СПОСОБ ЗАЩИТЫ МАТЕРИАЛОВ ОТ МИКРОБНОГО РАЗРУШЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК A01P1/00 A01N27/00 

Изобретение относится к способам подавления роста микроорганизмов и может быть использовано для защиты органических и неорганических материалов от биоповреждений, а также в медицине, ветеринарии, микробиологической и медицинской промышленности.

Известен способ защиты материалов, например смазочно-охлаждающей жидкости на водной или неводной основе, когда в нее вводят композицию соединений, подавляющих рост анаэробов, которая содержит α-три-1-(п-нитрофенол)-2-аминопропандиол-1,3 и органический сульфонат (Патент ГДР № 266240, кл. C10M 141/08, 1987).

Недостатком указанного способа является применение антимикробных композиций, подавляющих только микроорганизмы одного типа, например анаэробы, и не активных против других организмов, например аэробов, а также ингибирование развития только вегетативных клеток, но не покоящихся форм, таких как споры.

Известен способ защиты материалов, например технического масла, от воздействия микромицетов, предусматривающий введение в техническое масло эфирного масла цитраль (3,7-диметилоктадиен-2,6-аль-1) в количестве 0,5-1,0% (RU 2074250, 27.02.1992).

Известен способ борьбы с бактериями и загрязняющими (контаминирующими) организмами, включающий нанесение на указанные бактерии и загрязняющие организмы или места их обитания эффективного количества антибактериального активного ингредиента, соответствующего формуле (а):

где n=1 или 2; R¹ - водород; R представляет (а) фенил; фенил, замещенный 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из галогена, С_1-12-алкила, тригалометила, С_1-5-алкокси, С_1-4-алкилкарбонил или нитро; тиенил, когда n≠2, фуранил; или R представляет собой радикал формулы (b):

где X - кислород иди сера, Y - азот или СН; R'' - водород или С_1-4алкил (RU 2143805, 10.01.2000).

Недостатком указанного способа является то, что биоциды указанной формулы, применяемые для защиты материалов, обладают токсическим действием и являются экологически опасными веществами.

Известно также использование антимикробных белков и пептидов для защиты объектов от микробного разрушения. Например, известно применение белкового компонента, выделенного из растительного хроматина после разложения последнего, в качестве антимикробного агента. Указанный белковый компонент имеет кажущуюся молекулярную массу в интервале от 10 до 20 кДа (RU 2303357, 27.07.2007). Однако данное вещество может быть разрушено микроорганизмами, что сокращает срок его защитного действия.

К общему недостатку используемых способов защиты материалов от биоповреждений следует отнести развитие процесса автолиза микроорганизмов, ингибированных биоцидами, вследствие чего в среду попадают органические вещества, облегчающие последующее развитие микроорганизмов второй волны контаминации. Тем самым срок защитного действия биоцидов сокращается.

Наиболее близким к предложенному изобретению является способ защиты материалов от микробиологического и окислительного разрушения, согласно которому навеску вещества фенольного ряда вносят в защищаемый материал, при этом используют вещество общей формулы (с):

(с)

где R₁=H; НО или алкил C₂-C₂₁;

R₂=H; ОН; (СН₂)_nOH,

где n=2-6; CH₂COOR₄(R₄=Н или алкил С₁-С₂₀); алкил C₆-C₂₁ или CH₂COR₅ [R₅=CO(CH₂)_nCH₃, где n=0-19 или NH(CH₂)_nCH₃, где n=0-19]

R₃=H или алкил С₂-С₂₁,

причем R₁, R₂ и R₃ одновременно не могут быть водородами (RU 2086610, 10.08.1993).

Антимикробные вещества в известном способе обладают широким спектром действия и пролонгированным характером защиты.

Однако недостатком известного технического решения, принятого за прототип, является высокая гидрофобность большинства соединений общей формулы, что существенно ограничивает сферу их применения. Кроме того, в патенте описано применение для защиты материалов лишь ограниченного спектра экологически безопасных веществ, не приведены примеры пролонгированного антимикробного действия и предотвращения автолиза клеток ингибированных микроорганизмов.

Задачей настоящего изобретения являются расширение ассортимента экологически безопасных веществ, которые могут быть использованы для антимикробной защиты материалов разной природы и обладают пролонгированным действием, а также повышение надежности защиты.

Поставленная задача решается описываемым способом защиты материалов от микробного разрушения путем введения вещества с антимикробной активностью в защищаемый материал, при этом в качестве вещества с антимикробной активностью используют алкилоксифенильное производное метана общей формулы:

где: R₁ выбран из оксифенила или алкилоксифенила,

R₂ выбран из оксифенила или алкилоксифенила,

R₃ выбран из фенила, фурила или трихлорметила, при этом в алкилоксифениле алкил выбран из С₂-С₂₁.

Нами установлено, что указанные выше вещества обладают антимикробной активностью против вегетативных и покоящихся клеток широкого спектра микроорганизмов: бактерий, архей, грибов, дрожжей. Они предотвращают их автолиз и вторичную волну контаминации, что обеспечивает пролонгированный эффект и отсутствие привыкания. Основная биологическая активность соединений заключается в индукции перехода вегетативных клеток микроорганизмов в состояние анабиоза и поддержании этого состояния, что выражается в ингибировании прорастания покоящихся форм и роста микроорганизмов. Кроме того, заявленные производные метана являются низкотоксичными соединениями. По молекулярному механизму действия используемые производные метана являются модификаторами мембран и биополимеров клетки, что обусловливает потерю клеткой метаболитической активности, способности к пролиферации и ее гибель без последующего автолиза. Используемые производные метана можно получить известными методами синтеза или выделить из природных источников.

Максимальный эффект защиты материалов от микробного разрушения достигается путем введения заявленных веществ в концентрации от 25 до 5000 мг/л в зависимости от таксономической группы микроорганизмов (эубактерии, археи, грибы) и физиологической группы (гетеротрофы, автотрофы, углеводородокисляющие, сульфатредуцирующие и др.). Заявленные вещества при разбавлении до концентраций ниже 10 мг/л не оказывают угнетающего действия на развитие микроорганизмов.

Антимикробную активность веществ изучают методами турбидиметрического определения роста микроорганизмов в селективных питательных жидких средах при измерении оптической плотности (ОП) микробной суспензии на фотоэлектроколориметре ФЭК-56, фильтр №8, толщина слоя в кювете 0,5 см, или спектрофотометре, длина волны 660 нм, толщина слоя в кювете 1 см, или методом определения концентрации жизнеспособных клеток (КОЕ) высевом десятикратных разведений жидких культур на плотные питательные среды. Инокулят вносят в количестве, дающем количество клеток в среде 20,0-25,0 млн/мл, что составляет начальное значение ОП=0,2. Продолжительность культивирования 1-360 дней. Температуры культивирования - оптимальные для роста культур микроорганизмов (20-37°С). Аэрация обеспечивается качалкой со 140-160 об/мин, анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы выращивают без перемешивания и без слоя воздуха над средой.

Испытуемые вещества вносят в виде раствора в воде или в этиловом спирте (96%-ный ректификат) или в специальном растворителе, состоящем из ацетона, содержащего 10% детергента Твин-80, в количестве 0,5-1 об./об.%. В контрольные варианты вносят равные количества компонентов растворителей. Концентрации вносимых веществ в среде роста от максимальной - 5000 мг/л уменьшаются дробно до минимальной концентрации 1,0 мг/л.

Антимикробную активность оценивают по величине минимальных рост-ингибирующих концентраций (МИК), выраженных в мг/л.

В таблице 1 приведены конкретные вещества, соответствующие общей формуле, указанной выше, которые опробованы нами для защиты материалов от микроорганизмов, указанных в таблице 2.

Таблица 1 Вещества, обладающие антимикробной активностью № Вещества, спецификация радикалов R₁, R₂, R₃ 1 Диоксифенил, фенилметаны, где R₁ и R₂ - оксифенилы, R₃ - фенил. 2 Диоксифенил, фурилметаны, где R₁ и R₂ - оксифенилы, R₃ - фурил. 3 Диалкилоксифенил, фенилметаны, где R₁ и R₂ - алкилоксифенилы с длиной алкильного радикала C₂-C₂₁, R₃ - фенил. 4 Диалкилоксифенил, фурилметаны, где R₁ и R₂ - алкилоксифенилы с длиной алкильного радикала C₂-C₂₁, R₃ - фурил. 5 Диалкилоксифенил, трихлорметилметаны, где R₁ и R₂ - алкилоксифенилы с длиной алкильного радикала C₂-C₂₁, R₃ - трихлорметил.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. В ряд пробирок, содержащих специальные питательные среды для роста культур бактерий S. aureus и М. smegmatis, вносят вещества 1-5 (табл.1) в концентрациях 2-5000 мг/л, после чего вносят инокулят микроорганизмов в количестве, дающем величину концентрации клеток (по КОЕ) 20.0-25.0 млн/мл. В контрольные пробирки биоцид не добавляют. Через 3 и 7 дней в контрольном и опытных вариантах определяют концентрацию жизнеспособных клеток (КОЕ) методом высева десятичных разведений на плотные среды. Значения концентраций веществ, при которых величина КОЕ остается на уровне инокулята, считают за МИК. Полученные таким образом величины МИК для S. aureus и М. smegmatis представлены в таблице 2. Для S. aureus эти значения составляют от 25 мг/л (для вещества № 3) до 500 мг/л (вещество № 5). Для М. smegmatis МИК варьирует от 50 для вещества № 4 до 1000 для веществ № 1 и 2.

Аналогичным образом была проверена эффективность заявленной группой антимикробных веществ в отношении микроорганизмов таксономических групп, в которых присутствуют патогенные или токсигенные штаммы, в том числе: бактерии Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces coelicolor, дрожжи Candida utilis, низшие грибы - Aspergillus niger и Penicillium brevi-compactum.

Приведенный пример показывает, что оксифенильные производные метана (вещества № 1-5, табл.1) подавляют рост бактерий медицинского значения разной таксономической принадлежности и что при разбавлении до концентраций менее 20 мг/л вещества общей формулы не оказывают угнетающего действия на развитие микроорганизмов, т.е. не представляют экологической опасности.

Таблица 2 Значения минимальных рост-ингибирующих концентраций (МИК) соединений № 1-5 (табл.1) (мг/л) для S.aureus и М. smegmatis № соединения
Микроорганизм 1 2 3 4 5 S. aureus 100 100 25 70 500 М. smegmatis 1000 1000 70 50 750

Пример 2. Питательную среду инокулируют смесью микроорганизмов, В. subtilis, P. Fluorescens, S. cerevisiae. Затем по методу, описанному в примере 1, в питательную среду вносят препарат №2 в концентрации 1000 мг/л. Определяют титр КОЕ сразу после засева и через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Роста микроорганизмов не наблюдают в течение 12 месяцев. Аналогичный результат получен для остальных веществ, представленных в табл.1.

Данный пример показывает, что у микроорганизмов не происходит развития адаптационных реакций в отношении биоцидных веществ общей формулы, и поэтому ростподавляющее действие испытанных веществ сохраняется в течение не менее 12 месяцев.

Пример 3. В пробирки с питательными средами вносят культуры микроорганизмов (Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus, Thioalkalivibrio versutus, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis) и инкубируют в течение 1-3 сут до достижения стационарной фазы, после чего добавляют вещество №2 (табл.1) до конечной концентрации 200-1000 мг/л. В течение 30-60 мин наблюдают гибель всех клеток, причем лизиса клеток не происходит, наблюдаются специфические морфологические изменения (высокая рефрактерность клеток, появление разрывов цитоплазматической мембраны с ее последующей дезинтеграцией, выход фосфолипидов в среду при сохранении целостности клеточной стенки, конгломерация рибосом, витрификация цитоплазмы), характерные для нового типа биоцидного действия - образования микромуммий. Остальные вещества, представленные в табл.1, действуют аналогично.

Данный пример доказывает, что применение веществ №1-5 (табл.1) в дополнение к элиминации всех жизнеспособных бактерий препятствует их лизису и сопутствующему ему выходу питательных веществ (содержимого убитых микроорганизмов) в окружающую среду. В результате для микроорганизмов, попадающих в данную (защищаемую) среду, не будет питательных веществ и их развития не произойдет, что повышает надежность антимикробного действия предлагаемых биоцидов.

Пример 4. Культуры углеводородокисляющих бактерий Rhodococcus erytropolis и R. maris вносили в пробирки с 10 мл среды Раймонда с 2% нефти до концентрации 3×10⁸ кл/мл. В пробирки вносили вещество 1 (табл.1) до концентрации 0.005-0.5%. В контрольном варианте биоцид не был добавлен. Пробирки культивировали при 27°С в течение 14 суток. Выводы о наличии роста и развития культур делали на основании помутнения среды, образования эмульсии вода-нефть и микроскопического исследования образцов. Культуры углеводородородокисляющих бактерий выращивали, как описано выше, и добавляли (в количестве 10%) к культурам сульфатвосстанавливающих бактерий, которые затем выращивали на среде Видделя с лактатом в пробирках Балча в течение 2 недель. При засеве вносили вещество № 1 в вышеуказанных концентрациях. Об активности сульфатвосстанавливающих бактерий судили по появлению в среде сероводорода, определяемого по Пахмайеру.

Результаты анализа развития культур углеводородкисляющих и сульфатвосстанавливающих бактерий в присутствии нефти представлены в табл.3. Аналогичные результаты получены для других веществ, указанных в табл.1.

Таблица 3 Влияние различных концентраций вещества 1 (табл.1) на рост и развитие углеводородокисляющих бактерий R. erytropolis и R. maris Концентрация вещества 1, % Титр клеток углеводородкисляющих бактерий Активность сульфатредуцирующих бактерий 0 10⁹ 100 0.005 10⁹ 100 0.01 5×10⁶ 60 0.05 10⁶ 20 0.1 Менее 10⁵ 0 0.5 Менее 10⁴ 0

Данный пример показывает, что биоциды общей формулы эффективно подавляют развитие углеводородкисляющих и сульфатредуцирующих бактерий, участвующих в разложении нефти и нефтепродуктов и могут быть использованы для предотвращения их биокоррозии в концентрациях 0.1-0.5%.

Пример 5. Влияние препарата вещества 1 на коррозию стали проводили по методу определения защитной способности ингибиторов коррозии металлов в водонефтяных средах (ГОСТ 9.506-87) с использованием образцов стали СтЗ. Содержание вещества 1 составляло 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% (мас.). Эффективными оказались концентрации от 0.05% и выше. При содержании вещества 1 от 0.1% до 0.5% (мас.) снижение скорости коррозии составило 70-80%.

Аналогичные результаты получены для веществ № 2-5 (табл.1).

Полученные данные свидетельствуют, что вещества общей формулы являются ингибитором коррозии металлов в условиях работы нефтеперерабатывающего оборудования в концентрациях 0.05-0.5% (мас.).

Пример 6. Спиртовые растворы вещества № 1 (0.1, 0.2, 0,5, 1, 2, 5 и 10%) нанесены на поверхность деревянных брусков из расчета 0.01-1 мг/см² при глубине пропитки не менее 1 мм, бруски высушены и обработаны суспензией спор целлюлолитических грибов родов Trichoderma lignorum (концентрация 10⁷-10⁸ КОЕ/мл). Бруски оставлены во влажных камерах при 30°С. Через 30 суток определено грибное поражение древесины - визуально и путем аппликации брусков на плотную среду Гетчинсона с добавлением фильтровальной бумаги. При использовании концентраций 0.1-1% наблюдали рост грибов, как в контроле на необработанной древесине. При обработке раствором с концентрацией 2% рост сильно подавлен, при использовании 5 и 10% роста грибов не наблюдали в течение 6 месяцев.

Аналогичные данные по подавлению активности протеолитических грибов с применением вещества № 1 получены для защиты кож и кожевенного сырья.

Данный пример показывает, что вещество № 1 может быть использовано для защиты материалов разной природы, углеводов и белков, от микробной деструкции путем нанесения на их поверхность.

Изобретение относится к способам подавления роста микроорганизмов. Предложен способ защиты материалов от микробного разрушения путем введения вещества с антимикробной активностью в защищаемый материал, в качестве которого используют оксифенильное производное метана, содержащее также один радикал фурила, или фенила, или трихлорметила. Способ обеспечивает расширение ассортимента экологически безопасных веществ для антимикробной защиты, обладающих пролонгированным действием и повышенной надежностью защиты. 3 табл.

Способ защиты материалов от микробного разрушения путем введения вещества с антимикробной активностью в защищаемый материал, отличающийся тем, что в качестве вещества с антимикробной активностью используют производное метана общей формулы:

где R₁ и R₂ - оксифенил или алкилоксифенил, а R₃ - фенил, или фурил, или трихлорметил, при этом в алкилоксифениле алкил выбран из С₂-С₂₁.