СПОСОБ ЗАЩИТЫ МАТЕРИАЛОВ ОТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО РАЗРУШЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК C10M169/00 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам подавления роста микроорганизмов при одновременном ингибировании окислительных процессов, и может быть использовано для защиты органических и неорганических материалов от биоповреждений и окисления, а также в медицине, ветеринарии, микробиологической и медицинской промышленности.

Известны способы защиты материалов от биоповреждений, возникающих вследствие развития микроорганизмов, и коррозии, возникающей вследствие окисления. Для защиты материалов вносят композицию веществ, по отдельности обладающих антимикробным и антиокислительным действием [1] Смазочно-охлаждающая жидкость на водяной основе содержит ингибитор коррозии, смазочное вещество и достаточное для придания антимикробных свойств количество хотя бы одного алкиноламина.

Известны способы, где для защиты материалов от биоповреждений в них вносят соединения, обладающие антимикробным действием в отношении микроорганизмов какой-либо одной физиологической группы [2] В смазочно-охлаждающую жидкость на водной или неводной основе вводят композицию соединений, подавляющих рост анаэробов, которая содержит α -три-1-(п-нитрофенол)-2-аминопропандиол-1,3 и органический сульфонат.

Ряд биоцидов, применяемых для защиты материалов, являются экологически небезопасными веществами или обладают токсическим действием.

Например, бактерицидная композиция по патенту США N 4608183, МКИ C 10 M 159/8, НКИ 252-36, 14.01.85, вводимая в смазочное масло, содержит изотиазолоны и ионы тяжелых металлов.

Наиболее близким к предлагаемому способу защиты материалов от биоповреждений является способ, основанный на действии фенолов или их производных, в частности алкилфенилов [3] В этом способе биоцидная присадка (к смазочным маслам) содержит алкилфенол, салицилат, продукт реакции полиизобутиленянтарной кислоты с аммиаком, фосфатамин, метилнафтенат.

К недостаткам используемых способов защиты материалов от биоповреждений и окисления следует отнести:
использование композиций веществ, обладающих по отдельности антимикробной и антиокислительной активностью:
использование антимикробных веществ (биоцидов), имеющих узкий спектр действия против какой-либо одной группы микроорганизмов;
использование биоцидов, обладающих токсическим действием.

Изобретение направлено на создание способа защиты материалов от деструкции (разрушения), обеспечивающего повышения защитного эффекта одновременно от окисления и от биоповреждений, возникающих вследствие развития микроорганизмов.

Сущность способа заключается в том, что для предотвращения окисления в органических и неорганических материалах, а также биоповреждения материалов вследствие развития микроорганизмов в водной среде, образующейся при конденсации в материалах воды, используют соединения фенольного ряда (производные фенолов), являющиеся природными метаболитами микроорганизмов и обладающие одновременно антимикробной и антиокислительной активностью.

Способ заключается в том, что для предотвращения роста микроорганизмов различных систематических и физиологических групп в водную среду в количестве 10мл /пробирка, селективную для развития тесткультуры микроорганизма вносят суспензию микроорганизмов в виде покоящихся форм или клеток стационарной фазы роста в количестве 20,0 25,0 млн клеток /мл среды и антимикробной препарат, растворенный в 0,05 мл этилового спирта (ректификат 96%) из расчета 2-1024 мкг/мл среды. Пробирки термостатируют 2-40 дней при t= 25-40 C на качалках или без перемешивания.

В качестве антимикробных веществ, одновременно обладающих антиокислительной активностью, используют соединения общей формулы:

где R₁=H; HO или алкил C₆-C₂₁;
R₂=H; OH;(CH₂)_nOH,
где n= 2-6; CH₂COOR₄(R₄= H или алкил C₁-C₂₀); алкил C₆-C₂₁ или CH₂COR₅ [R₅=CO(CH₂)_nCH₃,
где n=0-19 или NH(CHz₂)_nCH₃, где n=0-19]
R₃=H или алкил C₆-C₂₁,
они же R₁, R₂ и R₃ одновременно не могут быть водородами.

Примеры использованных соединений даны в табл.1.

Вещества общей формулы (табл. 1) являются природными соединениями и синтезируются микроорганизмами различных таксономических групп. Основная биологическая активность соединений заключается в индукции перехода вегетативных клеток микроорганизмов в состояние анабиоза и поддержания этого состояния, что выражается в ингибировании прорастания покоящихся форм и роста микроорганизмов и обеспечивает микробиостатическую или микробиоцидную активность вещества в зависимости от концентраций. По механизму действия вещества общей формулы (табл.1) являются мембранными модификаторами.

Одновременно с микробиостатическим действием вещества общей формулы (табл.1) обладают антиокислительной активностью.

Преимущества предлагаемого способа заключается в следующем.

1. Биоцидное действие соединений общей формулы (табл.1) в концентрациях 1•10^-5 M 7•^-2M проявляется в отношении микроорганизмов различных таксономических групп (эубактерий, архебактерий, стрептомицетов, грибов, дрожжей) и различных физиологических групп (гетеротрофы, автотрофы, органотрофы, углеводородоокисляющие, сульфатредуцирующие) (табл.2). Это существенно повышает защитный эффект, так как не требуется синергических композиций биоцидов.

2. Соединения общей формулы (табл.1) обладают одновременно с биоцидным действием также антиоксидантной активностью, сравнимой с активностью ионола (табл. 3). Данная бифункциональность соединений повышает экономическую эффективность при их применении, так как отпадает необходимость для дополнительной защиты материалов от окисления вводить в них антиоксиданты.

3. Соединения общей формулы являются природными метаболитами микроорганизмов. При разбавлении до физиологических концентраций (менее 1•10^-5 М) они не оказывают угнетающего действия на развитие микроорганизмов и многоклеточных организмов, что обеспечивает экологическую чистоту при их применении.

4. Соединение общей формулы (табл. 1) различаются степенью:
а) их липофильности; б) биоцидной активности; в) антиоксидантной активности.

Это дает возможность предпочтительного выбора соединения или их композиции в зависимости от защищаемого материала и факторов экологического риска.

5. Будучи по типу действия на клетку естественными мембранными модификаторами, соединения общей формулы не индуцируют у микроорганизмов развития адаптационных реакций. Это исключает привыкание к ним микроорганизмов и необходимость корректировки действующих концентраций.

Испытания антимикробной (биоцидной) активности соединений (NN 1-12 табл. 1) проводят на широком спектре микроорганизмов про- и эквариот различных систематических групп, в том числе штаммов, применяемых для определения бактерио-бацилла, тиобацилла, микрокок, стафилококк, стрептококк;
грамотрицательные эубактерии-кишечная палочка, протей, шигелла, сальмонелла, псевдомонада, метилококк, нитробактерии;
олиготрофные эубактерии-лабрис;
стрептомицеты, микобактерия;
архебактерии-галобактерия, метаносарцина;
дрожжи-сахаромицет, кандида, родоспоридиум;
низшие грибы-пеницилл, аспергилл, кладоспоридиум).

Антимикробную активность веществ изучают методом турбидометрического определения роста микроорганизмов в селективных питательных жидких средах при изменении оптической плотности (ОП) микробной суспензии на спектрофотометре "Specord" при λ 600 нм и толщине слоя в кювете 1 см или фотоэлектроколориметре ФЭК-56, фильтр N 8, толщина слоя в кювете 0,5 см. Доза инакулята дает количество клеток в среде 20,0-25,0 млн/мл, что составляет начальное значение ОП 0,15 (Specord) или 0,2 (ФЭК-56). Продолжительность культивирования 2-40 дней, в соответствии с увеличенным в 2-3 раза сроком выхода контрольной культуры на стационарную фазу роста. Температуры культивирования оптимальные для роста культур (25-440^oC). Аэрация обеспечивается применением среды на качалке с 140-160 об/мин, анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы выращивают без перемешивания.

Испытуемые вещества вносят в виде раствора в этиловом спирте (96%-ный ректификат) в количестве 0,5% об/об. Концентрации вносимых веществ в среде роста от максимальной 1024 мкг/мл, уменьшаются кратно 2 до минимальной концентрации 2,0 мкг/мл.

Антимикробную активность оценивают по величине минимальных микробиостатических концентраций, выраженных в мкг/мл (min АМК).

Антиокислительную (антиоксидантную) активность соединений 1-12 общей формулы (табл. 1, приложение 1) определяют полярографически по степени окисления линолиевой кислоты или яичного лецитина (1 мг/мл) в присутствии FeSO₄ (10^-5 M) и аскорбата (10^-5 M). Исследуемые вещества вносят в виде раствора в этиловом спирте (ректификат 96%) в количестве 10-40 мкг/мл до конечной концентрации 1•10^-5 1•10^-4 M. В качестве эталонов антиоксидантов используют ионол и a -токоферол. О степени окисления линолевой кислоты или лецитина судят по скорости изменения количества растворенного кислорода в инкубационной смеси за 1 мин при изменении уровня кислорода в течение 3 мин. Антиоксидантную активность выражают в количестве вещества в моль, снижающем скорость окисления линолевой кислоты на 50% в процентах по отношению к антиоксидантной активности ионола, принимаемой за 100% при окислении яичного лецитина.

Сущность изобретения поясняется примерами. Определение антимикробной активности веществ общей формулы.

Пример 1. В ряд пробирок, содержащих по 10 мл среды Агреса, вносят суспензию спор бациллы (Bacillus cereus) до конечной концентрации 20,0 млн клеток/мл, что соответствует ОП 0,15 (Specord). В первую пробирку вносят 0,05 мл этанола контроль; во вторую одиннадцатую вносят вещество 1, растворенное в этаноле, в количестве 0,05 мл/10 мл среды. Концентрации вещества 1, вносимого в пробирки 2-11, составляет в мкг/мл питательной среды 2-2,0; 3-4,0; 4-8,0; 5-16,0; 6-32,0; 7-64,0; 8-128,0; 9-256,0; 10-512,0; 11-1024,0. Пробирки термостатируют на качалке при 28^oC в течение 4 дней. Через 4 дня определяют рост культуры по увеличению ОП. Наблюдают увеличение ОП в пробирках 1-3. В пробирках 4-11 ОП не изменяется, следовательно, рост отсутствует. Это означает, что min АМК для вещества 1 по отношению к Bacillus cereus составляет 8 мкг/мл или 1,95•10^-5 M.

Пример 2. В ряд пробирок, содержащих по 10 мл керосина ТС-1, вносят суспензию спор бациллы (Bacillus sereus) до конечной концентрации 20,0 млн клеток/мл. В первую пробирку вносят 0,05 мл этанола-контроль; во вторую - одиннадцатую вносят вещество 1, растворенное в этаноле, в количестве 0,05 мл/10 мл керосина. Концентрации вещества 1, вносимого в пробирки 2-11, составляют в мкг/мл керосина: 2-2,0; 3-4,0; 5-16,0; 6-32; 7-64,0; 8-128; 9-258,0; 10-512,0; 11-1024,0. Пробирки термостатируют на качалке при 28^oC в течение 4 дней. Рост культуры наблюдают в пробирках 1-3. В пробирках 4-11 рост отсутствует. Это означает, что min АМК для вещества 1 по отношению к Bacillus cereus составляет 8 мкг/мл или 1,95•10^-5 M.

Определение антиокислительной активности веществ общей формулы.

Пример 3. В контрольном варианте: в измерительную кислородную ячейку полярографа вносят 1 мл эмульсии линолевой кислоты в воде (1 мг/мл) и по 10 мкл трис-буфера pH 7,0, аскорбата и сернокислого железа до конечных концентраций 10•10^-3 M; 1•10^-5 M; 1•10^-5 M соответственно. В течение 3 мин измеряют количество растворенного в инкубационной смеси кислорода. Скорость снижения количества растворенного кислорода за 1 мин принимают за 100%
В опытных вариантах в измерительную ячейку вносят дополнительно 10 мкл раствора вещества 1 до конечных концентраций:
вариант 1 1•10^-5 M
вариант 2 4•10^-5 M
вариант 3 8•10^-5 M
вариант 4 1•10^-4 M
вариант 5 4•10^-4 M
вариант 6 8•10^-4 M
В течение 3 мин измеряют количество растворенного кислорода в каждом из опытных вариантов. Рассчитывают скорость снижения количества растворенного кислорода за 1 мин. Скорости снижения количества кислорода в опытных вариантах выражают в процентах по отношению к контрольному варианту.

Графически рассчитывают концентрацию вещества 1 в моль, при которой скорость поглощения кислорода, пошедшего на окисление линолевой кислоты, в 2 раза ниже, чем в кислотном варианте. Для этого строят график, где по оси абсцисс откладывают концентрацию вещества в моль, по оси ординат скорость снижения количества растворенного кислорода (поглощения кислорода) в по отношению к контролю, принимаемому за 100% Для вещества 1 эта величина равна 3,2•10^-4 M.

Результаты определения антиоксидантной активности веществ 1-12 общей формулы приведены в табл. 3.

Назначение: изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам подавления роста микроорганизмов при одновременном ингибировании окислительных процессов, и может быть использовано для защиты органических и неорганических материалов от биоповреждений и окисления, а также в медицине, ветеринарии, микробиологической и медицинской промышленности. Сущность изобретения: в защищаемый материал вводят материал фенольного ряда, обладающего одновременно антимикробной и антиокислительной активностью. 3 табл.

Способ защиты материалов от микробиологического и окислительного разрушения, заключающийся в том, что навеску вещества фенольного ряда вносят в защищаемый материал, отличающийся тем, что предварительно защищаемый материал смешивают с навеской вещества общей формулы

где R₁ H; HO или C₆ C₂₁-алкил;
R₂ H; OH; (CH₂)_nOH, где n 2 6, CH₂COOR₄ (R₄ H или C₁ C₂₀-алкил); C₆ C₂₁-алкил или CH₂ COR₅;
(R₅ CO(CH₂)_nCH₃, где n 0 19; или NH(CH₂)_nCH₃, где n 0 19);
R₃ H или C₆ C₂₁-алкил;
R₁, R₂ и R₃ одновременно не могут быть водородами,
обладающего одновременно антимикробной и антиокислительной активностью из расчета 2 1024 мкг/мл.