СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ФИКСАЦИИ ПЕЧЕНИ У НАРКОТИЗИРОВАННОГО ЖИВОТНОГО Российский патент 2006 года по МПК G01N1/28 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и может быть применено при прижизненной фиксации печени у наркотизированного животного.

Известен способ фиксации препаратов тканей в слабощелочном буферном веронал-ацетатном растворе четырехокиси осмия, принятый за аналог (1).

Известен способ фиксирования биоптатов с помощью раствора двухромовокислого калия, четырехокиси осмия и хлористого натрия - прототип (2).

Однако известный способ-прототип сложен в применении при приготовлении препаратов in situ и имеет ограниченную точность вследствие недостаточно высокой контрастности изображения.

Целью изобретения является повышение контрастности изображения при приготовлении препаратов in situ.

Технический результат достигается тем, что проводят перфузию глютаральдегид формальдегидным фиксатором через портальную вену и инкубацией средой, содержащей 0,2% дигитонина в растворе Фликингера рН 7,2 при 20-22°С с последующим после инкубации измельчением ткани печени, помещением в 0,2% дигитонина на 4-10 ч с последующим отмыванием 0,1 M какодилатным буфером и постфиксацией четырехокисью осмия в виде 1% раствора, на какодилатном буфере в течение 2 ч, обезвоживанием и заключением в аралдит с последующим контрастированием уранилацетатом и цитратом свинца.

Способ осуществляется следующим образом.

Белым крысам-самцам массой 180-220 г ежедневно в течение 45-90 суток внутрижелудочно вводят этиловый спирт в дозе 2-2,5 г/кг массы. Далее перфузировали и фиксировали печень через портальную вену in situ. Животным под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость и производили перфузию через портальную вену. Для поддержания необходимого давления в системе применяли перфузионные установки, а показателем достаточности перфузии являлась светло-желтая равномерная окраска всех долей печени. Префиксацию проводили в течение 5 мин 4% глютаральдегидформальдегидным фиксатором, приготовленным на буфере Хенкса, рН 7,2, при температуре 20°С (70-150 мл раствора, что составляло 5-7 мл /мин / 100 г ). После префиксации печени в течение 5 мин перфузировали инкубационной средой ( 50-70 мл), содержащей 0,2% дигитонин в растворе Фликингера pH 7,2 20-22°С. После инкубации ткань печени, измельченную до 1-1,2 мм³, помещали в свежую порцию 0,2% дигитонина на 4-10 ч при 4°С. Далее образцы отмывали 0,1 М какодилатным буфером pH 7,2 и постфиксировали 1% OsO₄ на какодилатном буфере в течение 2 ч. Обезвоживание и заключение в аралдит проводили по следующей схеме: 30-70° этиловый спирт по 5 мин, 96° этиловый спирт (три смены по 5 мин), пропитка аралдитом М (3 смены по 5 мин), пропитка рабочей смесью (аралдит М: аралдит Н - 1:1) с 2% катализатором на 2 ч при комнатной температуре. На заключительном этапе фрагменты печени помещали в свежую порцию рабочей смеси на 2 ч при 37°С, после чего заключали в аралдит и выдерживали в течение 2 сут при 60°С. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JRM-1200EX (инструментальное увеличение 5000-50000).

У контрольных животных липидные включения обнаруживают в виде небольших капель, состоящих из триглицеридов, которые встречались в отдельных гепатоцитах. Холестерин в виде единичных завитков, цилиндров и слоистых образований располагался в диалоплазме, вблизи органоидов, липидных капель и, очень редко, в межклеточных щелях.

Алкогольная нагрузка приводит к выраженным изменениям печени. Через сутки после введения животным алкоголя в гепатоцитах наблюдали увеличение количества липидов, в том числе, холестерина. Триглицериды чаще располагались у синусоидного полюса в виде капель различной величины. При контакте их с митохондриями и гранулярной эндоплазматической сетью мембраны последних были часто разрушены. Холестерин локализовался вблизи ядра и по периферии клетки. Он мог быть не связан с клеточными органоидами, а располагаться свободно в гиалоплазме в виде небольших скоплений в форме завитков и цилиндров, а также слоистых образований с плотной или рыхлой упаковкой составляющих их элементов. Иногда слоистые образования встречались внутри гранулярной эндоплазматической сети, при этом мембраны таких канальцев в значительной степени были разрушены. Обращает на себя внимание незначительное количество холестерина, расположенное по периферии отдельных липидных капель. Помимо внутриклеточного накопления, холестерин откладывался и во внеклеточном пространстве. Через 7-14 суток алкоголизации количество липидов в гепатоцитах возрастало. Скопление холестерина в гиалоплазме встречалось чаще и в основном в виде завитков и цилиндров. При расположении холестерина в тесной связи с митохондриями мембраны последних оказывались разрушенными. Отложение холестерина обнаруживалось также по периферии и внутри липидных капель в виде завитков и цилиндров. Внеклеточно холестерин откладывался в межклеточных щелях. При этом участки разрушенных плазматических мембран имели большую протяженность. Наибольшее количество холестерина обнаруживалось в местах перехода межклеточных щелей в пространство Диссе. Вблизи этих участков располагались единичные пучки коллагеновых фибрилл.

Через 1-1,5 мес в гепатоцитах липидные капли располагались группами. Холестерин значительно чаще имел вид слоистых телец с рыхлой упаковкой элементов вблизи билиарного полюса и у межклеточных щелей. Иногда слоистые тельца, но с плотной упаковкой встречались внутри митохондрий и в канальцах гранулярной эндоплазматической сети. Неклеточное отложение холестерина в виде слоистых образований или завитков и цилиндров сопровождалось расширением межклеточных щелей и разрушением плазматических мембран соседних клеток на значительном протяжении. В пространстве Диссе вблизи отложений холестерина располагались мощные пучки коллагеновых фибрилл (вероятно это морфологическая основа последующего фиброза печени).

При хронической алкогольной интоксикации (45-90 дней) соединительнотканный комплекс, отграничивающий желчный капилляр от межклеточных щелей, не содержал полного набора структур, входящего в него в норме. Зона слипания выявлялась редко, а десмосомы встречались только у одного полюса и имели нарушенную структуру с плохо выраженным подмембранным слоем. При разрушении соединительного комплекса возникало прямое сообщение желчных капилляров с межклеточной щелью и пространством Диссе. Десмосомы в составе соединительного комплекса практически не выявлялись, особенно к 90-м суткам после создания модели, тогда как плотное соединение занимало небольшие участки и не претерпевало существенных изменений. Проведение реакции на щелочную фосфатазу выявило неравномерное распределение фермента в мембранах желчного капилляра. Активность его определялась и в области соединительного комплекса. Повреждение межклеточных контактов в печени при хронической алкогольной интоксикации выражается нарушением их структуры и часто сопровождается дистрофическим процессом в гепатоцитах. Отмечена глубокая деструкции органоидов, в том числе фибриллярных структур, имеющих отношение к межклеточным соединениям. Это приводит к разобщению клеток с образованием широких межклеточных щелей. Особенно большое значение имеет деструкция соединительного комплекса желчных капилляров, поскольку этот процесс связан с нарушением его барьерной функции и с выходом желчи в межклеточные щели и пространство Диссе.

Обнаруженные морфологические изменения свидетельствуют о точном воспроизведении жировой дистрофии печени при прижизненной фиксации органа у наркотизированного животного.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Крысе-самцу массой 180 г ежедневно в течение 45 суток внутрижелудочно вводят этиловый спирт в дозе 2 г/кг массы. Далее перфузировали и фиксировали печень через портальную вену in situ, затем под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость и производили перфузию через портальную вену. Для поддержания необходимого давления в системе применяли перфузионные установки, а показателем достаточности перфузии являлась светло-желтая равномерная окраска всех долей печени. Префиксацию проводили в течение 5 мин 4% глютаральдегидформальдегидным фиксатором, приготовленным на буфере Хенкса, рН 7,2, при температуре 20°С (70 мл раствора, что составляло 5 мл/мин/ 100 г). После префиксации печени в течение 5 мин перфузировали инкубационной средой (50 мл), содержащей 0,2% дигитонин в растворе Фликингера pH 7,2 20°С. После инкубации ткань печени, измельченную до 1 мм³, помещали в свежую порцию 0,2% дигитонина на 4 ч при 4°С. Далее образец отмывали 0,1 М какодилатным буфером pH 7,2 и постфиксировали 1% OsO₄ на какодилатном буфере в течение 2 ч. Обезвоживание и заключение в аралдит проводили по следующей схеме: 30° этиловый спирт по 5 мин, 96° этиловый спирт (три смены по 5 мин), пропитка аралдитом М (3 смены по 5 мин), пропитка рабочей смесью (аралдит М: апалдит Н-1:1) с 2% катализатором на 2 ч при комнатной температуре. На заключительном этапе фрагменты печени помещали в свежую порцию рабочей смеси на 2 ч при 37°С, после чего заключали в аралдит и выдерживали в течение 2 сут при 60°С. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-1200EX (инструментальное увеличение 5000-50000).

Алкогольная нагрузка приводит к выраженным изменениям печени. Через 1,5 мес в гепатоцитах липидные капли располагались группами. Холестерин значительно чаще имел вид слоистых телец с рыхлой упаковкой элементов вблизи билиарного полюса и у межклеточных щелей. Неклеточное отложение холестерина в виде слоистых образований или завитков и цилиндров сопровождалось расширением межклеточных щелей и разрушением плазматических мембран соседних клеток на значительном протяжении. В пространстве Диссе вблизи отложений холестерина располагались мощные пучки коллагеновых фибрилл. Соединительнотканный комплекс, отграничивающий желчный капилляр от межклеточных щелей, не содержал полного набора структур, входящего в него в норме. Он представлен в основном плотным соединением, занимающим небольшие участки. Зона слипания выявлялась редко, а десмосомы встречались только у одного полюса и имели нарушенную структуру с плохо выраженным подмембранным слоем. При разрушении соединительного комплекса возникало прямое сообщение желчных капилляров с межклеточной щелью и пространством Диссе.

Обнаруженные морфологические изменения свидетельствуют о точном воспроизведении жировой дистрофии печени, доказанном электронно микроскопически, при прижизненной фиксации органа у наркотизированного животного.

Пример 2.

Белая крыса весом 200 г ежедневно в течение 60 суток внутрижелудочно получала этиловый спирт в дозе 2,3 г/кг массы. Перфузию и фиксацию печени осуществляли через портальную вену. Префиксацию проводили в течение 5 мин 4% глютаральдегид формальдегидным фиксатором, приготовленным на буфере Хенкса, рН 7,2, при температуре 20°С (120 мл раствора). После префиксации печени в течение 5 мин перфузировали инкубационной средой (60 мл), содержащей 0,2% дигитонин в растворе Фликингера рН 7,2 21°С. После инкубации ткань печени, измельченную до 1,1 мм³, помещали в свежую порцию 0,2% дигитонина на 7 ч при 4°С. Далее образец отмывали 0,1 М какодилатным буфером рН 7,2 и постфиксировали 1% OsO₄ на какодилатном буфере в течение 2 ч. Проводили образец через 50° этиловый спирт по 5 мин, 96° этиловый спирт (три смены по 5 мин), пропитывали аралдитом М (3 смены по 5 мин), пропитывали рабочей смесью (аралдит М: апалдит Н - 1:1) с 2% катализатором на 2 ч при комнатной температуре. На заключительном этапе фрагмент печени помещали в свежую порцию рабочей смеси на 2 ч при 37°С, после чего заключали в аралдит и выдерживали в течение 2 сут при 60°С. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-1200EX (инструментальное увеличение 5000-50000).

На 60-ые сутки соединительнотканный комплекс не содержал полного набора структур, входящего в него в норме. Он был представлен в основном плотным соединением, занимающим небольшие участки. Десмосомы встречались только у одного полюса и имели нарушенную структуру с плохо выраженным подмембранным слоем. При разрушении соединительного комплекса возникало прямое сообщение желчных капилляров с межклеточной щелью и пространством Диссе.

Проведение реакции на щелочную фосфатазу выявило неравномерное распределение фермента в мембранах желчного капилляра. Активность его определялась и в области соединительного комплекса. Повреждение межклеточных контактов в печени при хронической алкогольной интоксикации выражалось нарушением их структуры и сопровождалось дистрофическим процессом в гепатоцитах. Отмечена глубокая деструкция органоидов, в том числе фибриллярных структур, имеющих отношение к межклеточным соединениям. Это приводит к разобщению клеток с образованием широких межклеточных щелей. Особенно большое значение имеет деструкция соединительного комплекса желчных капилляров, поскольку этот процесс связан с нарушением его барьерной функции и с выходом желчи в межклеточные щели и пространство Диссе.

Гистологические и электронно-микроскопические изменения подтвердили повышение точности моделирования жировой дистрофии печени при прижизненной фиксации органа у наркотизированного животного.

Пример 3.

Крысе весом 220 г ежедневно в течение 90 суток внутрижелудочно вводили этиловый спирт в дозе 2,5 г/кг массы. Далее перфузировали и фиксировали печень через портальную вену, для чего под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость и производили перфузию. Префиксацию проводили в течение 5 мин 4% глютаральдегид-формальдегидным фиксатором, приготовленным на буфере Хенкса, рН 7,2, при температуре 20°С (150 мл раствора). После префиксации печени в течение 5 мин перфузировали инкубационной средой (70 мл), содержащей 0,2% дигитонин в растворе Фликингера, рН 7,2, 22°С. После инкубации ткань печени, измельченную до 1,2 мм³, помещали в свежую порцию 0,2% дигитонина на 10 ч при 4°С. Далее образец отмывали 0,1 M какодилатным буфером, рН 7,2 и постфиксировали 1% OSO₄ на какодилатном буфере в течение 2 ч. Обезвоживание и заключение в аралдит проводили по следующей схеме: 70° этиловый спирт по 5 мин, 96° этиловый спирт (три смены по 5 мин), пропитка аралдитом М (3 смены по 5 мин), пропитка рабочей смесью (аралдит М: апалдит Н - 1:1) с 2% катализатором на 2 ч при комнатной температуре. На заключительном этапе фрагмент печени помещали в свежую порцию рабочей смеси на 2 ч при 37°С, после чего заключали в аралдит и выдерживали в течение 2 сут при 60°С. Изготавливали ультратонкие срезы.

Через 90 дней животное забивали и осуществляли электронно-микроскопическое исследование биоптата. Показано, что соединительнотканный комплекс, отграничивающий желчный капилляр от межклеточных щелей, не содержал полного набора структур, входящего в него в норме. Десмосомы встречались только у одного полюса и имели нарушенную структуру с плохо выраженным подмембранным слоем. Разрушение соединительного комплекса приводило к прямому сообщению желчных капилляров с межклеточной щелью и пространством Диссе. Десмосомы в составе соединительного комплекса не выявлены.

Проведение реакции на щелочную фосфатазу выявило неравномерное распределение фермента в мембранах желчного капилляра. Активность его определялась и в области соединительного комплекса. Повреждение межклеточных контактов в печени при хронической алкогольной интоксикации выражается нарушением их структуры и часто сопровождается дистрофическим процессом в гепатоцитах. Отмечена глубокая деструкция органоидов, в том числе фибриллярных структур, имеющих отношение к межклеточным соединениям. Обнаружена деструкция соединительного комплекса желчных капилляров.

Обнаруженные морфологические изменения свидетельствуют о повышении точности воспроизведения жировой дистрофии печени при прижизненной фиксации органа у наркотизированного животного.

Модель жировой дистрофии печени создана на 15 крысах. Точность воспроизведения жировой дистрофии печени подтверждена данными гистологических и электронно-микроскопических исследований.

Источники информации

1. Аничков Н.Н., Холатов Ф.С. Неврогенный атеросклероз и липидоз аорты. - В кн. С.В. Андреев (ред.). Моделирование заболеваний. М.: Медицина, 1972, 336 с.

2. БМЭ под ред. Б.В. Петровского. М.: Медицина, 1977, т.5, с.332.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается приготовления препаратов печени для гистологического исследования. В ходе эксперимента по индуцированию патологии печени животным под наркозом производят перфузию глютаральдегид формальдегидным фиксатором через портальную вену. Затем проводят перфузию инкубационной средой, содержащей 0,2% дигитонина в растворе Фликингера, рН 7,2, при 20-22°С. После инкубации ткань печени измельчают и помещают в 0,2% дигитонин на 4-10 ч, а затем образцы отмывают 0,1 М какодилатным буфером и постфиксируют 1% раствором на какодилатном буфере в течение 2 ч. Далее проводят обезвоживание и заключение в аралдит с последующим контрастированием уранилацетатом и цитратом свинца. Способ позволяет повысить контрастность изображения, в частности за счет фиксации ткани печени in situ и оптимального подбора инкубационной среды.

Способ прижизненной фиксации печени у наркотизированного животного с использованием четырехокиси осмия, отличающийся тем, что проводят перфузию глютаральдегидформальдегидным фиксатором через портальную вену и инкубацией средой, содержащей 0,2% дигитонина в растворе Фликингера рН 7,2 при 20-22°С с последующим после инкубации измельчением ткани печени, помещением в 0,2% дигитонина на 4-10 ч с последующим отмыванием 0,1 М какодилатным буфером и постфиксацией четырехокисью осмия в виде 1% раствора на какодилатном буфере в течение 2 ч, обезвоживанием и заключением в аралдит с последующим контрастированием уранилацетатом и цитратом свинца.