Способ приготовления микрокапсул с островками Лангерганса и микрокапсула по предложенному способу Российский патент 2024 года по МПК A61K35/39 A61K47/32 A61K47/36 A61K9/50 A61P3/10 B01J13/02 

Группа изобретений относится к биомедицине и может быть использована для получения препаратов, предназначенных для лечения и профилактики осложнений сахарного диабета 1 типа.

Клеточные технологии в лечении инсулин-дефицитных состояний являются современным многообещающим подходом и обеспечивают долгосрочную перспективу для профилактики развития острых и хронических жизнеугрожающих осложнений диабета. Неконтролируемый СД приводит к тяжелым хроническим осложнениям, включая нефропатии, ретинопатии, болезни сердечно-сосудистой системы, нейропатии и др. Искусственные системы доставки инсулина не гарантируют полного гликемического контроля. Только трансплантация инсулин-продуцирующих клеток способна обеспечить значительное улучшение метаболического контроля уровня глюкозы при отсутствии тяжелых гипогликемических событий в реальном времени. Во всем мире уже выполнено более 5000 ауто- и аллотрансплантаций островков Лангерганса для лечения хронического панкреатита, сахарного диабета 1 типа и доброкачественных заболеваний поджелудочной железы [Piemonti L., Endotext [Internet], 2000]. Начаты клинические исследования с использованием инсулин-продуцирующих клеток, полученных из стволовых клеток, для терапии сахарного диабета [Ramzy A, et al. Cell Stem Cell. 2021]. Трансплантация островков Лангерганса (ОЛ) в перспективе может позволить полностью освободить больного от необходимости пожизненных инъекций эндогенного инсулина, которые сейчас являются стандартом лечения [Archibald, P. R., & Williams, D. J. Regen. Med. 2015]. На данный момент наиболее прогрессивные клинические методики аллогенной трансплантации островков поджелудочной железы позволяют достигать инсулин независимости почти у 50% реципиентов через пять лет после трансплантации [Marikar S. N. et al. Cellular and Molecular Life Sciences. 2022]. Достижение инсулин независимости не является основной целью трансплантации, главное – профилактика фатальных гипогликемий, основной причины смерти пациентов с сахарным диабетом первого типа. Недостатком этого метода является необходимость применения иммуносупрессивной терапии, что ведет к снижению качества жизни пациента, увеличению риска инфекционных, онкологических, сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний. Последствия долгосрочной иммуносупрессии могут во многом нивелировать плюсы использования трансплантата, что в совокупности с проблемой нехватки доноров делает широкое применение такого метода практически невозможным [Rana A. et al. JAMA surgery. 2015]. Инкапсуляция трансплантируемых клеток в пористые полимерные оболочки, защищающие трансплантированные клетки путем их физической изоляции от иммунных клеточных реакций организма, может позволить полностью отказаться от системной иммуносупрессии и значительно увеличить срок жизни клеток в организме реципиента. Наиболее популярным полимером для инкапсуляции клеток является альгинат натрия, способный в присутствии поливалентных ионов быстро образовывать гидрогели при нейтральном pH и умеренных температурах. Наиболее изученным подходом для повышения стабильности альгинатных микрокапсул к внешним воздействиям является покрытие их полиаминокислотами, такими как поли-L-лизин, поли-L-орнитин и поли-L-гуанидин. Это положительно сказывается на механических свойствах гидрогелей и увеличивает стабильность микрокапсул, но может in vivo приводить к активации воспалительных цитокинов и увеличению фиброза [White A. M. et al. ACS biomaterials science & engineering. 2019]. Несмотря на существенные достижения в стратегии использования альгината для инкапсуляции инсулин-продуцирующих клеток, при переходе к стадии клинических испытаний исследования часто терпят неудачу из-за смерти трансплантата вследствие иммунного ответа организма реципиента на инородное тело и разрушения микрокапсулы. До сих пор не разработано универсальной методики, позволяющей инкапсулированным клеткам хорошо приживаться и долго функционировать в организме реципиента без применения системной иммуносупрессии.

Для сохранения жизнеспособных островков Лангерганса и снижения уровня глюкозы в крови в организме реципиента с сахарным диабетом предложен подход на основе использования микрокапсулы для островковых клеток.

Известны микрокапсулы для клеток и способ приготовления микрокапсул. Изобретение [RU 2429864] относится к композиции, включающей альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты и поликатион, имеющий индекс полидисперсности менее 1,5. Композиция является особенно пригодной для изготовления биологически совместимых микрокапсул, содержащих живые клетки для алло- или ксенотрансплантации. Указанные микрокапсулы являются более долговечными и могут сохранять свою структурную и функциональную целостность в течение длительных периодов времени по сравнению с известными альгинатными микрокапсулами. Микрокапсулы также имеют усиленную морфологию поверхности, и их можно вводить в области, которые ранее отличались повышенной склонностью к воспалению. К недостаткам данного способа относятся сложная технология получения микрокапсул за счет воздушной или высокочастотной генерации капель, а также данный способ не предусматривает получение избирательно проницаемой микрокапсулы для защиты трансплантированных клеток от иммунной системы реципиента. В данном изобретении не была проведена оценка жизнеспособности инкапсулированных клеток, а также реакции организма на микрокапсулы, включающие в себя клеточный компонент. Необходимо отметить, что в научной литературе практически отсутствует описание использования данного подхода для инкапсулирования островков Лангерганса. По-видимому, это связано с разрушением островков в условиях высокочастотной генерации микрокапсул.

Из работы [Pareta R, McQuilling JP, Sittadjody S, et al. Long-term function of islets encapsulated in a redesigned alginate microcapsule construct in omentum pouches of immune-competent diabetic rats. Pancreas. 2014;43(4):605-613] известна инкапсуляция островков Лангерганса в микрокапсулу диаметром 300 – 400 мкм., изготовленную из 1,5% альгината маловязкой высокоманнуроновой кислоты (LVM), а затем во внешний слой, изготовленный из 1,25% низковязкого альгината высокой гулуроновой кислоты (LVG) с или без FGF-1. Два альгинатных слоя микрокапсулы разделены селективной мембраной, изготовленной из 0,1% поли-L-орнитина (PLO), а внутреннее ядро LVM частично хелатировано с использованием 55 мМ цитрата натрия в течение 2 мин. Инкапсулированные аллотрансплантаты островков (~ 2000 островков/кг) у крыс Льюиса со стрептозотоциновым диабетом вызывали снижение уровня глюкозы в крови. Изобретение обеспечивает снижение глюкозы в крови животных с индуцированным диабетом с сохранением морфологически и функционально интактных островков в микрокапсулах без признаков фиброза спустя 90 дней после трансплантации. К недостаткам указанных микрокапсул можно отнести высокую стоимость реагентов для приготовления микрокапсул и небольшое (20%) снижение уровня глюкозы по сравнению с контрольной группой животных.

Известен способ приготовления и микрокапсула для клеточной генной терапии усовершенствованных альгинат-поли(L -лизин)-альгинатных (АРА) микрокапсул [Shen F, Mazumder MA, Burke NA, et al. Mechanically enhanced microcapsules for cellular gene therapy. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009;90(1):350-361]. В этом исследовании описано получение микрокапсулы из пяти слоёв: альгината натрия, поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид- с-2-аминоэтилметакрилат гидрохлорид) (С70), поли(метакрилат натрия- с-2-(метакрилоилокси) этилацетоацетат (А70), полилизином и альгинатом натрия. Изобретение предполагает повышение стабильности альгинатных микрокапсул к внешним воздействиям. Стабильность микрокапсул была подтверждена после 4-недельной имплантации мышам. Отсечение по молекулярной массе альгинат-С70-А70-полилизин-альгинат сходно с таковым у альгинат-полилизин-альгинат. Клетки, инкапсулированные в модифицированные микрокапсулы, были функционально активными. In vivo биосовместимость новых микрокапсул была аналогична микрокапсулам альгинат-полилизин-альгинат. Недостатками данного способа являются высокие стоимость и трудозатраты для его исполнения. Микрокапсула обладает избыточным количеством слоев и использует 5 полимеров, в т.ч. предварительно сшитых. Также данный способ демонстрирует повышенную адгезию клеточных белков к поверхности микрокапсулы, тем самым вызывая подтвержденное наличие воспалительной реакции на материал микрокапсулы через неделю после трансплантации. Для ее снижения требуются особая питательная среда для клеток, то есть появляется необходимость использования дополнительных компонентов.

Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является микрокапсула островковых клеток для тканевой инженерии и способ приготовления микрокапсулы описанный в [CN110251731A]. Микрокапсула состоит из альгината натрия, активного аминокомпонента и полиэтиленгликоля. Внутренний слой микрокапсулы состоит из альгината натрия, модифицированного пептидом аргинин-глицин-аспарагиновая кислота, а затем в качестве стабилизатора используется полилизин, связанный с гиперразветвленным полиэтиленимином, при этом сверхразветвленный полиэтиленимин усиливает сшивание полилизинового слоя для улучшения механических свойств микрокапсулы; а самый внешний слой микрокапсулы состоит из сегментов полиэтиленгликоля, которые односторонне закреплены на активных аминокомпонентах (полилизин/полиэтиленимин). Благодаря способности сегментов полиэтиленгликоля скользить, микрокапсула оказывает ингибирующее действие на адгезию белков и клеток; поскольку полиэтиленгликоль является материалом, имеющим тенденцию быть «невидимым»; в организме человека, и, таким образом, микрокапсула может в определенной степени ингибировать фиброз, так что время выживания активных клеток продлевается; и микрокапсула может в определенной степени улучшить уровень сахара в крови у пациентов с диабетом 1 типа. Изобретение обеспечивает снижение глюкозы в крови животных с индуцированным диабетом на протяжении 15 дней. Недостатком указанного способа получения микрокапсул является использование суспензии разрозненных островковых клеток, что существенно снижает эффективность их работы за счет разрушения межклеточных контактов, а также краткосрочное действие трансплантата, подтверждающееся на протяжении 15 дней.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является способ получения микрокапсулы островков Лангерганса для решения вышеуказанных технических проблем, а именно, обеспечения более высокой биосовместимости и сохранения жизнеспособности и функциональной активности трансплантата на протяжении длительного времени.

Технический результат заключается в создании микрокапсулы, содержащей островки Лангерганса, которая обеспечивает функционирование трансплантированных островков в организме реципиента на длительный период и повышает эффективность их использования.

Технический результат достигается тем, что

осуществляют смешение островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да в любом из физиологических растворов так, чтобы концентрация альгината натрия составляла от 1 до 3 мас.%, декстрана –15 мас.%, в 1 мл суспензии - от 5× 10³ до 25× 10³ островков Лангерганса;

используя полученную суспензию островков Лангерганса в качестве дисперсной фазы и водный раствор ПЭГ-8000 с концентрацией 30 мас.% в качестве непрерывной фазы, методом микрофлюидики формируют альгинатные микрокапсулы, содержащие от 1 до 5 островков Лангерганса;

помещают альгинатные микрокапсулы в водный изотонический раствор хлорида бария с образованием осадка из сшитых микрокапсул с островками Лангерганса;

промывают полученный осадок микрокапсул в физиологическом растворе и помещают его в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида со средневесовой молекулярной массой от 200 до 1000 кДа в физиологическом растворе с концентрацией от 0,01 до 3 мас.% на время от 5 до 20 минут;

промывают полученный осадок микрокапсул в физиологическом растворе и помещают его в раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией от 0,02 до 0,5 мас.% на время от 2 до 10 минут;

промывают полученный осадок микрокапсул в физиологическом растворе и помещают микрокапсулы в питательную среду для последующего использования.

Предпочтительно при смешении островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана концентрация альгината натрия составляет 2 мас.%, в 1 мл суспензии - от 15× 10³ до 20× 10³ островков Лангерганса; формируют микрокапсулы с содержанием 3-4 островков Лангерганса, используют раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида со средневесовой молекулярной массой от 300 до 600 кДа в физиологическом растворе с концентрацией 0,4 мас.%); устанавливают время для нахождения в растворе 10 минут; используют раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией 0.2 мас.%; устанавливают время для нахождения в растворе 5 минут.

В результате применения способа получают микрокапсулу, содержащую островки Лангерганса и три полимерных слоя: альгинат натрия, катионный полимер поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид, альгинат натрия.

Описание сопровождается изображениями, на которых представлено следующее:

Фиг. 1. Электронная микрофотография альгинатной трёхслойной микрокапсулы. 1 - альгинатное ядро; 2 - плотный слой полимера (PMETAC); 3 – тонкий верхний слой альгината. Масштабная линейка 1 мкм.

Фиг 2. Изменение размеров микрокапсул при проведении осмотического теста на седьмой день после синтеза (медиана ± квартили 25-75).

Фиг 3. Оценка проницаемости микрокапсул FITC-мечеными лектинами. А - микрокапсулы проницаемы для низкомолекулярных веществ (<36 кДа); Б - микрокапсулы не проницаемы для высокомолекулярных веществ (> 120 кДа).

Фиг 4. Оценка жизнеспособности выделенных ОЛ (окрашивание набором Life/Dead. Зеленое – живое, красное – мертвое). А - до инкапсуляции; Б - после инкапсуляции.

Фиг 5. Сравнение жизнеспособности островков Лангерганса (ОЛ) до и после инкапсуляции (медиана ± квартили 25-75).

Фиг 6. График мониторинга уровня глюкозы в крови крыс с диабетом без лечения и с трансплантацией инкапсулированных островков Лангерганса

Способ осуществляют в соответствии со следующими этапами:

(1) Смешивание островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да проводили в физиологическом растворе так, чтобы концентрация альгината натрия составляла приблизительно от 1 до 3 мас.% (предпочтительно 2 мас.%), декстрана – 5–20 мас.% (приблизительно 15 мас.%), в 1 мл суспензии содержалось 5–25×10³ островков Лангерганса (предпочтительно от 15× 10³ до 20× 10³).

(2) Формирование альгинатных микрокапсул, содержащих от 1 до 5 островков Лангерганса (предпочтительно от 3 до 4), методом микрофлюидики, где в качестве дисперсной фазы использовалась суспензия островков Лангерганса, приготовленная по пункту (1), а в качестве непрерывной фазы использовался водный раствор ПЭГ-8000 с концентрацией 5 – 40 мас.% (приблизительно 30 мас.%.)

(3) Помещение альгинатных микрокапсул в водный изотонический раствор хлорида бария с образованием осадка из сшитых микрокапсул с островками Лангерганса.

(4) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

(5) Помещение осадка микрокапсул в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида со средневесовой молекулярной массой приблизительно от 200 до 1000 кДа (предпочтительно от 300 до 600 кДа) в физиологическом растворе с концентрацией приблизительно от 0.01 до 3 мас.% (предпочтительно 0.4 мас.%) на время приблизительно от 5 до 20 минут (предпочтительно на 10 минут).

(6) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

(7) Помещение осадка микрокапсул в раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией приблизительно от 0.02 до 0.5 мас.% (предпочтительно 0.2 мас.) на время приблизительно от 2 до 10 минут (предпочтительно 5 минут).

(8) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

(9) Помещение готовых микрокапсул в питательную среду для последующего использования.

По сравнению с аналогичным предшествующим уровнем техники настоящее изобретение имеет следующие полезные эффекты:

1. Островки Лангерганса находятся в ядре микрокапсулы, состоящим из альгината натрия и бария, обладающего биосовместимостью, что является одним из основных условий сохранения жизнеспособности островков Лангерганса в микрокапсуле.

2. Ядро микрокапсулы с островками Лангерганса покрывает слой механически прочного катионного полимера поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида, простого и химически стабильного аналога полилизина. Данный полимер обладает безопасностью в применении и низкой цитотоксичностью, что является необходимым условием для формирования слоя. Кроме того, слой такого катионного полимера обладает избирательной проницаемостью для низкомолекулярных веществ, к которым относятся инсулин, глюкоза, питательные вещества, не пропуская при этом высокомолекулярные вещества, к которым относятся иммуноглобулины и белки системы комплемента. Такая микрокапсула может обеспечить более высокую биосовместимость и сохранение жизнеспособности и функциональной активности трансплантата на протяжении длительного времени.

3. Внешний слой микрокапсулы островков Лангерганса состоит из альгината, фиксирующегося на поверхности слоя катионного полимера за счёт ионного взаимодействия с катионным полимером. При этом компенсируется избыточный положительный заряд поверхности микрокапсулы, что приводит к снижению адгезии белков и клеток к поверхности микрокапсулы и, соответственно, уменьшает вероятность фиброза. Это увеличивает длительность работоспособности островков Лангерганса в микрокапсуле.

Приготовленные микрокапсулы содержат 3-4 островков Лангерганса, выживаемость клеток которых в течение 5 суток после инкапсуляции составляет более 95 % по сравнению с не инкапсулированными островками. Микрокапсулы характеризуются устойчивостью при изменении осмотического давления в течение 7 дней, проницаемостью для низкомолекулярных веществ, к которым относятся инсулин, глюкоза, питательные вещества, не пропуская при этом высокомолекулярные вещества, к которым относятся иммуноглобулины и белки системы комплемента. Островки Лангерганса, заключенные в микрокапсулу, обеспечивают снижение уровня глюкозы в крови у крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом на 33% на протяжении трёх месяцев.

Таким образом, заявляемый способ приготовления микрокапсул островков Лангерганса позволяет получить микрокапсулу, которая может обеспечить более высокую биосовместимость и сохранение жизнеспособности и функциональной активности трансплантата на протяжении длительного времени. Кроме того, заявляемый способ получения микрокапсул островков Лангерганса включает в себя использование упрощенного состава исходных ингредиентов, что обеспечивает оптимизацию процесса приготовления микрокапсул, их удешевление и, соответственно, более широкое использование в клинической практике.

Пример 1

Для выделения островков Лангерганса в ткань поджелудочной железы вводили раствор коллагеназы в измененном растворе Хэнкса, обогащенном CaCl₂, с дальнейшей фрагментацией и ферментативным перевариванием панкреатической ткани. Очистку островков Лангерганса от экзокринной ткани осуществляли фильтрованием через металлическое сито с диаметром ячеек 0,5 мм. В дальнейшем разделяли эндокринную и экзокринную часть серией центрифугирований 800 g/10 мин в градиентах плотности Ficoll DL-400 (1,095, 1,084 и 1,072, 1,048 мг/л). Для оценки количества островков Лангерганса проводили окрашивание дитизоном. Выделенные островки Лангерганса поддерживали в культуральной среде RPMI c низким уровнем глюкозы при температуре 37°C и 5% СО₂.

Затем приготавливали капсулы, в соответствие со следующими этапами:

(1) Смешение островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да в физиологическом растворе так, что концентрация альгината натрия составила 2 мас.%, декстрана – 15 мас.%, в 1 мл суспензии содержалось 20×10³ островков Лангерганса.

(2) Формирование альгинатных микрокапсул, содержащих от 3 до 4 островков Лангерганса, методом микрофлюидики, где в качестве дисперсной фазы использовалась суспензия островков Лангерганса, приготовленная по пункту (1), а в качестве непрерывной фазы использовался водный раствор ПЭГ-8000 с концентрацией 30 мас.%.

(3) Помещение альгинатных микрокапсул в водный изотонический раствор хлорида бария с образованием осадка из сшитых микрокапсул с островками Лангерганса.

(4) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

(5) Помещение осадка микрокапсул в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида со средней молекулярной массой 400 кДа в физиологическом растворе с концентрацией 0.4 мас.% на 10 минут.

(6) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

(7) Помещение осадка микрокапсул в 0.2 мас.% раствор альгината натрия в физиологическом растворе на 5 минут.

(8) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

(9) Помещение готовых микрокапсул в питательную среду для последующего использования.

Оценку ультраструктуры микрокапсулы проводили с помощью электронной микроскопии. Для этого микрокапсулы фиксировали в глутаровом альдегиде, после чего отмывали, высушивали и покрывали золотом. На электронных микрофотографиях (фиг. 1) видно три слоя микрокапсулы: альгинатное ядро (поз. 1), плотный слой полимера (поз. 2) и тонкий слой альгината (поз. 3) на поверхности капсулы. Стабильность микрокапсул к внешним воздействиям, помещенных в дистиллированную воду с последующим возвращением в физиологический раствор, оценивали микроскопически в течении 7 дней. Динамика состояния микрокапсул при их инкубировании в растворах с различным осмотическим давлением представлена на фигурах (фиг. 2). Проницаемость оболочек микрокапсулы оценивали с помощью FITC-меченых лектинов WGA 36 кДа, MAL I 75 кДа, RCA I 120 кДа, SNA 150 кДа (Vector Laboratories, CША). Количественную оценку пористости и проходимости производили через 2 дня. Результаты окрашивания визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Количественный анализ проницаемости микрокапсул с островковыми клетками, меченными FITC, представляли в виде медианы c указанием верхнего и нижнего квартилей. Полученные микрокапсулы были проницаемы для веществ с молекулярной массой ниже 36 кДа (инсулин, глюкоза) и непроницаемы для веществ с молекулярной массой выше 120 кДа (антитела, белки системы комплемента) (фиг. 3). Жизнеспособность инкапсулированных клеток оценивали с использованием витального красителя LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Thermo Fisher, США), содержащего пропидий йодид для окраски мертвых клеток и кальцеин AM для окраски живых клеток. Результаты окрашивания визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Количественную оценку жизнеспособных клеток производили через 1 день, 3 дня и 5 дней после инкапсуляции (фиг. 4). Процент выживших клеток после инкапсуляции составил 95% по сравнению с клетками без микрокапсул (фиг. 5).

После трансплантации микрокапсул с островками Лангерганса животным с индуцированным диабетом проводили антибиотикотерапию в течении 3–5 дней (аугментин, 1 мг/мл). Успешность индукции СД1 и эффективность его лечения оценивалась с помощью мониторинга уровня глюкозы в крови, который проводился с использованием глюкометра (Accu-Chek, № ФСЗ 2007/00817) у всех экспериментальных групп. На протяжении 7-дневного периода формирования СД1 уровень глюкозы измерялся 1 раз в 2 дня. После этого у группы без лечения уровень глюкозы в крови по-прежнему проводился 1 раз в 2 дня. У экспериментальной группы с трансплантацией микрокапсул с ОЛ уровень глюкозы в крови измерялся 1 раз в день вечером. В контрольной группе без лечения уровень глюкозы в крови составил 28,4 ± 4,5 мМоль/л. При трансплантации инкапсулированных островков Лангерганса уровень глюкозы в крови крыс в первые 3 дня после введения составлял 23,5 ± 4,3 мМоль/л и сохранялся на уровне 19,3 ± 4,4 мМоль/л до 90 дня наблюдения, что на 33% ниже, чем у крыс без лечения. Динамика уровня глюкозы в крови крыс после трансплантации 2000 инкапсулированных ОЛ имеет колебательные паттерны, сходные с аналогичными в контрольной группе без лечения (фиг. 6).

Пример 2

Получение микрокапсул как в примере 1, с тем отличием, что:

на этапе (1) проводили смешение островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да в физиологическом растворе так, что концентрация альгината натрия составила 1 мас.%, декстрана – 15 мас.%, в 1 мл суспензии содержалось 5× 10³ островков Лангерганса,

на этапе (5) проводили помещение осадка микрокапсул в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида со средневесовой молекулярной массой 200 кДа в физиологическом растворе с концентрацией 0.01 мас.% на время 5 минут;

на этапе (7) проводили помещение осадка микрокапсул в раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией 0.02 мас.% на время 2 минут.

Пример 3

Получение микрокапсул как в примере 1, с тем отличием, что:

на этапе (1) проводили смешение островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да в физиологическом растворе так, что концентрация альгината натрия составила 3 мас.%, декстрана – 15 мас.%, в 1 мл суспензии содержалось 25× 10³ островков Лангерганса.

На этапе (5) проводили помещение осадка микрокапсул в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида со средневесовой молекулярной массой 1000 кДа в физиологическом растворе с концентрацией 3 мас.% на время 20 минут

(6) Промывка полученного осадка микрокапсул в физиологическом растворе.

На этапе (7) проводили помещение осадка микрокапсул в раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией 0.5 мас.% на время 10 минут.

Микрокапсулы, полученные по примерам 2 и 3 обладали свойствами сопоставимы с микрокапсулами, полученными по способу получения, приведенному в примере 1.

Таким образом, микрокапсула предложенного строения, включающая островки Лангерганса обеспечивает их жизнеспособность, обеспечивает функционирование трансплантированных островков в организме реципиента на длительный период и повышает эффективность в компенсации инсулинодефицита при СД1.

Группа изобретений относится к биомедицине и может быть использована для получения препаратов, предназначенных для лечения и профилактики осложнений сахарного диабета 1 типа (СД1). Способ приготовления микрокапсул с островками Лангерганса (ОЛ) включает: получение суспензии ОЛ путем смешения ОЛ с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да в физиологическом растворе так, чтобы концентрация альгината натрия составила 1-3 мас.%, декстрана - 15 мас.%, в 1 мл суспензии - от 5×10³ до 25×10³ ОЛ; используя полученную суспензию ОЛ в качестве дисперсной фазы и водный раствор ПЭГ-8000 с концентрацией 30 мас.% в качестве непрерывной фазы, методом микрофлюидики формируют альгинатные микрокапсулы, содержащие от 1 до 5 островков Лангерганса, которые помещают в водный изотонический раствор хлорида бария с образованием осадка из сшитых микрокапсул с ОЛ; полученный осадок промывают и помещают в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида) со средневесовой молекулярной массой от 200 до 1000 кДа в физиологическом растворе с концентрацией от 0,01 до 3 мас.% на время от 5 до 20 минут; полученный осадок промывают и помещают в раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией от 0,02 до 0,5 мас.% на время от 2 до 10 минут; полученный осадок микрокапсул промывают и помещают в питательную среду для последующего использования. Микрокапсула, полученная по способу, указанному выше, содержит островки Лангерганса и три полимерных слоя: альгинат натрия, катионный полимер поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид), альгинат натрия. Использование группы изобретений обеспечивает получение микрокапсул, обладающих высокой биосовместимостью, обеспечивающих сохранение жизнеспособности и функциональной активности трансплантированных ОЛ в организме реципиента на протяжении длительного времени для эффективной компенсации инсулинодефицита при СД1. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Способ приготовления микрокапсул с островками Лангерганса, характеризующийся тем, что

осуществляют смешение островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана со средней молекулярной массой 20000 Да в физиологическом растворе так, чтобы концентрация альгината натрия составила от 1 до 3 мас.%, декстрана - 15 мас.%, в 1 мл суспензии - от 5×10³ до 25×10³ островков Лангерганса;

используя полученную суспензию островков Лангерганса в качестве дисперсной фазы и водный раствор ПЭГ-8000 с концентрацией 30 мас.% в качестве непрерывной фазы, методом микрофлюидики формируют альгинатные микрокапсулы, содержащие от 1 до 5 островков Лангерганса;

помещают альгинатные микрокапсулы в водный изотонический раствор хлорида бария с образованием осадка из сшитых микрокапсул с островками Лангерганса;

промывают полученный осадок микрокапсул в физиологическом растворе и помещают его в раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида) со средневесовой молекулярной массой от 200 до 1000 кДа в физиологическом растворе с концентрацией от 0,01 до 3 мас.% на время от 5 до 20 минут;

промывают полученный осадок микрокапсул в физиологическом растворе и помещают его в раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией от 0,02 до 0,5 мас.% на время от 2 до 10 минут;

промывают полученный осадок микрокапсул в физиологическом растворе и помещают микрокапсулы в питательную среду для последующего использования.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при смешении островков Лангерганса с раствором альгината натрия и декстрана концентрация альгината натрия составляет 2 мас.%, в 1 мл суспензии - от 15×10³ до 20×10³ островков Лангерганса; формируют микрокапсулы с содержанием 3-4 островков Лангерганса, используют раствор поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорида) со средневесовой молекулярной массой от 300 до 600 кДа в физиологическом растворе с концентрацией 0,4 мас.%; устанавливают время для нахождения в растворе 10 минут; используют раствор альгината натрия в физиологическом растворе с концентрацией 0,2 мас.%; устанавливают время для нахождения в растворе 5 минут.

3. Микрокапсула, содержащая островки Лангерганса и три полимерных слоя: альгинат натрия, катионный полимер поли([2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид), альгинат натрия, полученная по способу, охарактеризованному в п.1 или 2.