СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДОНОРСКИХ ХОНДРОЦИТОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N5/00 C12N5/77 

Изобретение относится к клеточной биологии, а именно к технологии выделения, культивирования и стимулирования синтетической активности клеток хондроцитов in vitro с возможностью в дальнейшем использования их при лечении с применением клеточных технологий.

Остеоартроз посттравматический или идиопатический характеризуется нарушением функции суставов, болями, ограничением подвижности, деформацией. Методы лечения остеоартроза достаточно многочисленны и включают применение системных и внутрисуставных лекарств (гормональных, негормональных, хондропротекторы), ортезы, хирургические вмешательства на суставных хрящах и субхондральных костях, включая имплантаты из металла, полимеров, керамики, углеродных волокон, коллагена, а также комбинированные методы с использованием тканевой инженерии, клеточных технологий [1]. Тем не менее, все существующие в настоящее время методы лечения травматических повреждений суставного хряща и их последствий, а также остеоартроза не являются достаточно эффективными как в Российской Федерации, так и за рубежом.

Существующие способы и методики лечения поврежденного суставного хряща достаточно эффективны фактически только при травматическом характере повреждения и молодом возрасте пациента.

Наиболее патогномоничным и безопасным способом стимуляции репаративного хондрогенеза является трансплантация аутогенных хондроцитов или аллогенных хондроцитов. При этом наряду со сложностями в процессе культивирования и выбора адекватной (местному микроокружению) системы доставки клеток сохраняется проблема естественного снижения репаративного и пролиферативного потенциала, а также синтетической активности этих клеток.

Данная проблема заключается в ослаблении с течением времени продуктивного потенциала хрящевых клеток на фоне такого хронического дегенеративно-дистрофического поражения суставного хряща, субхондральной кости и других тканевых компонентов сустава, как посттравматический или идиопатический остеоартроз. Снижение потенций к восстановлению хрящевого матрикса наблюдается не только in vivo, но и in vitro при культивировании хондроцитов и характеризуется уменьшением количества новообразованных клеток в клонируемой популяции и низкой синтетической активности (по сравнению с культурой хондроцитов от организма без дегенеративно-дистрофических проявлений).

С целью стимуляции хондроцитов к выработке внеклеточного матрикса, или точнее его составляющих, применяют различные препараты, такие как, например, хондроитин сульфат и гликозамина сульфат. Имеются данные о способности хондроитина сульфата подавлять образование супероксидных радикалов и синтез оксида азота. Другой механизм, который потенциально может лежать в основе его структурно-модифицирующего действия, связан с подавлением катаболических (цитокинзависимое разрушение хряща, инактивация матриксных металлопротеиназ) и стимуляцией анаболических (синтез протеогликана) процессов в хряще и в хондроцитах [3]. In vitro показано, что гликозамина сульфат, добавленный к культуре хондроцитов, стимулирует синтез протеогликанов [4]. В экспериментальных работах in vitro [2] показано стимулирующее влияние на пролиферацию и диффренцировку мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга пониженных концентраций кислорода в среде, стимуляция минерализации [5] и стимуляция протеогликанов путем блокады синтетическими пептидами (syntetic link peptide) катаболического действия на хондроциты интерлейкина-1 (IL-1).

Кроме того, известны активные соединения для стимуляции костеобразования или замедления костной резорбции, среди которых можно указать семейство полифосфатных соединений (пат. ЕР 210728), оксазолидиноны тиоамида (з-ка США 2002/0010341), амино-бис-фосфонатные соединения (пат. з-ка США 2001/0046977) или изофлавоновые соединения (пат. з-ка США 2002/0035074), гесперридин (пат. РФ 2320346).

Однако действие этих препаратов на синтетическую активность выражена не в той степени, которая необходима для регенерации крупных дефектов хряща. Кроме того, так как такие средства, стимулирующие рост костей, синтезируются локально - в/на костной ткани - такие вещества трудно вводить. Обычно следует разрабатывать капсулы, которые помогают пройти веществу через желудочно-кишечный тракт без разрушения под влиянием неблагоприятных условий окружающей среды, существующих в нем. И такой способ введения также имеет некоторые недостатки, т.к. вещество должно пройти печень и транспортироваться жидкостями организма, прежде чем оно достигнет кости.

Наиболее выраженным стимулирующим действием на клетки и клеточную популяцию, в т.ч. и на хондроциты, обладают некоторые известные факторы роста - TGF-β, IGF, a-FGF, b-FGF, PDGF, IFR-I, IFR-II и т.п. Однако спектр изменений в организме при использовании этих факторов достаточно широк и затрагивает не только процессы стимуляции конкретных клеток, но и ангиогенез, дифференцировку клеток и дедифференцировку, не вызывая при этом заметного повышения продуктивного потенциала клеток [6]. Основной недостаток описанных способов - невозможность целенаправленного управления хондрогенезом, применение их также не безопасно из-за не достаточной изученности комплекса изменений, возникающих при воздействии ростовых факторов на организм в целом. Таким образом, задача увеличения синтетической активности клеток при культивировании хондроцитов путем модификации сред остается нерешенной.

В настоящее время практически всеми исследовательскими и коммерческими лабораториями для культивирования клеток (в т.ч. и хондроцитов) используются стандартные среды DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose), EpiLife medium, EDGF (EpiLife-Defined Growth Supplement), CCM (Complete culture medium) с различными добавками стимулирующих агентов, по мнению авторов, способными решить проблемы дифференцировки и быстрого наращивания популяций клеток.

Так, например, существуют комбинации:

- DMEM с пенициллином, стрептомицином сульфатом, амфотерицином;

- DMEM с FBS (fetal bovine serum), пенициллином, стрептомицином и глутамином;

- EpiLife medium с EDGF, эпителиальным ростовым фактором, очищенным телячим альбумином, трансферином, гидрокортизоном, рекомбинантным человеческим инсулиноподобным фактором роста-1, простагландином Е2, рекомбинантным человеческим эпидермальным фактором роста, антибиотиками, противогрибковыми препаратами и глутамином;

- DMEM с 10.0 ммоль HEPES (буфер);

- DMEM, содержащий 10 mM HEPES и HB-CMF-HBSS (1:1) (буфер);

- композиция CCM и DMEM с буферизацией HEPES и 10% FBS (fetal bovine serum), Ca2+- и Mg2+-free Hank's сбалансированный раствор, содержащий 10 mM HEPES (HB-CMF-HBSS), комбинация с DMEM (1:1);

- DMEM, содержащий 1% FCS, P/S (фосфат-содовый буфер), дексаметазон и инсулин;

- DMEM, содержащий ITS+ (insulin-transferrin-selenium), P/S, аскорбиновую кислоту, дексаметазон и TGFβ1 (ростовой фактор) и т.п.

Описанные выше модификации стандартных культуральных сред могут способствовать дифференцировке клеток и их пролиферации, особенно в случае применения факторов дифференцировки и роста клеток, однако увеличение синтетической активности клеток (при культивировании хондроцитов) авторами не отмечено. Культивирование хондроцитов для имплантации их на носителе в дефект суставного хряща имеет своей конечной целью восстановление поврежденного участка хрящевой ткани, т.е. продукцию клетками хрящевого матрикса. Этого возможно добиться только путем увеличения синтеза клетками основного вещества хряща-матрикса, а не простым увеличением количества хондроцитов.

Ауто- или аллогенные хондроциты, являясь зрелыми дифференцированными клетками хрящевой ткани, обладают ограниченной пролиферативной активностью, что не позволяет получать эти клетки в достаточном количестве с сохранением фенотипа.

Известные способы получения хондропрогениторных клеток человека из фетальной хрящевой ткани, полученной на разных сроках гестации, включают в себя последовательную механическую и ферментативную дезагрегацию исходной хрящевой ткани с использованием различных ферментных растворов и их комбинации (коллагеназа, проназа, гиалуронидаза и др.) в различных концентрациях. В зависимости от способов дезагрегации можно выделить различное количество клеток с необходимым фенотипом.

Известен способ получения культуры генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека, характеризующийся тем, что хрящевую ткань эмбриона человека отмывают, механически измельчают, далее подвергают ферментативной дезагрегации путем одномоментного инкубирования в растворе коллагеназы II типа и проназы Е, затем полученную суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×10⁶ кл/мл и культивируют в селективной культуральной среде, содержащей ростовые среды DMEM +F12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, ростовые добавки и факторы роста, и при достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование (пат. РФ 2242980). В качестве ростовых факторов используют 5-20 нг/мл bFGF (basic Fibroblast Growth Factor TGF_β1 (Transforming Growth Factor_β1), а в качестве ростовых добавок - 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит), 50 мкг/мл аскарбиновой кислоты. Клетки культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри. Осуществляют пассирование клеток не более 2 раз при достижении культуры конфлюэнтного состояния. Культивируют в течение 18-25 дней при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂.

Основными недостатками данного метода культивирования являются использование сложной питательной среды и возможность использования только эмбриональных хондроцитов.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения донорских хондроцитов (или постнатальных хондробластов) путем выделения и измельчения хрящевой ткани, проведения ферментативной обработки, фильтрации и центрифугирования полученной суспензии и культивирования их в питательной среде DMEM с добавлением 20% FBS (fetal bovine serum) (пат РФ 2285039). Для выделения хондроцитов используют пластинки роста тел позвонков мини-свиней в возрасте до 4-х месяцев.

Общим недостатком перечисленных выше способов культивирования клеток хондроцитов является низкая синтетическая активность клеток в популяции.

Целью и задачей предлагаемого способа является устранение этого недостатка, а именно воздействие на культивируемые хондроциты in vitro препаратом, способным к значительной степени увеличивать синтетическую активность клеток в популяции, существенно не изменяя при этом другие параметры клеток, такие как фенотип, пролиферацию, способность к колониеобразованию.

Поставленная цель достигается за счет использования способа получения донорских хондроцитов путем выделения и измельчения хрящевой ткани донора, проведения ферментативной обработки, фильтрации и центрифугирования полученной суспензии хондроцитов и культивирования их в питательной среде DMEM с добавлением 20% FBS, отличающегося тем, культивирование осуществляют при добавлении перфторана в количестве 15-25% от общего объема питательной среды.

Из субстанций и веществ, известных давно и синтезированных в последнее время, наибольший интерес представляет перфторан, являющийся также практически единственным синтетическим кровезаменителем и хорошо изученным по комплексному воздействию на человеческий организм. Перфторан представляет собой перфторуглеродную эмульсию для инфузий, выпускаемую по ФСП 42-0086-3311-02. Перфторан имеет высокую калиброванность - с узким распределением частиц при среднем размере в диапазоне 0.065-0.07 мкм. Перфторан - кровезаменитель с газотранспортной функцией, обладающий гемодинамическими, реологическими, мембраностабилизирующими, кардиопротекторными, диуретическими и сорбционными свойствами. Предназначен для возмещения острой и хронической гиповолемии при травматическом, геморрагическом, ожоговом и инфекционно-токсическом шоке, черепно-мозговой травме, операционной и послеоперационной гиповолемии; для лечения нарушений микроциркуляции и периферического кровообращения (изменении тканевого метаболизма и газообмена, гнойно-септическом состоянии, инфекции, нарушении мозгового кровообращения, жировой эмболии); а также применяется при регионарной перфузии, лаваже легких, для промывания гнойных ран брюшной и других полостей; для противоишемической защиты донорских органов (предварительная подготовка донора и реципиента). Препарат разрешен для клинического использования на территории РФ (Лицензия №64/396/97 от 21.04.97; Приказ МЗ РФ №50 от 13.06.96).

Применение перфторана как стимулятора синтетической активности клеточной культуры хондроцитов было подтверждено экспериментальными исследованиями in vitro.

Использование заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ферментативный способ выделения клеток хондроцитов из гиалинового хряща и культивирование монослойной культуры хондроцитов.

Операционным (или пункционным) путем производится забор кусочка хряща (2-3 мм) экспериментального животного (овцы) или во время плановой операции на суставной поверхности у человека. Кусочек хряща измельчается в стерильных условиях в ламинаре, далее кусочки инкубируются в 1,5% растворе коллагеназы II типа 4-6 часов в термостате при температуре +37°. Раствор коллагеназы с высвободившимися клетками фильтруется через капроновый фильтр, центрифугируется, клеточный осадок эксплантируется с плотностью 1×10⁶ клеток в культуральный флакон с ростовой средой ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Каждые 5-7 дней культивирования производится смена среды. Через 7-10 дней в первичной культуре образуется плотный монослой хондроцитов. Далее культура рассевается (пассируется) в 2 культуральных флакона в отношении 1:1 или во флакон большего размера и так далее до наращивания необходимого количества клеток.

Пример 2. Культивирование клеток с добавлением перфторана.

Культивируемые клетки, полученные по примеру 1, - пассируемая монослойная культура хондроцитов в культуральных плоскодонных флаконах в среде ДМЕМ с 20% FBS активировали Перфтораном. Перфторан добавляли в культуру в количестве 20% к объему питательной среды. Перфторан вводили в серии клеточных культур в различные сроки культивирования: 1) одновременно с эксплантацией клеток; 2) через два часа после эксплантации, когда клетки уже адгезировались к поверхности пластика культурального флакона; 3) через 24 часа, когда клетки начали пролиферативной рост; 4) через 6 суток, когда культура достигла конфлюэнтного роста. Во всех случаях перфторан приводит к повышению синтетической активности хондроцитов, выражающейся в стойком увеличении количества гексуроновых кислот.

Для количественной оценки синтеза кислых гликозаминогликанов в культуре определяли концентрацию гексуроновых кислот «карбазоловой реакцией» по методу Bitter Т., Muir Н.М., 1962, описанному в кн.: Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани, издательство «Медицина» Ленинградское отделение, 1969, с.120-121.

Аналогично были проведены опыты с добавлением перфторана 15% и 25%. Результаты эксперимента приведены в таблице 1 и на фиг.1 и 2.

Предложенный способ был испытан в условиях лаборатории соединительной ткани с группой клинической генетики и отделения экспериментальной травматологии и ортопедии ФГУ «ЦИТО им. Н.Н.Приорова Росмедтехнологий» на культурах клеток хондроцитов, выделенных из хряща овец в нескольких сериях с контрольными группами без добавления перфторана к питательной среде и с добавлением перфторана.

Таким образом, результаты исследований доказывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать синтез компонентов экстрацеллюлярного матрикса в культивируемых in vitro хондроцитах, что в значительной степени увеличивает продуктивный потенциал клеток в популяции, существенно не изменяя при этом другие параметры клеток, такие как фенотип, пролиферацию, способность к колониеобразованию, не является трудоемким и не требует больших временных затрат.

Литература

1. Тепляшин А.С., Чупикова Н.И., Шарифуллина С.В., Коржикова С.В., Ростовская М.С., Васюнина Н.Ю., Савченкова И.П. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки человека - перспективный материал для моделирования остео- и хондрогенеза in vitro. Москва, 14-17 марта 2006 г. 4-ая международная специализированная выставка 'МИР БИОТЕХНОЛОГИИ' 2006".

2. Анохина Е.Б. Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва - 2007.

3. Насонов Е.Л. Современные направления фармакотерапии остеоартроза. Consilium Medicum 2001; 3 (9).

4. Чичасова Н.В. Место медленнодействующих препаратов в рациональной терапии деформирующего остеоартроза. Consilium Medicum 2005; 7 (8): 634-8.

5. Brian R. Genge, Licia N.Y. Wu, and Roy E. Wuthier. In Vitro Modeling of Matrix Vesicle Nucleation. Synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. ВIO. CHEMISTRY VOL. 282, NO. 36, pp.26035-26045, Sep.7, 2007.

6. Демопулос Г.А. (US), Палмер П.П. (US), Херц Д.М. (US). Патент. Растворы и способы ингибирования боли, воспаления и разрушения хряща. Номер и дата международной или региональной заявки: US 00/19864 (21.07.2000). Номер и дата международной или региональной публикации: WO 01/07067 (01.02.2001).

7. Dean MF, Lee YW, Dastjerdi AM, Lees P. The effect of link peptide on proteoglycan synthesis in equine articular cartilage. Biochim Biophys Acta. 2003 Aug 22; 1622(3): 161-8.

Таблица №№ проб Описание образцов клеточных культур Количество перфторана в питательной среде, % Гексуроновые кислоты, мг/мл 1 Аутогенные хондроциты
Контроль - 1,28 2 Аллогенные хондроциты
Контроль - 1,31 3 Аутогенные хондроциты с добавлением перфторана 20 2,03 4 Аутогенные хондроциты с добавлением перфторана 15 1,91 5 Аутогенные хондроциты с добавлением перфторана 25 1,89 6 Аллогенные хондроциты с добавлением перфторана 15 1,99 7 Аллогенные хондроциты с добавлением перфторана 25 1,95

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к технологии выделения, культивирования и стимулирования синтетической активности клеток хондроцитов in vitro, и может быть использовано при лечении с применением клеточных технологий. Донорские хондроциты получают путем выделения и измельчения хрящевой ткани донора, проведения ферментативной обработки, фильтрации и центрифугирования полученной суспензии хондроцитов и культивирования их в питательной среде DMEM с добавлением 20% FBS и перфторана в количестве 15-25% от общего объема питательной среды. Изобретение позволяет увеличивать синтетическую активность хондроцитов в популяции in vitro, существенно не изменяя при этом другие параметры клеток, такие как фенотип, пролиферацию, способность к колониеобразованию. 2 ил., 1 табл.

Способ получения донорских хондроцитов путем выделения и измельчения хрящевой ткани донора, проведения ферментативной обработки, фильтрации и центрифугирования полученной суспензии хондроцитов и культивирования их в питательной среде DMEM с добавлением 20% FBS, отличающийся тем, культивирование осуществляют при добавлении перфторана в количестве 15-25% от общего объема питательной среды.