложить на фильтровальную бумагу.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации раствор полимера добавляют к смеси, образованной из частиц полимера и частиц хлорида натрия, и растворитель удаляют перед тем, как осуществить уплотнение. В данной связи основой для частиц полимера и раствора полимера может оказаться один и тот же полимер. Однако полимерами также могут являться и различающиеся полимеры, в частности, полимеры, характеризующиеся различающейся биологической разлагаемостью. Применение раствора полимера характеризуется преимуществом, заключающимся в том, что в результате в матрице формируются несущие опоры, причем это делает возможным улучшение механических свойств матрицы. В частности, матрица данной природы демонстрирует меньшую тенденцию к раскрашиванию.

Растворитель, который используют, должен растворять полимер, но не соль. Это обеспечивает то, что на порогенные свойства соли негативного влияния не оказывается либо негативное давление оказывается только в незначительной степени. Подходящими для растворения упомянутых выше полимеров являются, например, ацетон, этилацетат, метиленхлорид, хлороформ, гексафторизопропанол, хлорированные и фторированные, алифатические и ароматические углеводороды, тетрагидрофуран, этилметиловый кетон, диэтиловый кетон и их смеси. Хлороформ, в частности, является подходящим для растворения полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты либо сополимера гликолевая кислота/молочная кислота, а также подходящим с точки зрения использования в медицине.

Перемешивание раствора полимера и смеси частицы полимера/частицы соли первоначально в результате приводит к получению перемешиваемой пасты, которая после этого быстро становится твердой по мере того, как будет удаляться растворитель. Концентрацию полимера в растворе в подходящем случае выбирают такой, чтобы, с одной стороны, полимер полностью бы растворялся, а, с другой стороны, растворитель можно было бы быстро удалить, а частицы полимера не начали бы растворяться в какой-либо значительной степени.

Как было доказано, полезным является массовое соотношение между частицами полимера и растворенным полимером в диапазоне от 10:1 до 1:100, в выгодном случае от 2:1 до 1:25 и, в частности, от 1:1 до 1:10.

Что касается массового соотношения между частицами полимера и частицами хлорида натрия, то в контексте данного варианта реализации возможен выбор массового соотношения, которое при расчете на количество хлорида натрия превышает величину, доходящую вплоть до 1:200, 1:500 либо 1:1000, при этом массовое соотношение между количествами совокупного полимера и хлорида натрия все еще превышает 1:100. Таким образом, возможно получение пористостей, превышающих 98%.

В упомянутом выше способе хлорид натрия играет роль порогенного материала, который по определению понимается как твердый либо, по меньшей мере, полутвердый материал, который первоначально объединяют с полимером, образующим матрицу, с получением смеси, и который после этого удаляют из смеси, что в результате приводит к образованию полостей (пор). Для этого в подходящем случае порогенный материал будет растворимым, по меньшей мере, в одном растворителе и по существу нерастворимым, по меньшей мере, в одном дополнительном растворителе. Материал является по существу нерастворимым тогда, когда, в частности, он является растворимым при условиях переработки, то есть, как правило, при температурах в диапазоне от 18°С до 25°С и при атмосферном давлении, менее, чем на 30% масс., предпочтительно менее, чем на 20% масс., в особенности, менее, чем на 10% масс., например, менее, чем на 5, 4, 3, 2 и 1% масс.

Структуру и свойства получающихся в результате матриц по существу определяет порогенный материал, который используют для их получения. В данной связи существенной является не только природа порогенного материала, но также, в особенности, и распределение частиц порогенных частиц по размерам. Таким образом, в общем случае имеет место ситуация, когда по мере того, как увеличивается размер частиц, увеличиваются не только размер пор, но также и степень наличия соединений, то есть сеть полостей, которые сообщаются друг с другом. Данную сеть, которую также называют макроструктурой либо макропористой структурой, необходимо отличать от пор, которые можно получать в результате проведения вспенивания и которые, как правило, являются замкнутыми и поэтому формируют структуру, которую называют микроструктурой либо микропористой структурой.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу получения пористой матрицы на основе биологически совместимого полимера либо полимерной смеси характеризующемуся тем, что смесь, образованную из частиц полимера, частиц порогенного материала и раствора полимера, подвергают уплотнению, а порогенный материал после этого удаляют в результате растворения.

На данный способ, в принципе, не накладывают ограничений в виде ранее описанных признаков. Таким образом, полимер можно выбирать из полиангидридов, сложных полиортоэфиров, сложных поли(α-гидроксиэфиров), полиэфирамидов на основе сложных эфиров, полиамидов, полиэфироэфиров на основе сложных и простых эфиров, поликарбонатов, полиалкиленов, полиалкиленгликолей, полиалкиленоксидов, полиалкилентерефталатов, поливиниловых спиртов, простых поливиниловых эфиров, сложных поливиниловых эфиров, поливинилгалогенидов, поливинилпирролидонов, полисилоксанов, полистиролов, полиуретанов, марок дериватизированной целлюлозы и полимеров и сополимеров (мет)акриловой кислоты. Несмотря на то, что порогенный материал предпочтительно выбирают из растворимых в воде солей, например, хлорида натрия, хлорида калия, фторида натрия, фторида калия, иодида натрия, иодида калия, нитрата натрия, сульфата натрия, цитрата натрия, тартрата натрия, сахаров (например, сахарозы, фруктозы и глюкозы) и их смесей, материал также можно выбирать и из воскообразных веществ, таких как парафины, пчелиный воск и тому подобное. В принципе, полимер, порогенный материал и растворитель, используемые для получения раствора, должны быть согласованы друг с другом таким образом, чтобы раствор содержал бы полимер в растворенной форме и частицы полимера в твердой форме, а порогенный материал по существу оставался бы нерастворенным.

Матрицы, которые можно получать при использовании упомянутых выше способов, равным же образом являются частью сущности объекта настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к имплантатам, которые содержат, по меньшей мере, одну из описанных ранее матриц и, по меньшей мере, одну клетку. В данной связи в соответствии с назначением имплантата клетки можно выбирать, в частности, из клеток печени, клеток поджелудочной железы, жировых клеток, клеток кишечника, клеток кожи, клеток кровеносных сосудов, нервных клеток, мышечных клеток, клеток щитовидной железы и клеток корня зуба. Специальные варианты реализации имплантатов, соответствующих изобретению, относятся к клеткам печени и клеткам поджелудочной железы.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к имплантатам, которые содержат, по меньшей мере, одну матрицу на основе биологически совместимого полимера и клетки в виде, по меньшей мере, двух типов клеток, при этом клетки первого типа клеток представляют собой гепатоциты, а клетки второго типа клеток представляют собой клетки островков Лангерганса. На сущность данного объекта не накладывают ограничений в виде описанных выше матриц, то есть в виде имплантатов на основе матриц, соответствующих изобретению.

В соответствии с назначением имплантата, то есть, в частности, с исполняемой функцией, выгодными являются конкретные соотношения между количествами гепатоцитов и клеток островков Лангерганса. Таким образом, один вариант реализации изобретения относится к имплантатам, которые после имплантирования демонстрируют эндокринные свойства эквивалента поджелудочной железы. Как было доказано, выгодным для данной цели является соотношение между гепатоцитами и клетками островков Лангерганса, приблизительно равное 10⁶:3000. Еще один вариант реализации изобретения относится к имплантатам, которые после имплантирования реализуют метаболические функции печени. Как было доказано, подходящими для данной цели является соотношение между гепатоцитами и клетками островков Лангерганса, равное приблизительно 10⁶:3-200, в выгодном случае 10⁶:10-100, в частности, 10⁶:20-80 и в особенности предпочтительно приблизительно 10⁶:35-45.

Можно заметить, что такие имплантаты в дополнение к гепатоцитам и клеткам островков Лангерганса, как правило, содержат другие клетки, а именно и в частности, другие клетки печени и клетки поджелудочной железы, накопление которых является сопутствующим фактором в связи с выделением клеток.

Клетки либо клеточные смеси, которые должны использоваться для формирования колонии на матрицах, соответствующих изобретению, можно получать по способу, самому по себе известному. Для цели получения аутологичного имплантата клетки предпочтительно получают от индивидуума, которому необходимо будет ввести имплантат. Таким образом, у индивидуума, как правило, удаляют подходящую ткань, например, часть печени либо поджелудочной железы, и подходящим образом ее препарируют для посева и культивирования на матрице в искусственных условиях вне организма. В данной связи существенно, чтобы клетки демонстрировали бы жизнеспособность, которая была бы по возможности более высокой.

Если клетки печени будут получать из ткани печени, то тогда необходимо будет обратить внимание на то, что клетки печени окружены толстым слоем соединительной ткани, в особенности, в случае цирроза печени. В соответствии с изобретением для того, чтобы иметь возможность выделять клетки печени, включающие долю жизнеспособных клеток, которая по возможности будет более высокой, используют растворы с определенным составом.

Поэтому настоящее изобретение относится к водной композиции А, которая содержит NaCl, KCl и HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновую кислоту) и характеризуется величиной рН, приблизительно равной 7,4, и к ее применению для перфузии части печени либо поджелудочной железы. В частности, 1000 мл данного раствора содержит приблизительно 8,3 г NaCl, 0,5 г KCl и 2,38 г HEPES. Перфузию предпочтительно проводят при температуре, приблизительно равной 37°С, и скорости течения, приблизительно равной 30 мл/мин. Для перфузии части ткани надлежащим образом при упомянутой выше скорости течения достаточными являются несколько минут, в частности, в диапазоне от приблизительно 5 до 120 минут, например, приблизительно 7 минут.

В альтернативном варианте также существует возможность применения для перфузии части печени либо поджелудочной железы водной композиции А', которая содержит этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA).

Кроме того, настоящее изобретение относится к водной композиции В, которая характеризуется величиной рН в диапазоне от приблизительно 7,3 до 7,4, предпочтительно приблизительно равной 7,35, и которая содержит NaCl, KCl, HEPES, CaCl₂, коллагеназу и ингибитор трипсина, а также к ее применению для перфузии части печени либо поджелудочной железы. 1000 мл раствора предпочтительно содержат 8,3 г NaCl, 0,5 г KCl, 2,38 г HEPES, 0,7 г CaCl₂ x 2H₂O, 500 мг коллагеназы Н и 7,5 мг ингибитора трипсина. В данном случае, как было доказано, подходящей также является перфузия приблизительно при 37°С и при скорости течения, приблизительно равной 30 мл/мин. Для перфузии части ткани надлежащим образом достаточными являются несколько минут, в частности, в диапазоне от приблизительно 5 до 10 минут, например, приблизительно от 6 до 7 минут.

В альтернативном варианте также возможно применение для перфузии части печени либо поджелудочной железы водной композиции В', которая содержит коллагеназу и гиалуронидазу. 1000 мл раствора предпочтительно содержат от 5 до 10 единиц коллагеназы/мл и от 5 до 10 единиц гиалуронидазы/мл.

Для обеспечения жизнеспособности клеток важно, чтобы их выделяли при первоначальной обработке части ткани, пользуясь композицией А, и последующей обработке, пользуясь композицией В. В альтернативном варианте существует возможность применения сначала композиции А', а после этого применения композиции В'.

Вслед за перфузией часть ткани затем можно иссекать и осторожно встряхивать в подходящей среде, например, среде Уильямса Е. Если получающаяся в результате суспензия клеток все еще будет содержать относительно крупный клеточный дебрис, последний можно удалить по известному способу, например, в результате фильтрования суспензии клеток через нейлоновую сетку (200 мкм). После этого клетки фильтрата можно осторожно осаждать центрифугированием, в связи с которым, как было доказано, выгодным является трехминутное центрифугирование при 50g и 4°С.

Клетками, которые выделяют, заполняют матрицы по известному способу. Как правило, клетками заполняют матрицу, пользуясь содержащим клетки раствором, и клетки и матрицу после этого подвергают инкубированию, обычно в условиях культивирования клеток, до тех пор, пока клетки не прилипнут к матрице. Если матрицу будут заполнять клетками более одного типа, например, гепатоцитами и клетками островков Лангерганса, то заполнение клетками различных типов, в принципе, можно проводить совместно либо последовательно. В соответствии со специальным вариантом реализации заполнение клетками островков Лангерганса проводят сначала, после чего проводят заполнение гепатоцитами, при этом инкубирование в каждом случае осуществляют после заполнения до тех пор, пока, по меньшей мере, часть клеток не прилипнет к матрице.

Матрицы и имплантаты, соответствующие изобретению, демонстрируют наличие кардинальных преимуществ. Таким образом, внутренние размеры делают возможным эффективное формирование колоний клеток на матрице. Матрицы, с одной стороны, являются свободно формуемыми, а, с другой стороны, обеспечивают наличие надлежащих устойчивости и жесткости, необходимых для выдерживания воздействия методики хирургического имплантирования и противодействия механическим усилиям, действующим на место имплантирования. Первоначальная деструкция клеток, которая наступает после имплантирования, является ограниченной, и по истечении короткого промежутка времени имплантированная ткань может начать исполнять предназначенную для нее функцию. Вскоре после имплантирования кровеносные сосуды либо обогащенная кровеносными сосудами грануляционная ткань, а также и нервная ткань начинают разрастаться, проникая в имплантат. Матрицы, соответствующие изобретению, можно получать без необходимости использования физиологически вредных растворителей, например, формальдегида, результатом чего является то, что для удаления растворителей не потребуется никакого специального способа, и не существует никакой опасности от наличия остаточных количеств данных растворителей, остающихся в материале.

Матрицы и имплантаты, соответствующие изобретению, находят себе много различных вариантов возможного использования. Те, которые можно упомянуть, в частности, представляют собой варианты использования в сфере медицины. Поэтому настоящее изобретение также относится к соответствующим изобретению матрицам и имплантатам, предназначенным для терапевтического использования.

Специальное использование в данной области представляет собой использование для синтеза ткани (тканевой инженерии). В данном случае матрицы, соответствующие изобретению, в большей либо меньшей степени используют в качестве строительной объемной решетки, в которые клетки мигрируют и/или к которым клетки прилипают.

Для этого посев на матрицах, например, можно проводить при использовании желательных клеток в искусственных условиях вне организма, то есть, матрицы можно подвергать обработке, пользуясь раствором, содержащим клетки, и инкубированию до тех пор, пока клетки не прилипнут к матрице. Такую матрицу совместно с клетками, прилипающими к ней (называемую в настоящем документе имплантатом), после этого можно подвергать воздействию дополнительных стадий методики, например, дополнительному культивированию, тогда, когда это будет уместно, под влиянием активных веществ, например, для цели дополнительного размножения клеток либо модифицирования их свойств, и/или хранить вплоть до имплантирования подходящим образом, например, на льду либо в проточном биореакторе в стандартных условиях. В контексте данного варианта использования выгодно иметь возможность первоначального выделения, а тогда, когда это будет уместно, также и размножения в искусственных условиях вне организма клеток, которые предполагаются для имплантирования. В частности, таким образом, это делает возможным нанесение на матрицу различных типов клеток, таких как описанные выше гепатоциты совместно с клетками островков Лангерганса.

Другая возможность, вместо посева в искусственных условиях вне организма, заключается в имплантировании матрицы (без каких-либо предварительно прилипших клеток) с целью стимулирования клеток-предшественников, которые способны регенерировать ткани, к миграции в поврежденную ткань и там регенерации ткани, которая была утрачена. Для этого матрица должна быть сконфигурирована таким образом, чтобы желательные клетки смогли бы мигрировать в матрицу, а нежелательные клетки не смогли бы. Такое использование в общем случае описывается под наименованием направленная регенерация тканей (GTR).

Поэтому матрицу, соответствующую изобретению, либо имплантат, соответствующий изобретению, можно использовать для лечения организма человека либо животного. Для этого одну либо несколько матриц или же один либо несколько имплантатов вводят в подвергаемый лечению организм в результате проведения хирургического вмешательства. Если имплантат будет содержать клетки, обладающие функцией органа, либо если клетки, обладающие функцией органа, должны будут мигрировать в матрицу, что имеет место, например, в случае гепатоцитов либо клеток островков Лангерганса, то тогда матрицы либо имплантаты, например, можно будет имплантировать в брыжейку, подкожную основу, забрюшинное пространство, предбрюшинное пространство либо внутримышечное пространство индивидуума, подвергающегося лечению.

В принципе, любых индивидуумов, для которых требуется надлежащая замена ткани, можно лечить при использовании матриц либо имплантатов, соответствующих изобретению. Данными индивидуумами, как правило, являются индивидуумы, которые страдают от специфических расстройства либо заболевания, ход развития которых включает утрату функциональной ткани. Они потенциально могут затрагивать целые органы, например, печень либо поджелудочную железу. Таким образом, настоящее изобретение направлено, в частности, на лечение заболеваний, которые приводят к хроническим печеночной недостаточности либо недостаточности поджелудочной железы. Данные заболевания включают, например, хронический гепатит и холангиолитический цирроз печени у взрослых, а также атрезию желчных протоков и врожденные метаболические дефекты у детей. Трансплантация печени также может быть предписана и в случае карцином печени. С другой стороны, трансплантацию поджелудочной железы предписывают, в частности, в случае всех форм сахарного диабета, в частности, сахарного диабета типа I либо типа II.

Поэтому настоящее изобретение также относится к применению матрицы, соответствующей изобретению, либо имплантата, соответствующего изобретению, при изготовлении доступного терапевтического средства для проведения трансплантации у индивидуума и в данной связи, в частности, для лечения индивидуума, который страдает, по меньшей мере, от частичной утраты функциональной ткани, которую необходимо будет заменить при использовании трансплантата.

Следующие далее примеры предназначены для иллюстрирования изобретения без ограничения его объема.

Пример 1

Получение матрицы

а) Без использования раствора полимера

Гранулы полимера (Resomer® RG 858, получаемые от компании Boehringer, Ingelheim) замораживали в жидком азоте и измельчали в замороженном состоянии (система с ударным воздействием Däschle; 12000 об/мин, 2 мин). Частицы измельченного полимера просеивали. Частицы, характеризующиеся размером в диапазоне от 108 мкм до 250 мкм, использовали для получения матрицы. В данной связи 16% масс. используемого полимера характеризовались размером частиц в диапазоне от 108 мкм до 140 мкм, в то время как 22% масс. используемого полимера характеризовались размером частиц в диапазоне от 145 мкм до 180 мкм, 46% масс. используемого полимера характеризовались размером частиц в диапазоне от 185 мкм до 220 мкм, и 16% масс. используемого полимера характеризовались размером частиц в диапазоне от 225 мкм до 250 мкм. Хлорид натрия (поваренная соль) просеивали и для получения матрицы использовали частицы хлорида натрия, характеризующиеся размером частиц в диапазоне от 250 мкм до 425 мкм. В данной связи 25% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 250 мкм до 320 мкм, 44% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 330 мкм до 380 мкм, и 31% масс. используемой соли характеризовался размером частиц в диапазоне от 390 мкм до 425 мкм. 760 мг частиц хлорида натрия и 40 мг частиц полимера перемешивали друг с другом. Смесь вносили в матрицу штампа и прессовали при использовании гидравлического пресса в течение 1 минуты при давлении поршня, равном 1000 фунт/дюйм². После этого заготовки для матрицы выкладывали на пластинку из материала Teflon и насыщали газом в течение 24 часов в атмосфере СО₂ (850 фунт/дюйм²). Заготовки после этого подвергали пропитыванию в течение 24 часов для того, чтобы в результате растворения удалить заключенные в материал частицы соли. В заключение, матрицы высушивали в течение 12 часов на фильтровальной бумаге.

Получающаяся в результате полимерная матрица характеризовалась пористостью, равной 95±2%, и определенным размером пор, который методом сканирующей электронной микроскопии определили равным 250 мкм±120 мкм.

b) С использованием раствора полимера

Хлорид натрия (чистый для анализа) измельчали (система с ударным воздействием Däschle; 12000 об/мин, 2 мин), а после этого просеивали и для получения матрицы использовали частицы хлорида натрия, характеризующиеся размером частиц в диапазоне от 108 до 425 мкм. В данной связи 8% используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 108 мкм до 140 мкм, в то время как 6% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 145 мкм до 180 мкм, 12% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 185 до 220 мкм, 6% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 225 мкм до 250 мкм, 25% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 250 мкм до 320 мкм, 26% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 330 мкм до 380 мкм, и 17% масс. используемой соли характеризовались размером частиц в диапазоне от 390 мкм до 425 мкм. 96 г частиц хлорида натрия перемешивали с 1 г частиц полимера, описанных в примере 1а), а после этого подвергали обработке, пользуясь 100 мл раствора в хлороформе, который содержит 4 г полимера в растворенной форме. Смесь, которую получали таким образом, нагревали при температуре в диапазоне от 45°С до 65°С, что в результате приводило к испарению хлороформа в течение приблизительно 25 минут. Смесь остаточная соль/полимер после этого прессовали с использованием гидравлического пресса в течение одной минуты при давлении поршня, равном 1000 фунт/дюйм², и после этого подвергали пропитыванию в течение 24 часов для того, чтобы в результате растворения удалить заключенные в материал частицы соли. После этого матрицу насыщали газом так, как это описывается выше, и, в конце концов, высушивали в течение 12 часов на фильтровальной бумаге.

Получающаяся в результате полимерная матрица характеризовалась пористостью, равной 96%.

Если 98,5 г частиц соли перемешать с 0,5 г частиц полимера, а смесь подвергнуть обработке, пользуясь 100 мл раствора в хлороформе, который содержит 1 г полимера, то тогда получается матрица, характеризующаяся пористостью, равной 99%.

Если 99,2 г частиц соли перемешать с 0,1 г частиц полимера, а данную смесь подвергнуть обработке, пользуясь 100 мл раствора в хлороформе, который содержит приблизительно 0,9 г полимера, то тогда получается полимерная матрица, характеризующаяся пористостью, равной 99%.

Пример 2

а) Нанесение на матрицу покрытия из фибронектина

Матрицу из примера 1 погружали в раствор карбонатного буфера, который содержал 3 мкг на 1 мл фибронектина, полученного из плазмы человека, (Sigma), и который характеризовался величиной рН, равной 9,4. По истечении приблизительно 60 сек, матрицу извлекали из раствора, подвергали лиофилизации и γ-стерилизации.

Пример 3

Выделение клеток

По известному способу, у индивидуума, которому будут проводить трансплантирование, удаляли часть печени. Часть печени, которую удаляли, прежде всего подвергали перфузии в течение 7 минут при скорости течения, равной 30 мл/мин, и при 37°С, пользуясь раствором (8,3 г NaCl; 0,5 г KCl; 2,38 г HEPES; с доведением до 1000 мл, пользуясь дистиллированной водой; рН 7,4). Часть печени после этого еще подвергали перфузии в течение промежутка времени продолжительностью от 6 до 7 мин при скорости течения, равной 30 мл/мин, и при 37°С, пользуясь раствором коллагеназа/ингибитор трипсина (8,3 г NaCl; 0,5 г KCl; 2,38 г HEPES; 0,7 г CaCl₂ x 2H₂O; 500 мг коллагеназы (коллагеназа Н, Boehringer Mannheim, Мангейм, Германия); 7,5 мг ингибитора трипсина (ICN, Эшвеге, Германия); с доведением до 1000 мл, пользуясь дистиллированной водой; рН 7,35). После того, как перфузия подходила к концу, часть печени иссекали и осторожно встряхивали в среде Уильямса Е. Суспензию клеток отфильтровывали (нейлоновая сетка; 200 мкм) и после этого промывали, пользуясь средой Уильямса Е. После этого клетки центрифугировали при 50g при 4°С в течение 3 мин. Жизнеспособность клеток, которую определяли при использовании препарата триптанового голубого, составляла 95%.

Клетки островков Лангерганса выделяли из части поджелудочной железы тем же самым образом.

Пример 4

Формирование колоний клеток

На первой стадии матрицы, на которые наносили покрытие в примере 2, инкубировали вместе с клетками островков Лангерганса, которые выделяли так, как это описывается в примере 3.

Для этого 3000 клеток островков в расчете на 1 мл суспендировали в смешанном растворе, образованном из М199 и FСS (сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота) (объемное соотношение 19:1). Количество клеток определяли, проводя его подсчет в трубке для счета клеток диаметром 0,25 мм с использованием темнопольного микроскопа Olympus. После этого при помощи пипетки на матрицу наносили от 8 мл до 10 мл данного раствора. Избыточный раствор, который не оставался в матрице, отбрасывали. Матрицу, которую подвергали обработке таким образом, после этого помещали на 4 часа в инкубатор для культивирования клеток для того, чтобы дать клеткам возможность прилипнуть. После этого на матрицу наносили раствор, состоящий из среды Уильямса Е, который в расчете на мл содержал неочищенную суспензию клеток печени, содержащую приблизительно 5,0 х 10⁷ жизнеспособных гепатоцитов и приблизительно 1,0 х 10⁶ неперенхиматозных клеток печени. При использовании пипетки наносили от 8 мл до 12 мл раствора; избыточный раствор, который не поглощала матрица, отбрасывали. Перед имплантированием матрицу можно выдерживать в течение приблизительно 1,5 часа на льду. Если имплантирование предполагается провести в более позднее время, то тогда матрицу можно сохранять в стандартных условиях в проточном биореакторе в течение вплоть до 5 дней.

Пример 5

Секреторная деятельность и скорость разрастания гепатоцитов

Крысам Lewis трансплантировали матрицы с колониями клеток, описанные в примере 4. Трансплантаты снова извлекали из животных в различные моменты времени и подвергали морфометрии. Количество клеток в трансплантатах, которые имели форму круглого диска, характеризующегося диаметром 15 мм и толщиной 2 мм, составляло 94 х 10³, 140 х 10³ и, соответственно, 146 х 10³ по истечении 1, 6 и 12 месяцев после трансплантирования. Гепатоциты из трансплантата, который удаляли по истечении одного месяца после трансплантирования, демонстрировали нормальную экспрессию альбумина. Разрастающиеся гепатоциты обнаруживали во всех препаратах, при этом какого-либо патологического увеличения скорости разрастания не наблюдалось. Гепатоциты, которые трансплантировали в соответствии с изобретением, демонстрировали включение BrdU (бромдеоксиуридина), которое увеличивалось в 3 раза по сравнению с тем, что имеет место у стандартных препаратов печени.

Пример 6

Васкуляризация

Дополнительные исследования матриц, описанных в примере 4, продемонстрировали, что данные матрицы замечательно хорошо подвергаются васкуляризации всего лишь по истечении одного месяца после имплантирования. Кровеносные сосуды макроскопически дотягивались до матрицы, и в результате надлежащей капилляризации трансплантированные гепатоциты и клетки островков Лангерганса приобретали контакт с сердечнососудистой системой реципиента трансплантата.

Кроме того, можно было наблюдать, что подвергнутые совместному трансплантированию клетки островков Лангерганса не вызывают у реципиента появления гипогликемии. Эндокринная секреторная деятельность данных клеток, а также собственных клеток островков реципиента, по-видимому, регулировалась по механизму обратной связи.

Пример 7

Усваивание функции печени

Крысы Gunn рассматривались в качестве модельного животного для врожденной негемолитической желтухи типа I у человека, поскольку в результате наличия специфического врожденного дефекта метаболических ферментов их печени неспособны надлежащим образом связывать билирубин. В результате токсические уровни несвязанного билирубина в сыворотке крови приводят к смерти вследствие нанесения существенного последующего повреждения.

Трем крысам Gunn трансплантировали матрицу с колониями клеток, описанную в примере 4. Матрица характеризовалась величиной площади внешней поверхности, в общей сложности равной 10 см².

Уровни билирубина у животных в эксперименте уменьшались всего лишь по истечении четырех недель после трансплантирования. После этого происходило связывание билирубина. Во всех трех случаях связанный билирубин можно было детектировать при использовании зонда для желчного протока в желчных протоках печени, которая все еще присутствовала. Следовательно, билирубин, который связывался в матрице, достигал печени через кровь и мог быть удален из печени посредством системы желчных протоков.

Пример 8

Пациенты-люди

Матрицы с колониями клеток, описанные в примере 4, трансплантировали в брюшную полость пациента, страдающего от явно выраженного цирроза печени. Приведенная ниже таблица 1 обобщенно представляет данные лабораторного исследования для пациента до трансплантирования.

Таблица 1 Параметр Пациент 1 GOT (глютамино-щавелевоуксусная трансаминаза) 27 GPT (глютамино-пировиноградная трансаминаза) 35 gGt (гамма-глютаминтранспептидаза) 89 CHE (холинэстераза) 2421 Сывороточный альбумин 24,1

Пациенту 1 (этилтоксический цирроз печени, ранее декомпенсированный несколько раз, в настоящее время неактивный) вводили 4 матрицы (в каждом случае 124 мм х 45 мм х 5 мм).

Приведенная далее таблица 2 обобщенно представляет характеристики для печени по истечении 3, 10 и соответственно 20 недель после трансплантирования.

Таблица 2   Пациент 1   3 10 20 GOT 22 10 11 GPT 28 9 28 gGt 71 10 9 Сывороточный альбумин 28,6 42 44 СНЕ 2652 4400 4600

Изобретение относится к пористым матрицам, основой которых являются биологически приемлемые полимер либо полимерная смесь, к клеточным имплантатам, которые формируют на последних, к другим клеточным имплантатам, основой которых являются клеточные смеси, образованные из гепатоцитов и клеток островков Лангерганса, к способу получения пористых матриц и к матрицам, которые можно получить при использовании данного способа. Пористую матрицу для тканевой инженерии на основе биологически совместимого полимера либо полимерной смеси получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия, характеризующихся определенным размером частиц, и затем удаления хлорида натрия в результате растворения. Матрица имеет степень пористости в диапазоне от 93 до 98% и обладает порами, характеризующимися различными размерами, при заданном распределении пор по размерам в пределах конкретных диапазонов. Полученные матрицы являются свободно формуемыми, при этом обеспечивают необходимые условия устойчивости и жесткости для выдерживания воздействия методики хирургического имплантирования и противодействия механическим усилиям, действующим на место имплантирования. 7 н. и 33 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Пористая матрица для тканевой инженерии на основе биологически совместимого полимера либо полимерной смеси, которую получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия и затем удаления хлорида натрия в результате растворения, отличающаяся тем, что матрица имеет степень пористости в диапазоне от 93 до 98%, при этом от 0,5 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; от 2 до 8% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; от 2 до 8% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; от 1 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; от 11 до 23% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; от 4 до 10% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; от 5 до 17% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; от 7 до 19% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; от 3 до 9% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; от 12 до 24% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и от 5 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм.

2. Матрица по п.1, отличающаяся тем, что биологически совместимым полимером является биологически разлагающийся полимер, выбранный из природных полимеров, таких как альбумин, фибриноген, коллаген, желатин, хитин, хитозан, агароза, альгинат, и синтетических полимеров, таких как полиангидриды, поли(ε-капролактон) и сложные поли(α-гидроксиэфиры).

3. Матрица по п.2, отличающаяся тем, что биологически разлагающимся полимером является сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, характеризующийся содержанием звеньев молочной кислоты, равным 85 мол.%, и содержанием звеньев гликолевой кислоты, равным 15 мол.%.

4. Матрица по п.1, отличающаяся тем, что на поверхность матрицы наносят покрытие в виде, по меньшей мере, одного белка внеклеточного матрикса, выбранного из коллагенов, ламинина и фибронектина.

5. Матрица по п.4, отличающаяся тем, что нанесенное покрытие содержит фибронектин или нанесенное покрытие содержит смесь коллагена типа I, ламинина и коллагена типа IV.

6. Пористая матрица для тканевой инженерии на основе биологически совместимого полимера либо полимерной смеси, которую получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия и затем удаления хлорида натрия в результате растворения, отличающаяся тем, что матрица имеет степень пористости в диапазоне от 93 до 98%, при этом от 1 до 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; от 3 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; от 3 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; от 2 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; от 13 до 21% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; от 5 до 9% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; от 7 до 15% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; от 9 до 17% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; от 4 до 8% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; от 14 до 22% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и от 7 до 15% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм.

7. Матрица по п.6, отличающаяся тем, что биологически совместимым полимером является биологически разлагающийся полимер, выбранный из природных полимеров, таких как альбумин, фибриноген, коллаген, желатин, хитин, хитозан, агароза, альгинат, и синтетических полимеров, таких как полиангидриды, поли(ε-капролактон) и сложные поли(α-гидроксиэфиры).

8. Матрица по п.7, отличающаяся тем, что биологически разлагающимся полимером является сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, характеризующийся содержанием звеньев молочной кислоты, равным 85 мол.%, и содержанием звеньев гликолевой кислоты, равным 15 мол.%.

9. Матрица по п.6, отличающаяся тем, что на поверхность матрицы наносят покрытие в виде, по меньшей мере, одного белка внеклеточного матрикса, выбранного из коллагенов, ламинина и фибронектина.

10. Матрица по п.9, отличающаяся тем, что нанесенное покрытие содержит фибронектин или нанесенное покрытие содержит смесь коллагена типа I, ламинина и коллагена типа IV.

11. Пористая матрица для тканевой инженерии на основе биологически совместимого полимера либо полимерной смеси, которую получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия и затем удаления хлорида натрия в результате растворения, отличающаяся тем, что она имеет степень пористости в диапазоне от 93 до 98%, при этом от 2 до 4% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; от 4 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; от 4 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; от 3 до 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; от 15 до 19% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; от 6 до 8% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; от 9 до 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; от 11 до 15% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; от 5 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; от 16 до 20% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и от 9 до 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм.

12. Матрица по п.11, отличающаяся тем, что биологически совместимым полимером является биологически разлагающийся полимер, выбранный из природных полимеров, таких как альбумин, фибриноген, коллаген, желатин, хитин, хитозан, агароза, альгинат, и синтетических полимеров, таких как полиангидриды, поли(ε-капролактон) и сложные поли(α-гидроксиэфиры).

13. Матрица по п.12, отличающаяся тем, что биологически разлагающимся полимером является сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, характеризующийся содержанием звеньев молочной кислоты, равным 85 мол.%, и содержанием звеньев гликолевой кислоты, равным 15 мол.%.

14. Матрица по п.11, отличающаяся тем, что на поверхность матрицы наносят покрытие в виде, по меньшей мере, одного белка внеклеточного матрикса, выбранного из коллагенов, ламинина и фибронектина.

15. Матрица по п.14, отличающаяся тем, что нанесенное покрытие содержит фибронектин или нанесенное покрытие содержит смесь коллагена типа I, ламинина и коллагена типа IV.

16. Пористая матрица для тканевой инженерии на основе биологически совместимого полимера либо полимерной смеси, которую получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия и затем удаления хлорида натрия в результате растворения, отличающаяся тем, что матрица имеет степень пористости в диапазоне от 93 до 98%, при этом матрица включает: 3% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; 4% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; 17% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; 11% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; 18% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и 11% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм.

17. Матрица по п.16, отличающаяся тем, что биологически совместимым полимером является биологически разлагающийся полимер, выбранный из природных полимеров, таких как альбумин, фибриноген, коллаген, желатин, хитин, хитозан, агароза, альгинат, и синтетических полимеров, таких как полиангидриды, поли(ε-капролактон) и сложные поли(α-гидроксиэфиры).

18. Матрица по п.17, отличающаяся тем, что биологически разлагающимся полимером является сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, характеризующийся содержанием звеньев молочной кислоты, равным 85 мол.%, и содержанием звеньев гликолевой кислоты, равным 15 мол.%.

19. Матрица по п.16, отличающаяся тем, что на поверхность матрицы наносят покрытие в виде, по меньшей мере, одного белка внеклеточного матрикса, выбранного из коллагенов, ламинина и фибронектина.

20. Матрица по п.19, отличающаяся тем, что нанесенное покрытие содержит фибронектин или нанесенное покрытие содержит смесь коллагена типа I, ламинина и коллагена типа IV.

21. Способ получения пористой матрицы на основе биологически разлагающегося полимера либо полимерной смеси, отличающийся тем, что смесь частиц полимера и смесь частиц хлорида натрия уплотняют и хлорид натрия затем удаляют в результате растворения, причем смесь частиц хлорида натрия содержит от 22 до 28 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 250 до 320 мкм, от 42 до 46 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 330 до 380 мкм, и от 29 до 33 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 390 до 425 мкм или смесь частиц хлорида натрия содержит от 7 до 9 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 108 до 140 мкм, от 5 до 7 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 145 до 180 мкм, от 10 до 14 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 185 до 220 мкм, от 5 до 7 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 225 до 250 мкм, от 22 до 28 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 250 до 320 мкм, от 22 до 28 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 330 до 380 мкм, и от 15 до 19 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 390 до 425 мкм и
смесь частиц полимера содержит от 14 до 18 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 108 до 140 мкм, от 20 до 24 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 145 до 180 мкм, от 43 до 49 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 185 до 220 мкм, и от 14 до 18 мас.% частиц, характеризующихся размером частиц в диапазоне от 225 до 250 мкм.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что массовое соотношение между частицами полимера и частицами хлорида натрия находится в диапазоне от 1:20 до 1:18.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что до проведения уплотнения к смеси, образованной из частиц полимера и частиц хлорида натрия, добавляют раствор полимера, а растворитель удаляют.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что растворитель растворяет полимер, но не соль.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что растворитель выбирают из ацетона, этилацетата, метиленхлорида, хлороформа, гексафторизопропанола, хлорированных и фторированных, алифатических и ароматических углеводородов, тетрагидрофурана, этилметилового кетона, диэтилового кетона и их смесей.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что полимером является полигликолевая кислота, полимолочная кислота либо сополимер гликолевая кислота/молочная кислота, а растворителем является хлороформ.

27. Способ по п.23, отличающийся тем, что массовое соотношение между частицами полимера и растворенным полимером находится в диапазоне от 1:1 до 1:10.

28. Способ по п.21, отличающийся тем, что уплотнение осуществляют под действием давления.

29. Способ по п.21, отличающийся тем, что воде дают возможность воздействовать на уплотненную смесь с целью удаления хлорида натрия в результате растворения.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что воду повторно удаляют.

31. Способ по п.21, отличающийся тем, что сначала уплотненную смесь хранят в атмосфере СО₂, а впоследствии хлорид натрия удаляют в результате растворения.

32. Способ по любому из пп.21-31, отличающийся тем, что смесь, образованную из частиц полимера, частиц хлорида натрия и раствора полимера, уплотняют, а после этого частицы хлорида натрия удаляют в результате растворения.

33. Способ по п.32, отличающийся тем, что полимер выбирают из полиангидридов, сложных полиортоэфиров, сложных поли(α-гидроксиэфиров), полиэфирамидов на основе сложных эфиров, полиамидов, полиэфироэфиров на основе сложных и простых эфиров, поликарбонатов, полиалкиленов, полиалкиленгликолей, полиалкиленоксидов, полиалкилентерефталатов, поливиниловых спиртов, простых поливиниловых эфиров, сложных поливиниловых эфиров, поливинилгалогенидов, поливинилпирролидонов, полисилоксанов, полистиролов, полиуретанов, марок дериватизированной целлюлозы и полимеров и сополимеров (мет)акриловой кислоты.

34. Способ по п.32, отличающийся тем, что раствор содержит полимер в растворенной форме и частицы полимера в твердой форме.

35. Способ по п.32, отличающийся тем, что раствор не растворяет хлорид натрия.

36. Матрица для тканевой инженерии, которую можно получить при использовании способа по пп.21-35.

37. Имплантат для тканевой инженерии, который содержит матрицу по любому из пп.1-20 или 36 и, по меньшей мере, одну клетку ткани.

38. Имплантат по п.37, который содержит матрицу на основе биологически совместимого полимера и клетки по меньшей мере двух типов клеток, отличающийся тем, что клетками первого типа клеток являются гепатоциты, а клетками второго типа клеток являются клетки островков Лангерганса.

39. Имплантат по п.38, отличающийся тем, что соотношение между количествами гепатоцитов и клеток островков Лангерганса составляет 10⁶:3000.

40. Имплантат по п.38, отличающийся тем, что соотношение между количествами гепатоцитов и клеток островков Лангерганса составляет 10⁶:3-200.