СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕГЕНЕРАЦИИ ЯЗВЫ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ Российский патент 2010 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть применено для оценки регенерации язвенного дефекта.

Известен способ оценки регенерации поперечно-полосатой мышечной ткани, согласно которому при физиологической дистрофии в мышечной ткани происходит процесс физиологической регенерации - восстановление мышечных волокон. Данный способ принят за аналог (В.Г.Елисеев. Учение о тканях. В кн.: Гистология (В.Г.Елисеев, ред.). М., 1963).

Известен способ оценки регенерации язвенного дефекта, принятый за прототип, согласно которому при наличии в периульцерозной зоне малодифференцированных клеток, способных к митотическому делению, делают вывод о физиологической регенерации (В.Г.Елисеев. Учение о тканях. В кн.: Гистология (В.Г.Елисеев, ред.). М., 1963). Однако известный способ не обладает достаточной точностью.

Целью настоящего изобретения является повышение точности оценки регенерации язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.

Технический результат достигается тем, что в качестве показателя стадии регенераторного процесса используют функциональную способность фибробластов и тучных клеток, причем в случае фибробластов с развитой системой гранулярной эндоплазматической сети и тучных клеток с формирующимися специфическими гранулами оценивают начальную стадию регенерации; при наличии редукции гранулярной эндоплазматической сети в фибробластах и дегрануляции тучных клеток констатируют завершающую стадию регенерации - образование рубца.

При этом грануляционная ткань в первой стадии рыхлая, со множеством сосудов и межклеточного вещества с отдельными малодифференцированными тучными клетками и клетками фибробластического ряда; во второй стадии грануляционная ткань уплотняется, появляется большое количество коллагеновых волокон при уменьшении межклеточного вещества с большим количеством тучных клеток и фибробластов; на третьей стадии регенерационного процесса грануляционная ткань плотная, рубцующаяся.

Способ осуществляют следующим образом.

При поступлении больной предъявляет жалобы на боли в эпигастральной области, связанные как с приемом пищи, так и возникающие в голодном состоянии. Отмечается ощущение тяжести в эпигастральной области, изжога, вздутие живота, ощущение раннего наполнения желудка, диспепсия.

При гастродуоденоскопии выявляют в желудке или луковице двенадцатиперстной кишки дефект слизистой оболочки щелевидной, звездчатой, округлой или овальной формы, окруженный высоким воспалительным валом. Края дефекта отечны, гиперемированы. Дно язвы выполнено грануляциями.

Проводят биопсию края язвенного дефекта. Готовят полутонкие срезы с последующей электронной микроскопией. При электронно-микроскопическом исследовании обнаружено, что на первой стадии регенераторного процесса юная тучная клетка проникает из сосудистого русла в околососудистое пространство. При этом тучная клетка находится в так называемой транспортной форме: она крупная, с большим округлым ядром и маленьким ободком цитоплазмы. По мере выхода из кровеносной системы тучные клетки начинают специфически дифференцироваться, и в их цитоплазме образуются единичные специфические гранулы. Выходу тучной клетки из сосудистого русла способствуют биологически активные вещества - гистамин, серотонин, которые увеличивают проницаемость сосудистой стенки за счет увеличения промежутков между эндотелиальными клетками сосудистого русла, что увеличивает проникновение тучных клеток из сосудистого русла в ткани и способствует двустороннему движению жидкостей из сосудистого русла в ткани и обратно. При этом дно язвы выполнено рыхлой грануляционной тканью, содержащей множество кровеносных сосудов; в межклеточном веществе обнаруживаются фибробласты, секретирующие гликозаминогликаны, коллагеновые белки; здесь же встречаются тучные и иммунокомпетентные клетки, несущие на себе CD-рецепторы, отражающие начальную стадию дифференцировки этих клеток. В случае фибробластов с развитой системой гранулярной эндоплазматической сети и тучных клеток с формирующимися специфическими гранулами оценивают начальную стадию регенерации.

Следующей стадией регенерации является появление тучных клеток, в цитоплазме обнаруживается множество специфических гранул. Данные гранулы обладают метахромазией за счет содержащегося в них гепарина при окраске толуидиновым синим. Внутренняя структура гранул может быть представлена мембранными структурами, образующими концентрические окружности; внутренняя структура гранул может быть аналогичной рисунку отпечатков пальцев; некоторые гранулы заполнены неравномерным по плотности веществом; отдельные гранулы заполнены мембранными структурами, расположенными в разных плоскостях, что на срезе создает структуру вида «еловой веточки». Во второй стадии регенерации цитоплазма тучной клетки нагружена большим количеством описанных гранул. Грануляционная ткань в этот период уплотнена, с большим количеством коллагеновых волокон. При наличии редукции гранулярной эндоплазматической сети в фибробластах и дегрануляции тучных клеток констатируют завершающую стадию регенерации - образование рубца.

В отличие от описанных стадий регенераторного процесса электронно-микроскопическое исследование края длительно нерубцующейся язвы представлено следующими морфологическими признаками.

У больного с хронической длительно нерубцующейся язвой желудка в собственной пластинке слизистой оболочки вблизи язвенного дефекта, а также вне его выявлены существенные изменения фибробластов. В крае язвы большинство клеток фибробластического ряда характеризовались резким увеличением размеров, округлением формы и потерей отростков. Электронно-микроскопически: на поверхности фибробластов образовывались бухтообразные углубления, ядра имели неправильную форму и неравномерно агрегированный хроматин.

Основная особенность этих клеток состояла в гипертрофии и гиперплазии гранулярной эндоплазматической сети, расширенные канальцы которой заполняли практически всю цитоплазму. Из этих канальцев часто возникали цистерноподобные образования, достигающие в диаметре нескольких микрометров. Мембрана расширенных участков эндоплазматической сети была фрагментирована и в значительной степени дегранулирована. Т.е. в ней уменьшалось количество прикрепленных рибосом. Содержимое канальцев даже в пределах одной клетки часто различалось по плотности и структуре. Это - электроннопрозрачное, рыхлое хлопьевидное или реже плотное гомогенное вещество иногда с кристаллической структурой. Единичные встречавшиеся в этих клетках митохондрии имели небольшие размеры, редкие короткие кристы и светлый электроннопрозрачный матрикс. Во многих клетках эндоплазматическая сеть была соединена с наружной ядерной мембраной и являлась продолжением расширенного перинуклеарного пространства, что свидетельствует о нарушении формообразовательных процессов, т.е. о глубоких дефектах клеточной дифференцировки.

Для большинства измененных фибробластов характерна деструкция плазматической мембраны. Этот процесс иногда отмечался в небольших участках, однако чаще плазмалемма была разрушена на большом протяжении или почти отсутствовала. В непосредственном контакте с разрушающимися фибробластами находились либо малодифференцированные лимфоциты, содержащие небольшое количество органоидов в узком ободке цитоплазмы, либо более дифференцированные, имеющие хорошо развитую эндоплазматическую сеть митохондрии, пластинчатый комплекс Гольджи, микротрубочки.

Взаимодействие лимфоцитов с фибробластами структурно выражалось соприкосновением больших участков их поверхностей или небольшими выростами плазмолеммы лимфоцита, направленными к ровной поверхности фибробласта. При этом плазматическая мембрана последнего не выявлялась, а у лимфоцита она четко контурировалась на всем протяжении. Вблизи разрушающихся фибробластов располагались также большие гранулярные лимфоциты, однако контакты этих двух типов клеток не выявлены.

В результате деструкции фибробластов образовывались обширные поля клеточных органоидов, состоящие, в основном, из расширенных канальцев гранулярной эндоплазматической сети, профили которой имели округлую форму и разные размеры. Их мембрана в одних случаях выявлялась четко, в других - была размыта, прерывиста или отсутствовала на значительном протяжении. В результате содержимое канальцев широко сообщалось с внеклеточным матриксом и было представлено не только хлопьевидными массами, как во многих клетках, но также фибриллярными структурами, ширина которых сопоставима с шириной обычных коллагеновых фибрилл. На мембране большинства внеклеточно расположенных канальцев сохранилось некоторое количество прикрепленных рибосом. Отдельные рибосомы, неодинаковые по плотности, находились вблизи мембраны. Среди фрагментов гранулярной эндоплазматической сети на разных расстояниях друг от друга располагались плотные клеточные ядра удлиненной формы. Одни из них сохраняли четкие очертания, другие их утрачивали, распадаясь на отдельные полиморфные глыбчатые фрагменты. Среди внеклеточно расположенных органоидов и в непосредственном контакте с фрагментами эндоплазматической сети находились лимфоциты. В участке соприкосновения с лимфоцитом мембрана эндоплазматической сети была лишена рибосом и часто разрушена. Плазмолемма лимфоцита также была повреждена - утрачивала четкость очертаний или разрушалась.

Профили расширенной ЭС (эндоплазматической сети) с дегрануляцией мембраны и свободные рибосомы вблизи этих структурных комплексов обнаруживались у некоторых больных в просвете кровеносных сосудов. Они имели, вероятнее всего, фибробластическое происхождение, т.к. резко измененная ЭС выявлялась только в фибробластах, и часто ее фрагменты располагались вблизи сосудов. Однако нельзя исключить их эндотелиальную природу, поскольку отдельные расширенные канальцы ЭС встречались в активированных эндотелиоцитах кровеносных сосудов.

Как в крае язвы, так и особенно в околоязвенной области среди измененных и разрушенных клеток располагались фибриллярные структуры. Они широко варьировали по ширине, плотности, взаиморасположению. Обычно сохранные фибриллы были немногочисленны. Поперечная исчерченность их, как правило, была нечеткой или отсутствовала. Часто они выглядели набухшими, утратившими ровные очертания. Во всех изученных нами случаях преобладали фибриллы с диаметром 10-20 нм. Они образовывали пучки, идущие в разных направлениях, или переплетались в виде сетевидных или войлокоподобных структур. Последние часто располагались вокруг миофибробластов, в значительном количестве выявлявшихся около язвы. Скопления волокон чередовались с участками, содержащими преимущественно гликозоаминогликаны, которые выявлялись реакцией с рутениевым красным в виде плотных мелких глыбок или тончайших нитей, образующих рыхлую сеть.

Среди фибробластов с нормальным строением, встречавшихся вблизи язвы в небольшом количестве, выявлены такие, которые содержали лизосомы с резко положительной реакцией на кислую фосфатазу, т.е. возникала разновидность клеток фибробластического ряда - фиброкласты. Эти клетки способствуют деградации измененных коллагеновых структур с помощью содержащихся в них гидролаз.

Синтез коллагена фибробластов весьма чувствителен к уровню кислорода в окружающей среде. При хронических вялотекущих процессах, когда напряжение кислорода в ткани снижено, блокируется этап гидроксилирования проколлагена. Это приводит к накоплению в клетке промежуточных продуктов биосинтеза. Переполнение ими канальцев ЭС свидетельствует о замедлении или прекращении секреторного процесса. Дефекты секреции объясняются синтезом аномальных белков и/или образованием в просвете ЭС нерастворимых белковых комплексов. Выявленная неоднородность содержимого ЭС фибробластов свидетельствует о разновременности нарушений метаболических процессов не только в разных клетках, но и в пределах каждой из них. Вблизи поврежденных фибробластов часто располагались лимфоциты. Это могли быть естественные клетки-киллеры, а также активированные формы Т-лимфоцитов. При тесном контакте лимфоцитов с максимально измененными фибробластами наблюдалось разрушение плазматической мембраны последних. Однако выявленный цитотоксический эффект не всегда обусловлен непосредственным действием иммунокомпетентных клеток, но может быть связан с наличием цитотоксических антител к измененному коллагену.

В условиях патологии группа молекул коллагена и даже отдельные молекулы могут приобретать антигенные свойства. Изменения, наблюдаемые на электронограммах, свидетельствуют о том, что антигенной детерминантой могли быть необычные белковые конгломераты, заполняющие эндоплазматическую сеть фибробластов. По мере нарастания изменений эти клетки приобретают свойства аутоантигенов, чем и обусловлена реакция иммунной системы. В пользу коллагеновой природы антигена может свидетельствовать реакция лимфоцитов на фрагменты расширенных и заполненных секретом канальцев ЭС, оказавшихся в межклеточном пространстве в результате разрушения фибробластов. Незавершенный синтез коллагенового белка в измененных фибробластах, своеобразный метаболизм его в ткани при разрушении клеток, а также деструкция фибриллярных структур и дегрануляция молекул коллагена.

Таковы данные о состоянии ультраструктуры фибробластов, расположенных непосредственно вблизи язвы.

Способ далее подтверждают примеры его реализации.

Пример 1.

Больной З-ский, 47 лет, при поступлении отмечается тяжесть в эпигастральной области, слабость, головокружение, чувство быстрого насыщения, болевой синдром. При осмотре выявляют бледность кожных покровов. При пальпации - болезненность в эпигастральной области.

При гастродуоденоскопии - отмечается язвенный дефект антрального отдела желудка овальной формы площадью 2,5 см² с подрытыми краями, дно выполнено молодой грануляционной тканью. Во время проведения гастродуоденоскопии проводят биопсию периульцерозной зоны.

Ткань для электронно-микроскопического исследования фиксировали в 2% глютаровом альдегиде на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2), постфиксировали в 1% четырехокиси осмия, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в аралдит. Ориентировку в ткани проводили на полутонких одномикронных срезах, окрашенных 0,1% метиленовым синим. Ультратонкие срезы после двойного контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе JEM 1200ЕХ и фотографировали при увеличении от 5000 до 50000.

При электронно-микроскопическом исследовании обнаружены юные тучные клетки, проникающие из сосудистого русла в околососудистое пространство. При этом тучная клетка крупная, с большим округлым ядром и маленьким ободком цитоплазмы. На последовательных серийных срезах обнаружен выход из кровеносной системы тучных клеток, которые начинают дифференцироваться, и в их цитоплазме образуются единичные специфические гранулы. Наблюдается увеличение промежутков между эндотелиальными клетками сосудистого русла, что способствует проникновению тучных клеток из сосудистого русла в ткань. При этом дно язвы выполнено рыхлой грануляционной тканью, содержащей множество кровеносных сосудов; в межклеточном веществе обнаруживаются фибробласты, секретирующие гликозаминогликаны, коллагеновые белки; здесь же встречаются тучные и иммунокомпетентные клетки, несущие на себе CD-рецепторы. Обнаружение фибробластов с развитой системой гранулярной эндоплазматической сети и тучных клеток с формирующимися специфическими гранулами позволяет оценить начальную стадию регенерации. Последующее катамнестическое наблюдение и морфологическое исследование подтвердило начальную стадию регенераторного процесса.

Пример 2.

Больная К-ва, 56 лет, поступила с диагнозом - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. При поступлении неинтенсивные боли в эпигастральной области, изредка возникающая тошнота, слабость, снижение работоспособности. При осмотре выявляют бледность кожных покровов и видимых слизистых оболочек, пульс слабого наполнения и напряжения. При пальпаторном исследовании - болезненность в эпигастральной области.

При гастродуоденоскопии отмечается язвенный дефект округлой формы в луковице двенадцатиперстной кишки площадью 4,0 см². Дно язвы выполнено грануляциями.

Проводят биопсию края язвенного дефекта. Готовят полутонкие срезы с последующей электронной микроскопией. При электронно-микроскопическом исследовании в тканях обнаружены тучные клетки, в цитоплазме которых содержится множество гранул, содержащих гепарин, гистамин и серотонин. Данные гранулы обладают метахромазией при окраске толуидиновым синим. Внутренняя структура гранул в тучных клетках соседних полей зрения представлена мембранными структурами, образующими концентрические окружности; внутренняя структура гранул может быть аналогичной рисунку отпечатков пальцев; некоторые гранулы заполнены неравномерным по плотности веществом; отдельные гранулы заполнены мембранными структурами, расположенными в разных плоскостях, что на срезе создает структуру вида «еловой веточки». При окраске гематоксилином и эозином грануляционная ткань уплотнена, содержит большое количество коллагеновых волокон.

Сделан вывод о наличии второй стадии регенерации язвенного дефекта. Клиническое течение заболевание у данной больной подтвердило наличие второй стадии регенераторного процесса у данной больной.

Пример 3.

Больной Ю-н, 67 лет, поступил с жалобами на тяжесть в эпигастральной области, чувство быстрого насыщения.

При гастродуоденоскопии отмечается рубцующаяся язва субкардиального отдела желудка площадью 3 см².

При поступлении больной предъявляет жалобы на боли в эпигастральной области, связанные как с приемом пищи, так и возникающие в голодном состоянии. Отмечается ощущение тяжести в эпигастральной области, изжога, вздутие живота, ощущение раннего наполнения желудка, диспепсия.

Выявляют в желудке или луковице двенадцатиперстной кишки дефект слизистой оболочки щелевидной формы, окруженный высоким воспалительным валом. На полутонких срезах при электронно-микроскопическом исследовании обнаружена редукция гранулярной эндоплазматической сети в фибробластах и дегрануляция тучных клеток. Констатируют завершающую стадию регенерации - рубец. Края дефекта отечны, гиперемированы. Дно язвы выполнено грануляциями.

Проводят биопсию края язвенного дефекта. Готовят полутонкие срезы с последующей электронной микроскопией. При электронно-микроскопическом исследовании обнаружено постепенное рубцевание грануляционной ткани. Количество межклеточного вещества снижено, количество коллагеновых структур с коллагеном I, III типа повышено. Образуется нежная рубцовая ткань. Тучные клетки выделяют специфические гранулы путем мерокриновой секреции в окружающее пространство. При этом в околоклеточном пространстве наблюдаются отдельные секреторные гранулы, в цитоплазме тучных клеток в примембранной зоне обнаруживаются вакуоли, заполненные оптически прозрачным содержимым.

Сделан вывод о заключительной стадии рубцевания грануляционной ткани, что подтверждено дальнейшим катамнестическим исследованием.

Проведено электронно-микроскопическое исследование периульцерозной зоны 56 больных язвой желудка. Исследование подтвердило повышение точности оценки регенераторного процесса по состоянию тучных клеток: от юных тучных клеток округлой формы с крупным ядром, малым ободком цитоплазмы и единичными (одна-две) гранулами в первой стадии до дифференцированной тучной клетки с большим количеством секреторных гранул в большом объеме цитоплазмы во второй стадии регенерации и дегрануляции тучных клеток с образованием оптически прозрачных вакуолей и появлением секреторных гранул в околоклеточном пространстве. При этом грануляционная ткань в первой стадии рыхлая, со множеством сосудов и межклеточного вещества с отдельными малодифференцированными тучными клетками и клетками фибробластического ряда; во второй стадии грануляционная ткань уплотняется, появляется большое количество коллагеновых волокон при уменьшении межклеточного вещества с большим количеством тучных клеток и фибробластов; на третьей стадии регенерационного процесса грануляционная ткань плотная, рубцующаяся.

Катамнестическое наблюдение подтвердило эффективность заявляемого способа лечения.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии. Для оценки регенерации язвы желудка и двенадцатиперстной кишки проводят морфологическое исследование. Начальную стадию регенерации определяют в случае одновременного присутствия в периульцерозной зоне фибробластов с развитой системой гранулярной эндоплазматической сети и тучных клеток с формирующимися специфическими гранулами. Завершающую стадию регенерации с образованием рубца определяют при наличии редукции гранулярной эндоплазматической сети в фибробластах и дегрануляции тучных клеток. Способ повышает точность оценки регенерации язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.

Способ оценки регенерации язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, включающий морфологическое исследование, отличающийся тем, что в случае одновременного присутствия в периульцерозной зоне фибробластов с развитой системой гранулярной эндоплазматической сети и тучных клеток с формирующимися специфическими гранулами оценивают регенерацию как начальную; при наличии редукции гранулярной эндоплазматической сети в фибробластах и дегрануляции тучных клеток оценивают стадию регенерации как завершающую с образованием рубца.