Способ получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс в нестимулированном эстральном цикле Российский патент 2025 года по МПК A61D19/00 G01N33/48 G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, в частности к биологии развития, и может быть использовано в экспериментах на лабораторных животных при изучении функций женской репродуктивной системы, процессов созревания овоцитов в составе кумулюсно-овоцитарных комплексов, оценки дробления, в экспериментах на предимплантационных эмбрионах.

В настоящее время для получения кумулюсно-овоцитарных комплексов используется гормональная стимуляция с использованием гормона сыворотки жеребой кобылы и хорионического гонадотропина человека [Zarrow M.X. Experimental Endocrinology / M.X Zarrow., J.M. Yohim, J.M. McCarthy / A source book of basic techniques. - N.Y., London, Acad. Press - 1964. - p. 326-327; Aoto T. A protocol for rat in vitro fertilization during conventional laboratory working hours / T. Aoto, R. Takahashi, M. Ueda // Transgenic Research. - Vol. 20. - №6. - 2011. - p. 1245-1251]. Данный способ успешно применяется в экспериментах на животных, но имеет недостаток, так как не позволяет оценить собственный репродуктивный потенциал самок крыс в опытах, направленных на изучение негативного влияния какого-либо фактора на репродуктивную систему лабораторных животных.

В основу изобретения положена задача, заключающаяся в необходимости получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс в эксперименте без использования гормональной стимуляции, выбирая время для экстракции на основании данных влагалищных мазков.

Указанная задача решается тем, что в данном способе предлагается выбирать время экстракции кумулюсно-овоцитарных комплексов из ампулярного отдела маточной трубы, соответствующее определенной фазе эстрального цикла лабораторного животного.

Заявляемый способ позволяет получить кумулюсно-овоцитарные комплексы самок крыс в естественном цикле без использования экзогенных гонадотропинов, которые могут оказать влияние на ход эксперимента в случае изучения воздействия экспериментальных веществ на состояние репродуктивной системы.

В практике для получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс известно использование гормона лошадиного хорионического гонадотропина в дозировке 150МЕ/кг для крыс линии Long-Evans и 300МЕ/кг для крыс линий Wistar, SD и Lewis с последующим (через 48 часов) введением хорионического гонадотропина человека в дозировке 300МЕ/кг. Однако при данном способе индукции суперовуляции получают большое количество овоцитов в составе кумулюсно-овоцитарных комплексов (до 90 от одной самки), что не соответствует адекватному уровню функционирования яичников самок крыс и искажает оценку функционального состояния женской репродуктивной системы лабораторных животных. В экспериментах с экстракцией овоцитов, при которых изучение функционирования яичников лабораторных грызунов не является приоритетной задачей, данный способ может быть использован для получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс в случаях, когда используемые линии лабораторных животных плохо реагируют на экзогенные гонадотропины.

В литературе встречаются способы получения кумулюсно-овоцитарных комплексов в нестимулированном цикле на основании анализа вагинальных мазков [Jawerbaum A. Diminished levels of prostaglandin E in type I diabetic oocyte-cumulus complexes. Influence of nitric oxide and superoxide dismutase. A. Jawerbaum, E.T. Gonzalez, C. Pustrovh, D. Sinner, C. Perotti, M.A.F. Gimeno // Reproduction, Fertility and Development. - Vol. 11. - 1999. - p. 105-110], однако нет полного описания процедуры, не указана необходимость соблюдения определенных условий в процессе извлечения кумулюсно-ооцитарных комплексов (температурный режим, среды), нет уточнения по времени получения кумулюсно-овоцитарных комплексов после взятия вагинального мазка, что является важным критерием для их успешной экстракции, так как если вовремя их не извлечь из яйцеводов, эндогенные энзимы начнут высвобождать овоциты из массы кумулюсных клеток и их визуализация будет сильно затруднена. Расположение кумулюсно-овоцитарных комплексов в органах женской половой системы крыс со временем значительно изменяется, что также может повлиять на успешное извлечение овоцитов во время эксперимента. Кроме того, временной интервал для извлечения кумулюсно-овоцитарных комплексов критичен в плане получения перезревших овоцитов. Известно, что крысиные овоциты в течение 6-12 часов после овуляции подвергаются перезреванию, что может повлиять на их морфологические критерии и оценку репродуктивного потенциала лабораторного животного. Также важно отметить, что в настоящее время, несмотря на общепринятую точку зрения, касаемую времени наступления овуляции у крыс, а именно в стадию эструс эстрального цикла, существуют альтернативные мнения, в частности Onyekachi O. и Okwukweka N.F. сообщают о том, что овуляция у крыс случается в конце стадии метаэструс [Onyekachi O. Effect of Delonix Regia (Flame tree) as biorodenticide in eliminating Wistar Albino rats / O. Onyekachi, N.F. Okwukweka // International Journal of Research in Agriculture, Biology and Environment . - V.2. - №1. - 2021 http://doi.org/10.47504/IJAGRI.2021.5137]. Таким образом, способ, описанный Jawerbaum A., взят за прототип и дополнен для увеличения эффективности получения кумулюсно-овоцитарных комплексов и уменьшения вероятности влияния внешних факторов на морфологию овоцитов.

Для решения задачи получения компетентных кумулюсно-овоцитарных комплексов в нестимулированном эстральном цикле были исследованы яйцеводы самок крыс линии Wistar на стадиях проэструс, начальный эструс (эстрогеновый), поздний эструс (прогестероновый) и метаэструс при различных температурных условиях. Стадии эстрального цикла определяли стандартно при помощи исследования окрашенных влагалищных мазков.

Применение способа в экспериментальной биологии и медицине позволяет стандартизировать процедуру получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс, увеличить процент успешной экстракции овоцитов и получить максимально полную картину функционирования репродуктивной системы лабораторных животных.

Способ иллюстрируется фигурами: фиг. 1 - Переход маточной трубы в рог матки крысы, где 1 - зона отсечения маточной трубы (стрелка), 2 - яичник, 3 - маточная труба, 4 - рог матки; фиг. 2 - Слизистый комок с кумулюсно-овоцитарными комплексами в ампулярной части маточной трубы крысы, где 3 - петли маточной трубы, 5 - слизистый комок с кумулюсно-овоцитарными комплексами; фиг. 3 - выделенный слизистый комок с кумулюсно-овоцитарными комплексами.

Способ получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс в нестимулированном эстральном цикле осуществляют следующим образом. Вначале производят стандартный забор влагалищных мазков лабораторных животных, используя ватные тампоны, смоченные физраствором, и обезжиренные предметные стекла. Процедуру забора мазков следует проводить в первой половине дня, но не ранее 9 часов утра. Мазки фиксируют 95% либо 100% спиртом и окрашивают красителем азур-эозином по Романовскому в течение 15-20 минут. Затем удаляют краситель, промывая стекла в двух порциях дистиллированной воды, и высушивают на воздухе.

С использованием метода световой микроскопии оценивают полученные препараты, определяя фазу позднего эструса по наличию базофильных чешуек неправильной формы, располагающихся, как правило, скоплениями и «грязному» фону мазка, говорящего о прогестероновой активности. При этом допускается наличие единичных нейтрофилов и ядросодержащих эпителиоцитов. Самок крыс на стадии эструс умерщвляют в течение 1-2 часов после забора мазков, располагают на операционном столике животом кверху. Анатомическим пинцетом захватывают по средней линии кожу живота, приподнимают, делают разрез и отсепаровывают кожу от брюшной стенки. После этого приподнимают и разрезают брюшную стенку. Сначала отделяют яйцеводы от матки, предварительно потянув рог матки для улучшения визуализации перехода между двумя органами (фиг. 1). Затем аккуратно отделяют маточную трубу от яичника и помещают ее в теплый физиологический раствор при температуре 37°С. Необходимо поддерживать постоянную температуру 37-38°С при работе с яйцеводами и кумулюсно-овоцитарными комплексами во избежание спонтанной активации и дробления овоцитов, для этого используют мобильный аппарат для подогрева пробирок типа Эппендорф. Далее, под бинокулярной лупой, с использованием подогреваемого столика, препаровальными иглами вскрывают расширенный ампулярный отдел яйцевода и выделяют из него слизистый комок (фиг. 2), в котором находятся кумулюсно-овоцитарные комплексы (фиг. 3). Необходимо исследовать обе маточные трубы, поскольку овуляция у крыс в каждый эстральный цикл происходит в обоих яичниках. Далее полученные кумулюсно-овоцитарные комплексы переносят в чашку Петри со свежей изотонической средой, покрытой слоем парафинового масла. При этом для освобождения овоцитов от кумулюсных клеток и слизи используют стандартные растворы гиалуронидазы.

Механизм действия: у крыс овуляция происходит каждые 4-5 дней в фазу эструс эстрального цикла в обоих яичниках, через 14-16 часов после пика лютеинизирующего гормона, наступающего в фазу проэструс. Кумулюсно-овоцитарные комплексы оказываются в ампулярной части маточной трубы к концу фазы эструс, в так называемый поздний прогестероновый эструс.

Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что нет необходимости использовать гормональную стимуляцию для определения оптимального времени экстракции кумулюсно-овоцитарных комплексов. По фазе эстрального цикла, определяемого стандартным методом окраски влагалищных мазков, можно определить оптимальное время для получения овоцитов лабораторных животных. От способа получения кумулюсно-овоцитарных комплексов в нестимулированном цикле, встречающемся в литературных источниках, предлагаемый способ отличается четко установленным временем экстракции комплексов из яйцеводов, регламентированными условиями проведения процедуры экстракции, что увеличивает эффективность получения кумулюсно-овоцитарных комплексов.

Таким образом, способ получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс в нестимулированном эстральном цикле позволяет получать женские половые клетки лабораторных грызунов без использования экзогенных гормонов, что может быть важно при исследовании влияния различных факторов на функционирование женской репродуктивной системы лабораторных животных, а также при использовании линий лабораторных животных, плохо реагирующих на экзогенные гонадотропины.

Изобретение применяется в экспериментальной медицине, в частности в биологии развития, при изучении функционирования женской репродуктивной системы лабораторных животных, процессов созревания овоцитов, оценки дробления, в экспериментах на предимплантационных эмбрионах.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к репродуктологии, акушерству. В первой половине дня производят забор влагалищных мазков для определения фазы эстрального цикла. Самок крыс на стадии позднего эструса умерщвляют в течение 1-2 часов после забора мазков, вскрывают и, отделив яйцеводы от яичника и рога матки, помещают каждую маточную трубу в физиологический раствор t 37°С. На подогреваемом столике t 37-38°С вскрывают расширенный ампулярный отдел яйцевода, извлекая из него слизистый комок, содержащий кумулюсно-овоцитарные комплексы. Способ позволяет получить кумулюсно-овоцитарные комплексы самок крыс в естественном цикле без использования экзогенных гонадотропинов, позволяет стандартизировать процедуру получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс, увеличить процент успешной экстракции овоцитов и получить максимально полную картину функционирования репродуктивной системы лабораторных животных. 3 ил.

Способ получения кумулюсно-овоцитарных комплексов самок крыс в нестимулированном эстральном цикле, включающий применение метода анализа влагалищных мазков, забор слизистого комка из ампулярной части обеих маточных труб экспериментальных животных, отличающийся тем, что в первой половине дня с 9:00 до 12:00 производят забор влагалищных мазков для определения фазы эстрального цикла под световым микроскопом, самок крыс на стадии позднего эструса умерщвляют в течение 1-2 часов после забора мазков, вскрывают и, отделив яйцеводы от яичника и рога матки, помещают каждую маточную трубу в физиологический раствор t 37°С; на подогреваемом столике t 37-38°С под бинокулярной лупой препаровальными иглами вскрывают расширенный ампулярный отдел яйцевода, извлекая из него слизистый комок, содержащий кумулюсно-овоцитарные комплексы.