СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОГО ХОНДРОТРАНСПЛАНТАТА Российский патент 2010 года по МПК A61L27/38 

Описание патента на изобретение RU2392973C2

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для коррекции дистрофических и травматических изменений хрящевой ткани, а также для коррекции процессов роста при идиопатическом сколиозе на ранних стадиях развития патологии.

Известны способы получения трехмерного хондротрансплантата на основе синтетического коллагена с микропорами (Guoping Chen, Takashi Sato, Takashi Ushido et. al. Tissiue engineering of cartilage using a hybrid scaffold of synthetic polymer end collagen. // Tissue Engineering. 2004. Vol.10. N.3. P.323-330). Культивировали артикулярные хондроциты взрослых бычков в альгинатном геле до начала синтеза протеогликанов, затем помещали на пористую мембрану, содержащую протеогликаны. Хондроциты сохраняли свой фенотип и синтезировали коллаген II типа и матрикс.

Трехмерный трансплантат получали из хондроцитов носовой перегородки молодых бычков (Koichi Masuda, Robert L., San Michael J., et. al. A novel tow-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocyte (ABC-method) // J. of Orthopeadic Research. 2003. Vol.21. N.1. P.139-148). Хондроциты извлекали из носовой перегородки молодых бычков, культивировали до получения монослоя, затем помещали на подложку из биодеградирующего материала - олигополиэтиленгликоля, на которой формировался хондротрансплантат.

Хондроциты суставного хряща человека культивировали в виде суспензии и затем помещали в круговой биореактор, в котором клетки подвергались вращению в течение 12 недель (Marlovits S., Tichy В., Truppe М., et. al. Collagen expression in tissue engineered cartilage of aged human articular chondrocytes in a rotating bioreactor. // Jnt. J. Artif. Organ. 2003. Apr., Vol.26. N.4. P.319-330). Клетки спонтанно агрегировались и формировали экстрацеллюлярный матрикс.

Основными недостатками данных методов получения хондротрансплантата являются: использование высокодифференцированных хондробластов артикулярного хряща, чьи потенции пролиферации и формирования матрикса ограничены, что может привести к апоптозу хондроцитов и несовместимости трансплантата; применение матриц - носителей, представляющих собой слабо резорбируемые материалы, являющиеся инородными телами, препятствующими адаптации и метаболической кооперации трансплантируемых и материнских хондробластов.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения хрящевых трансплантатов из хондроцитов лошади без применения матриц-носителей (Ponomarev I., Nilke J. Verfahren zur herstellung deidimensionaler tragrfreier gewebestrukturen und naeh diesen verfahren herges tellte gewebestrukturen. // Deutschen Patent und Markenamtes. Patent N. 2004001225. 2004). Биотрасплантаты хряща из коленных суставов лошади извлекаются в стерильных условиях и помещаются в пробирки с 0.9% NaCl. В условиях ламинарного шкафа двукратно промытый в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера биоптат измельчается скальпелем на кусочки размером 1×1 мм2, которые затем переносятся в пробирку объемом 50 мл со средой DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) с добавлением 10% телячьей сыворотки, антибиотиков, а также коллагеназы (240 ед.актив./ мл Fa. Worthington, NJ) и гиалуронидазой (600 ед.актив./мл, Sigma). Пробирки с пробами помещаются в термостат и инкубируются в течение ночи при 37°С. На следующий день полученная из биоптата суспензия процеживается через стерильное сито (размер пор 70 мкм) и центрифугируется 10 мин при 4000 оборотах в мин. Осадок ресуспензируется в PBS, и проводится подсчет витальных хондроцитов. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью красителя в счетной камере Горяева. Культивирование хондроцитов проводится в инкубаторе при 37°С, 90% влажности и 5% СО2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде DMEM, с добавлением 10% FBS, гентамицина 1 г/л и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты. Смена среды проводится каждые 3 дня. По достижении оптимальной концентрации (60 млн) производится пассирование с использованием 0.25% раствора трипсин-ЭДТА, клетки центрифугируются при 4000 оборотах в мин в течение 10 минут, в результате чего образуется плотный агрегат, который помещается в 6-луночную планшетку в среду DMEM с добавление 20% FBS. В условиях термостата агрегат подвергается мануальной механической стимуляции при помощи стеклянной палочки путем давления. В зависимости от размера агрегата частота механический стимуляции варьируется от ежедневной до 1-2 раз в неделю. Интенсивность «давления» на агрегат контролируется визуально.

Основными недостатками данного метода являются: использование высокодифференцированных хондроцитов артикулярного хряща, у которых потенции пролиферации и дифференцировки и последующего формирования матрикса ограничены; механическое воздействие скорее усиливает процесс диффузии к хондроцитам, чем стимулирует синтетические процессы; кроме того, метод может быть применен только для лечения патологий суставов лошадей.

Задача изобретения - разработать способ получения хондротрансплантата, обладающего способностью к органоспецифической хондрогенной дифференцировке.

Поставленная задача решается за счет того, что культивируют низкодифференцированные хондроциты позвоночника новорожденных мини-свиней в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл; центрифугируют при 2 тыс об/мин, полученный клеточный агрегат культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS без мануальной механической стимуляции.

Техническим результатом использования способа получения хондротрансплантата для коррекции процессов роста и дегенеративно-деструктивных изменений хрящевой ткани является предотвращение прогрессирования деформации позвоночника на ранних стадиях процесса; предупреждение развития остеоартроза и остехондроза; сокращение послеоперационного периода, резкое сокращение количества послеоперационных койко-дней и исключение многоэтапных, дорогостоящих операций на позвоночнике и суставах. Замещение дефекта хрящевой ткани органспецифическим трансплантатом позволит купировать развитие остеоартроза, асимметрию роста и остеохондроза на ранних стадиях патологии, что улучшит качество жизни больного.

Технический результат достигается за счет того, что используют пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней, которые содержат низкодифференцированные хондробласты с высокой потенцией к органоспецифической дифференцировке; подбирают время инкубирования и концентрацию антибиотика так, чтобы сохранить жизнеспособность выделяемых клеток; используют среду, которая содержит оптимальное количество метаболитов для поддержания жизнеспособности выделяемых клеток; подбирают условия центрифугирования, способствующие максимальному сохранению жизнеспособности выделяемых клеток.

Способ осуществляется следующим образом. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм2, которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 часов, объем раствора превышает в 10 раз объем обрабатываемой ткани. Далее, суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, производят подсчет витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева. Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°С, при 90% влажности и 5% СО2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среда сменяется через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации (50-60 млн) производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее, клетки центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель. Смену среды осуществляют 2 раза в неделю, с интервалом 2-3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3.

Пример конкретного выполнения способа получения трехмерного хондротрансплантата. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков из всего позвоночника 7-дневных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм2, которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 часов. Если объем выделенной ткани составляет 5 мл, приливают 50 мл реакционной смеси. Далее, суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, выделяют 2 млн витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева. Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°С, при 90% влажности и 5% СО2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среду сменяют через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации в 50 млн производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее, клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 5 недель. Смену среды осуществляют с интервалом в 3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3.

На чертежах представлено:

Фиг.1 трехмерный хондротрансплантат. Гематоксилин-эозин. 20×40.

Фиг.2 трехмерный хондротрансплантат. Альциановый синий. 20×40.

Фиг.3 трехмерный хондротрансплантат. Иммунохимическая реакция на коллаген 2 типа. 10×20.

Фиг.4. Экспрессия гена агрекана хондроцитами трехмерного хондротрансплантата. Результат мультиплексной ПЦР с праймерами для гена GAPDH (нижняя полоса) и гена агрекана (верхняя полоса). 1 - маркер; 2, 3, 4, - хондроциты трехмерного трансплантата.

Фиг 5. Комплекс Гольджи с развитым ламеллярным и вакуолярным компонентами хондроцитах трехмерного хондротрансплантата; х17000

Полученный трехмерный хондротрансплантат представлен клетками, имеющими фенотип хондроцитов и межклеточным матриксом (Фиг.1) Тканеспецифичность полученного хондротрансплантата характеризует синтез коллагена II типа, сульфатированных гликозаминогликанов, экспрессию гена агрекана и ультраструктурную организацию полученных хондроцитов. Исследование тканеспецифичности трансплантата проводили следующими методиками:

1) окрашивания клеток гистологического среза трехмерного трансплантата альциановым синим (Фиг.2),

2) исследованием типа синтезируемого коллагена - иммуногистохимическая реакция с антителами на коллаген II типа (Фиг.3),

3) исследованием экспрессии гена агрекана хондроцитов трехмерного хондротрансплантата (Фиг.4),

4) методом ультраструктурного анализа (Фиг.5).

Похожие патенты RU2392973C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОГО ОСТЕОТРАНСПЛАНТАТА 2014
  • Зайдман Алла Михайловна
  • Корель Анастасия Викторовна
  • Щелкунова Елена Геннадьевна
  • Иванова Нина Александровна
RU2574942C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДОНОРСКИХ ХОНДРОБЛАСТОВ 2004
  • Корель Анастасия Викторовна
  • Зайдман Алла Михайловна
  • Колокольцева Тамара Дмитриевна
RU2285039C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДОНОРСКИХ ХОНДРОЦИТОВ 2009
  • Миронов Сергей Павлович
  • Омельяненко Николай Петрович
  • Ильина Валентина Клементьевна
  • Карпов Игорь Николаевич
  • Советников Николай Николаевич
RU2409662C2
Способ выделения хондроцитов 2017
  • Воропаева Анастасия Александровна
  • Щелкунова Елена Игоревна
RU2677688C1
БИОТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2005
  • Гольдштейн Дмитрий Вадимович
  • Макаров Андрей Витальевич
  • Волков Алексей Вадимович
  • Фатхудинов Тимур Хайсамудинович
  • Ржанинова Алла Анатольевна
  • Шаменков Дмитрий Алексеевич
  • Горностаева Светлана Николаевна
  • Пулин Андрей Алексеевич
  • Бажанов Николай Александрович
  • Арутюнян Ирина Владимировна
  • Бочков Николай Павлович
RU2301677C1
КУЛЬТУРА ГЕНЕТИЧЕСКИ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ХОНДРОПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ 2003
  • Гольдштейн Д.В.
  • Репин В.С.
  • Сабурина И.Н.
  • Ржанинова А.А.
  • Шаменков Д.А.
  • Макаров А.В.
  • Бажанов Н.А.
  • Пулин А.А.
  • Фатхудинов Т.Х.
RU2242980C1
БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СУСТАВНОГО ХРЯЩА 2003
  • Гольдштейн Д.В.
  • Репин В.С.
  • Сабурина И.Н.
  • Ржанинова А.А.
  • Шаменков Д.А.
  • Макаров А.В.
  • Бажанов Н.А.
  • Пулин А.А.
  • Фатхудинов Т.Х.
RU2242981C1
БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ (ВАРИАНТЫ) 2004
  • Гольдштейн Дмитрий Вадимович
  • Макаров Андрей Витальевич
  • Фатхудинов Тимур Хайсамудинович
  • Репин Вадим Сергеевич
  • Шаменков Дмитрий Алексеевич
  • Ржанинова Алла Анатольевна
  • Сабурина Ирина Николаевна
  • Пулин Андрей Алексеевич
  • Утяшев Игорь Аглямович
  • Бажанов Николай Александрович
RU2272638C1
Способ создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа 2020
  • Скуратовская Дарья Александровна
  • Шуплецова Валерия Владимировна
  • Хазиахматова Ольга Геннадьевна
  • Шебанов Никита Владимирович
  • Литвинова Лариса Сергеевна
RU2765913C1
Способ культивирования биомассы миобластов, полученных из мышц стерляди 2022
  • Ризванов Альберт Анатольевич
  • Закирова Елена Юрьевна
  • Аймалетдинов Александр Маазович
  • Маланьева Альбина Геннадьевна
RU2794773C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 392 973 C2

Реферат патента 2010 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОГО ХОНДРОТРАНСПЛАНТАТА

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для коррекции дистрофических и травматических изменений хрящевой ткани, а также для коррекции процессов роста при идиопатическом сколиозе на ранних стадиях развития патологии. Способ характеризуется тем, что пластинки роста новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут, затем пластинки роста промывают, измельчают, переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют, суспензию центрифугируют при 2000 об/мин 10 минут, изолированные хондробласты культивируют по достижению концентрации 50-60 млн, проводят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут, затем клеточный агрегат перемещают в планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3. Изобретение обеспечивает предотвращение прогрессирования деформации позвоночника на ранних стадиях процесса, предупреждение развития остеоартроза и остехондроза, сокращение послеоперационного периода, резкое сокращение количества послеоперационных койко-дней и исключение многоэтапных, дорогостоящих операций на позвоночнике и суставах. 5 ил.

Формула изобретения RU 2 392 973 C2

Способ получения трехмерного хондротрансплантата путем культивирования хондроцитов в питательной среде, отличающийся тем, что пластинки роста новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 мин, затем пластинки роста промывают, измельчают, переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1,5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 ч, суспензию центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин, изолированные хондробласты культивируют при 37°С, при 90% влажности и 5% СO2 в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл, по достижению концентрации 50-60 млн проводят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин, затем клеточный агрегат перемещают в планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2392973C2

DE 102004001225 B8 27.07.2006
ИМПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОСТНОЙ И/ИЛИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2005
  • Назаренко Григорий Федорович
  • Земчихина Валентина Николаевна
RU2295980C1
US 2006088506 A1, 27.04.2006
WO 03084385 A2, 16.10.2003
JP 2002291461 A, 08.10.2002.

RU 2 392 973 C2

Авторы

Зайдман Алла Михайловна

Ким Ирина Иннокентьевна

Садовой Михаил Анатольевич

Даты

2010-06-27Публикация

2008-01-28Подача