СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ГИСТАМИНА В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЭНДОМЕТРИЯ МАТКИ КРЫС В ПРОЦЕССЕ ПОЛОВОГО ЦИКЛА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии.

Покровные и железистые эпителиоциты эндометрия матки содержат гистамин (Гунин А.Г. Локализация гистамина в структурах матки. // Архив АГЭ. - 1988. - №12. - С.66-68), который занимает одно из ведущих мест в регуляции процессов жизнедеятельности организма. Он является тканевым гормоном и медиатором, стимулятором и ингибитором внутриклеточного и тканевого метаболизма (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н. Гистамин в биохимии и физиологии. - М.: Наука, 1981). В последние годы существенно расширилось представление о важной роли гистамина в реализации репродуктивной функции женщин, в частности установлено его участие в регуляции процессов оплодотворения и имплантации (Циркин В.И., Хлыбова С.В. Роль гистамина в репродукции. // Вятский медицинский вестник. - 2006. - №3-4). Установлено, что гистамин участвует в стимулированной эстрогенами пролиферации эпителиоцитов эндометрия (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н., 1981; Гунин А.Г. Эстроген-индуцированный гистогенез в матке при эндокринном дисбалансе. Авторефер. дис.… д-ра мед. наук. - М., 1996). Имеются данные (Zhao X. et al. Blastocyst H(2) receptor is the target for uterine histamine in implantation in the mouse // Development. - 2000. - Vol.127, №12. - P.2643-2651), что эпителиоциты эндометрия могут быть источником гистамина. Нашими исследованиями установлено наличие этого биоамина в содержимом полости матки (Диндяев С.В., Виноградов С.Ю. Биоаминпозитивные структуры матки крыс в процессе полового цикла. // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2006. - Т.11, №3-4. - С.25-30). В связи с вышеизложенным определение уровня гистамина в эпителиальных клетках имеет важное клиническое значение.

Одним из распространенных способов гистохимического выявления гистамина является метод Кросса-Эвена-Роста с ортофталевым альдегидом (Cross S.W.D. et al. A study of the methods available for the cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phthalaldehyde or acetaldehyde // Histochem. J. - 1971. - Vol.3. - P.471-476).

Забор материала для флуоресцентно-гистохимического исследования уровня гистамина в структурах эндометрия экспериментальных животных осуществляется после их умерщвления (Гунин А.Г. Влияние эстрадиола на распределение гистамина в структурах матки крыс в норме и при экспериментальном введении гормона. // Проблемы эндокринологии. - 1991. - Т.37, №4. - С.49-51). Дальнейший процесс исследования включает следующие этапы:

1. Изготовление криостатных срезов и монтирование их на покровных стеклах.

2. Выдерживание срезов в парах ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд. Стеклянный сосуд, содержащий ортофталевый альдегид и плотно закрытый крышкой, предварительно выдерживается в термостате в течение 10 минут.

3. Помещение срезов во влажную камеру (предварительно прогретый в течение 10 минут сосуд, содержащий на дне воду) в термостате при 100°С в течение 1 минуты.

4. Высушивание срезов в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.

5. Изучение полученных препаратов под люминесцентным микроскопом. По условиям этой реакции наибольшая концентрация гистамина дает желтое свечение при длине волны 515 нм (Сергеева В.Е. Люминесцентно-гистохимические методы и флуориметрия в морфологических исследованиях. - Чебоксары, 1985. - Деп. в ВИНИТИ. - №6358-85).

Для окончательной идентификации и количественного выражения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия препарат подвергается цитоспектрофлуориметрии при помощи фотометрической люминесцентной электронной насадки ФМЭЛ-1А для определения в условных единицах регистрирующего прибора концентрации гистамина в биологических структурах. Для определения интенсивности люминесценции гистамина в исследуемых объектах по традиционной методике используется интерференционный светофильтр №7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А (максимальная длина пропускаемой волны 503±14 нм). Световой поток люминесценции от изучаемого участка поля зрения отсекается автоматически аппаратным зондом и преобразуется ФЭУ в силу тока, которая вызывает отклонение стрелки стандартного измерительного прибора, что пропорционально концентрации гистамина под зондом.

К недостаткам указанного способа определения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки можно отнести:

1) негуманность и финансовую затратность, связанные с умерщвлением животного,

2) необходимость наличия криостата.

Технический результат предлагаемого нами способа заключается в том, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища экспериментального животного, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса - 0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса - 0,72±0,12, позднего диэструса - 0,75±0,13, проэструса - 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина ниже расчетных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше - как повышенный.

Описание сущности предлагаемого способа

Каждую фазу на протяжении полового цикла в утреннее время (в 9.00) с помощью металлической петли осуществляется забор влагалищного содержимого крысы. Полученное содержимое размазывается на 2 предметных стеклах (мазок №1 и мазок №2).

Последовательность дальнейшего приготовления препаратов

1. Выдерживание мазка №1 в стеклянном сосуде с парами ортофталевого альдегида, а мазка №2 в аналогичном сосуде без ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд.

2. Помещение мазков в раздельные влажные камеры, предварительно прогретые в течение 10 минут, в термостате при 100°С в течение 1 минуты.

3. Высушивание мазков в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.

Изучение полученных препаратов осуществляется под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-2А. С помощью интерференционного светофильтра №7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А определяются средние уровни специфической люминесценции мазка №1 (величина А) и аутолюминесценции мазка №2 (величина В) в условных единицах регистрирующего прибора.

Концентрация гистамина в содержимом влагалища определяется по разнице величин А и В. Результаты представлены в таблице 1.

У этих же крыс во время эфирного наркоза извлекалась матка, из тела которой изготавливались криостатные срезы. Полученные криостатные срезы обрабатывались в соответствии с методом Кросса-Эвена-Роста. Микроспектрофлуориметрически в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия определена средняя концентрация гистамина в каждую фазу полового цикла (таблица 2).

В результате рангового корреляционного анализа Спирмена установлена высокая положительная сопряженность (R=0,829) изменений концентраций гистамина в содержимом влагалища с колебаниями концентрации этого биоамина в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия.

Ниже приводятся 2 примера определения уровня гистамина в эпителиоцитах эндометрия по результатам исследования влагалищных мазков.

Пример 1

Крыса №1

Поля зрения   ранний эструс поздний эструс метаэструс ранний диэструс поздний диэструс проэструс 1 0,40 0,35 0,70 0,75 0,80 1,10 2 0,55 0,35 0,60 0,85 0,70 0,80 3 0,45 0,40 0,65 0,75 0,65 0,80 4 0,40 0,35 0,55 0,65 0,70 0,75 5 0,55 0,30 0,60 0,60 0,60 0,85 6 0,55 0,30 0,70 0,60 0,80 0,80 7 0,55 0,25 0,65 0,80 0,80 0,80 8 0,45 0,35 0,60 0,80 0,80 0,80 9 0,60 0,30 0,75 0,60 0,60 1,00 10 0,50 0,30 0,70 0,80 0,70 0,85 Средняя концентрация   0,500±0,0671 0,325± 0,650± 0,72± 0,715± 0,855± 0,0403 0,0592 0,0923 0,0776 0,1036

Сравнение полученных результатов с данными, представленными в таблице 1, показывает их сходство, что позволяет оценивать уровень гистамина в эпителиоцитах эндометрия матки крысы №1 как соответствующий его нормальному содержанию в течение полового цикла.

Пример 2

Крыса №2

Поля зрения   ранний эструс поздний эструс метаэструс ранний диэструс поздний диэструс проэструс 1 0,60 0,50 0,90 1,05 0,95 1,10 2 0,75 0,50 0,80 0,85 1,00 1,00 3 0,65 0,60 0,85 1,00 1,00 1,20 4 0,60 0,50 0,80 0,95 0,95 1,10 5 0,55 0,30 0,60 0,60 0,60 0,85 6 0,75 0,50 0,80 0,90 1,00 1,20 7 0,75 0,65 0,75 0,80 0,80 0,90 8 0,65 0,55 0,85 0,80 0,80 1,00 9 0,60 0,50 0,90 0,90 1,00 1,00 10 0,70 0,50 0,90 1,10 1,05 1,00 Средняя концентрация   0,680±
0,064 0,530± 0,825± 0,925± 0,945± 1,050± 0,051 0,064 0,096 0,082 0,092

Результаты этого исследования показывают во все стадии полового цикла большее содержание гистамина в содержимом влагалища по сравнению с контрольными данными.

Таблица 1 Содержание гистаминов в мазках содержимого влагалища крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)   ранний эструс поздний эструс метаэструс ранний диэструс поздний диэструс проэструс Гистамин 0,507±0,069 0,341±0,036 0,683±0,080 0,722±0,121 0,749±0,130 0,865±0,114

Таблица 2 Содержание гистамина в эпителиоцитах эндометрия тела матки крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)   ранний эструс поздний эструс метаэструс ранний диэструс поздний диэструс проэструс ЭП 3,198±0,47 2,765±0,36 2,710±0,42 3,672±0,45 6,060±0,44 6,945±0,94 ЭЖ 3,348±0,48 3,058±0,33 2,945±0,41 3,769±0,92 5,963±0,60 7,616±0,77 ЭП - эпителиоциты покровные, ЭЖ - эпителиоциты железистые

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии. Для осуществления способа оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла проводят забор материала с последующим флуоресцентно-гистохимическим исследованием с использованием ортофталевого альдегида. При этом в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища крысы и сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса - 0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса - 0,72±0,12, позднего диэструса - 0,75±0,13, проэструса - 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора. При значениях содержания гистамина во влагалищном содержимом ниже контрольных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше - как повышенный. 2 табл.

Способ оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла, включающий забор материала с последующим флуоресцентно-гистохимическим исследованием с использованием ортофталевого альдегида, отличающийся тем, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища крысы, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса -0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса - 0,72±0,12, позднего диэструса - 0,75±0,13, проэструса - 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина во влагалищном содержимом ниже контрольных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше - как повышенный.