СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА РЫБ, ЗАРАЖЕННЫХ ГЕЛЬМИНТАМИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности ветеринарно-санитарной экспертизе.

После прекращения жизни рыб в их теле происходят необратимые процессы, протекающие в мышечной ткани, и распад промежуточных продуктов при окислении органических веществ.

В связи с этим нами была установлена концентрация промежуточных продуктов при распаде органических веществ в мышечной ткани рыб при различной степени инвазии личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб), что позволит установить влияние продуктов их жизнедеятельности на накопление летучих органических веществ.

Известен калориметрический метод определения медных солей жирных кислот в сыворотке или в плазме крови [см. А.И.Карпищенко и др. Справочник Медицинские лабораторные технологии, под ред. А.И.Карпищенко //Санкт-Петербург «Интермедика», 1999 г в 2-х томах, Т.2. С.91-92], где метод основан на экстрагировании медных солей жирных кислот из водных растворов при нейтральных и слабощелочных значениях водородных ионов различными растворителями (в данном случае смесью: хлороформ-гептан-метанол). В этих случаях ионы меди остаются в водной среде. Количество меди, перешедшее в органическую фазу, отражает содержание неэстерифицированных (свободных) жирных кислот. Медь определяют по цветной реакции с 1,5-дифенил-карбазидом. К 0,05 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови добавляют 3 мл экстракционной смеси и 0,9 мл медного реактива, закрывают пробирку и встряхивают в течение 3-х минут, после чего центрифугируют 10 минут при 2500 об/мин. Отбирают 1,8 мл раствора 1,5-дифенил-карбазида. Через 15 минут фотометрируют при длине волны 550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против контрольного раствора из 0,5 мл 1,5-дифенил-карбазида и 1,8 мл экстракционной смеси. Расчет концентрации неэстерифицированных жирных кислот проводят по калибровочному графику, для построения которого используют рабочие калибровочные растворы, содержащие 400-1000 мкмоль жирной кислоты в 1 л хлораформа; рабочий калибровочный раствор объемом 0,05 мл обрабатывают так же, как и исследуемую биологическую жидкость. Увеличение количества неэстерифицированных жирных кислот обусловлено приемом пищи, а также различными факторами, стимулирующими липолиз (гепарин, адреналин и другие вещества с аналогичным физиологическим действием). Если концентрация глюкозы в крови возрастает, то содержание неэстерифицированных жирных кислот уменьшается. Их количество возрастает при атеросклерозе, после инфаркта миокарда и при других видах патологии.

Также известен унифицированный метод определения триглицеридов по реакции с ацетилацетатом после экстракции смесью гептана и изопропилового спирта [см. А.И.Карпищенко и др. Справочник Медицинские лабораторные технологии, под ред. А.И.Карпищенко, в 2-х томах, Т.2 С.92-93], где метод основан на экстрагировании триглицеридов смесью гептана и изопропилового спирта, в которую переходят неполярные липиды; более полярные остаются в водной фазе. Триглицериды гидролизуются щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который определяется по цветной реакции с ацетилацетоном.

Ход определения включает: экстрагирование триглицеридов смесью гептана и изопропилового спирта. Для окисления глицерина до формальдегида добавляют йодную кислоту и ацетилацетоновый реактив, в результате которого образуется желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют фотометрированием при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против контрольной пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала используют 0,5 мл дистиллированной воды. Калибровочную пробу обрабатывают так же, как и опытную, но вместо исследуемой сыворотки или плазмы крови вносят 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл дистиллированной воды. Развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л. Расчет проводят по правилу пропорции или по калибровочному графику. Если используется калибровочный раствор, содержащий воду, то при постановке калибровочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора, а воду не добавляют.

Наиболее близким по технической сущности является способ, включающий определение концентрации компонентов летучих органических веществ в вытяжке, полученной из биопробы путем паровой дистилляции с помощью газового хроматографа [Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, автор Хмельков Я.Т. «Экологическая структура, патогенез и лечение вторичных застойных дистоний преджелудков у коров», Белград, 2006, с.8].

Недостатками известных методов является отсутствие возможности определения количественного состава летучих органических веществ в вытяжке мышечной ткани различных видов рыб в зависимости от степени инвазии личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб).

Техническим решением задачи является расширение технологических возможностей, снижение трудозатрат и упрощение процесса исследований.

Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки качества рыб, зараженных гельминтами, включающем определение концентрации компонента летучих органических веществ в вытяжке, полученной путем паровой дистилляции из пробы с помощью газового хроматографа, согласно изобретению для пробы используют органы и мышечную ткань рыбы, которую измельчают, получают вытяжку и помещают в газовый хроматограф и по полученным результатам общей концентрации альдегидов 40-60 мг/кг и сложных эфиров 45-70 мг/кг и по образованию 1-бутанола, 1-амилола, метанола и накоплению спиртов в количестве 0,02-0,2 об.% в процессе жизнедеятельности гельминтов, ухудшающих физико-химические показатели рыбы, определяют их доброкачественность, при превышении общей концентрации альдегидов 40 мг/кг и сложных эфиров 45 мг/кг при интенсивной инвазии личинками Anisakis simplex и плероцеркоидами ремнеца Ligula inteestinalis рыбы, например путассу, сельдь и хамса - более 20; минтай и мойва - более 7 относительно контрольного результата, относят к недоброкачественной и отправляют на техническую утилизацию для изготовления рыбной муки.

Преимущество данного метода состоит в следующем: высокая эффективность разделения компонентов, недоступная при других методах исследованиях; низкий расход реактивов и растворителей; простота аппаратуры; высокая скорость анализа и высокая воспроизводимость условий реакции; хорошая растворимость производных в водной среде; широкие возможности газожидкостной хроматографии для выявления летучих органических веществ в вытяжке мышц различных видов рыб, пораженных личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб). Кроме того, заявляемое предложение является более экономичным, т.к. не требует применения особо дорогостоящих химических реактивов.

Способ оценки количественного состава летучих органических веществ в вытяжке мышечной ткани различных видов рыб, пораженных личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб) на газожидкостном хроматографе (ГАЛС-311), включает разделение смесей летучих веществ, при многократном динамическом перераспределении их компонентов между сорбентом и газоносителем при его движении вдоль слоя сорбента.

Новизна заявленного предложения обусловлена тем, что экспресс-анализом установлены параметры изменения концентрации летучих органических веществ в вытяжке мышечной ткани различных видов рыб, пораженных личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб), на газожидкостном хроматографе.

Пример конкретного осуществления способа оценки качества рыб, зараженных гельминтами

Состав летучих компонентов изучали на газовом хроматографе «Кристалл-2000 М», оборудованном 50 м кварцевой капиллярной колонкой HP FFAP с внутренним диаметром 0,32 мм, производства США.

Для изучения летучих компонентов в мышечной ткани проводят подготовку проб рыб. С этой целью в количестве 4-6 г навеску рыбы берут и помещают в прибор для отгонки летучих продуктов с водяным паром. Проводят перегонку мышечной ткани рыб, при этом полученную вытяжку собирают в мерную колбу на 50 см³. Вытяжку из мышечной ткани рыб используют для определения летучих компонентов на газожидкостном хроматографе. Объем вытяжки делят на массу навески, таким образом, производят разбавление исходной пробы, что учитывают в количественных расчетах.

Для определения летучих компонентов (альдегиды, спирты, уксусная, масляная, валериановая кислоты и другие) 2 мкл вытяжки из органов и тканей с использованием заранее проведенной калибровки дозируют в газожидкостной хроматограф.

Режим работы газового хроматографа: кварцевая капиллярная колонка, длиной 50 метров, внутренний диаметр 0,32 мм; неподвижная жидкая фаза - FFAP; температура инжектора хроматографа - 170°С; температура подогрева детектора ДИП - 170°С; входное давление на колонке - 60 кПа; температура термостата колонок 50°С, изотерма 7 мин, затем программирование температуры со скоростью 5°С/мин до 140°С, выдержка 20 мин, затем программирование температуры со скоростью 10°С/мин до 160°С и выдержка до конца анализа не менее 40 мин; испаритель с делением потока, коэффициент деления потока - 1: 33; поток газа-носителя через колонку - 1,21 см³/мин; объем пробы - 2 мм³; газ-носитель - азот; расход водорода - 25 см³/минуту; расход воздуха - 250 см³/мин; время анализа - 60 мин.

Для количественных расчетов содержания компонентов в пробах рыб применяют метод абсолютной калибровки. Модельную смесь ацетальдегида, сложных эфиров, метанола и сивушного масла готовят на 40%-ном водно-спиртовом растворе с использованием спирта «Экстра» и дистиллированной воды. Модель подбирают по составу с использованием аттестованных градуировочных смесей, близких к исследуемым объектам (рыба).

Порядок и время выхода (мин, сек) компонентов в указанном режиме анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1 Порядок и время выхода летучих органических веществ в мышечной ткани рыб на капиллярной колонке FFAP № Компонент Время выхода, мин № Компонент Время выхода, мин 1 2 3 4 5 6 1 Уксусная 22,22 19 1,3-бутиленгликоль 31,06 2 Пропионовая 24,08 20 Ацетальдегид 5,48 3 Изомасляная 24,51 21 Метилацеталь 5,55 4 Масляная 26,30 22 Этилацеталь 7,17 5 Изовалериановая 27,34 23 Ацетоин 18,35 6 Валериановая 29,40 24 Фурфурол 23,07 7 Каприловая 46,19 25 Этилформиат 6,22 8 Метанол 7,31 26 Метилацетат 6,36 9 Этанол об.% 7,59 27 Этилацетат 7,20 10 2-бутанол 9,45 28 Изобутилацетат 9,34 11 1-пропанол 10,00 29 Этилбутират 10,15 12 Изобутанол 11,20 30 Изоамилацетат 12,31 13 1-бутанол 13,00 31 Метилкаприлат 21,21 14 Изоамиловый 15,18 32 Этилкаприлат 22,02 15 1-амилол 16,51 33 Этиллактат 22,57 16 1-гексанол 19,49 34 Лимонен 15,13 17 Фенилэтанол 37,18 35 Диацетил 8,58 18 2,3-бутиленгликоль 24,17

Установлены границы относительной погрешности (%) измерения массовой концентрации (мг/дм³) летучих компонентов и нормативы оперативного контроля (%) измеряемых массовых концентраций (мг/дм³) летучих компонентов, результаты которых показаны в таблице 2 и 3.

Таблица 2 Границы относительной погрешности измерения массовой концентрации летучих компонентов Компоненты Массовая концентрация (мг/дм³) Границы относительной погрешности (%) Сивушные масла:     2-пропанол     1-пропанол     2-бутанол от 0,5 до 10,0 ±12 изобутанол свыше 10,0 до 5000 ±3 1-бутанол изоамилол     1-амилол     1-гексанол     Сложные эфиры от 0,5 до 10,0 ±8 свыше 10,0 до 5000 ±4 Ацетальдегид от 0,5 до 10,0 ±10 свыше 10,0 до 5000 ±3   от 1 до 10,0 ±20 Метанол свыше 10,0 до 100 ±7   свыше 100 до 2000 ±3

Результаты научных исследований для установления качества и безопасности различных видов рыб при поражении личинками Anisakis simplex и Ligula intestinalis

В процессе проведения ветеринарно-санитарной экспертизы нами были выявлены гельминтозные заболевания: анизакидоз у морских рыб из семейства тресковые - путассу северная (Micromesistius poutassou) и минтая (Theragra); из семейства сельдевые - сельди атлантической (Clupca barengus), из семейства анчоусовые (Engraulidae), отряда сельдеобразные - хамсы черноморской (Engraulis encrasicholus ponticus); семейства корюшковые (Osmeridae) - мойвы (Mallotus villosus) и лигулез у прудовых рыб из семейства карповые - белый амур (Ctenopharyngodon idella).

В зависимости от степени инвазии личинками Anisakis пробы рыб разделили на группы. Пробы путассу разделили на четыре группы: первая - при инвазии от одной до двух личинок Anisakis, вторая - от 9 до 13, третья - от 20 до 36, четвертая - от 44 до 63. Пробы минтая - на две группы: первая - при обнаружении личинок Anisakis от одной до двух, вторая - от 7 до 8. Пробы сельди - на три группы: первая - при обнаружении личинок Anisakis от 10 до 14, вторая - от 15 до 20 и третья - от 31 до 42. Пробы хамсы разделили на четыре группы: первая - неинвазированная, вторая - инвазированная от 1 до 4 личинок Anisakis, третья - от 15 до 20 и четвертая - от 21 до 27. Пробы мойвы разделили на две группы: первая - не инвазированная личинками Anisakis, вторая - от 4 до 8.

Пробы белого амура разделили на две группы: первая - контрольная (клинически здоровая), вторая - опытная (инвазированная плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis).

В результате проведенных исследований на газожидкостном хроматографе были зарегистрированы в вытяжке мышц путассу карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты (продукта распада пировиноградной кислоты) при этом была выше: у инвазированной путассу от 9 до 13 и от 20 до 36 личинок Anisakis - на 4%, при инвазии от 44 до 63 личинок - на 9%, чем при инвазии от одной до двух личинок. При инвазии от одной до двух личинок Anisakis масляная кислота не регистрировалась. С увеличением степени инвазии наблюдалось накопление масляной кислоты и, напротив, снижение концентрации изомасляной кислоты. Максимальное накопление изовалериановой и капроновой кислот наблюдалось при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis и было выше в 1,7 раза и 1,3 раза соответственно, а при инвазии от 20 до 36 личинок была ниже на 4% и 13% соответственно, и отсутствовала у инвазированной рыбы от 44 до 63 личинок по сравнению с путассу, инвазированной от одной до двух личинок (табл.4).

В процессе жизнедеятельности личинок Anisakis происходило спиртовое брожение. Так в вытяжке мышц путассу при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis фенилэтанол превышал в 1,7 раза, при инвазии от 20 до 36 личинок - в 2,2 раза, при инвазии от 44 до 63 личинок - в 2,6 раза относительно пораженной рыбы путассу от одной до двух личинок Anisakis. При инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis 2,3-бутиленгликоль превышал в 1,6 раза, при инвазии от 20 до 36 личинок - в 1,8 раза, при инвазии от 44 до 63 личинок - в 2,4 раза. Однако при инвазии от 20 до 36 личинок наблюдалось снижение концентрации 1-амилола в 1,6 раза, 1-гексанола - в 1,9 раза и 1-бутанола - в 1,2 раза относительно пораженной рыбы путассу от одной до двух личинок Anisakis (табл.4).

В рыбе (путассу), пораженной от одной до двух личинок Anisakis на хроматографе не был зарегистрирован этилбутират, тогда как при возрастании инвазии его концентрация увеличивалась: при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis она составила 0,62±0,05 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 20 до 36 личинок Anisakis - 3,27±0,15 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 44 до 63 личинок Anisakis - 4,95±0,09 мг/кг фарша рыбы. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц путассу при инвазии от 20 до 36 личинок Anisakis и составила 17,79±0,43 мг/кг фарша рыбы и 16,27±0,29 мг/кг фарша рыбы соответственно (табл.4).

У зарегистрированных сложных эфиров концентрация метилкаприлата, ' этилацетата, этиллактата снижалась при увеличении степени инвазии. Так, при инвазии путассу от 9 до 13 личинок Anisakis метилкаприлат, этилацетат и этиллактат были ниже на 16%, 15% и 5%, при инвазии от 20 до 36 личинок - на 20%, 41% и 13% соответственно, по сравнению с инвазированной путассу от одной до двух личинок Anisakis.

При инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis диацетил (кетон) был выше на 8% и, напротив, при инвазии от 20 до 36 личинок - ниже на 5% по сравнению с инвазированной путассу от одной до двух личинок Anisakis.

При инвазии путассу от 44 до 63 личинок на газовом электрохроматографе не были зарегистрированы следующие летучие органические кислоты:

изовалериановая и каприловая карбоновые кислоты; среди спиртов -1-амилол, 1-гексанол, 1-бутанол, изобутанол и 1,3-бутиленгликоль; среди альдегидов - ацетальдегид, фурфурол; из сложных эфиров - метилкаприлат, этилацетат, что, по всей видимости, объясняется тем, что они распались до конечных продуктов (табл.4).

Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц путассу при максимальной зараженности (44-63 личинки Anisakis) была выше карбоновых кислот в 1,2 раза, альдегидов - в 1,3 раза, эфиров - в 2,8 раза, чем при минимальной инвазии (1-2 личинок Anisakis).

В вытяжке мышц минтая на газовом хроматографе были зарегистрированы карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты (продукта распада пировиноградной кислоты) у инвазированного минтая от 7 до 8 личинок Anisakis была выше на 16%, чем при инвазии от одной до двух личинок. При инвазии минтая от 7 до 8 личинок Anisakis пировиноградная кислота составила 0,17±0,01 мг/кг фарша рыбы, изовалериановая - 0,77±0,03 мг/кг фарша рыбы, валериановая - 0,50±0,02 мг/кг фарша рыбы, в то время как при инвазии от одной до двух личинок они не были зарегистрированы (табл.5).

В процессе жизнедеятельности личинок Anisakis происходило спиртовое брожение, что способствовало образованию метанола (продукт распада метилового альдегида) и накоплению его в вытяжке мышц минтая. При инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis содержание метанола составило 1,73±0,03 мг/кг фарша рыбы, 2,3-бутиленгликоля - 5,45±0,22 мг/кг фарша рыбы, изоамилового спирта - 2,17±0,02 мг/кг фарша рыбы, в то время как при инвазии от одной до двух личинок они не были зарегистрированы. При инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis наблюдалось снижение 1-амилола в 1,4 раза по сравнению с рыбой, инвазированной от одной до двух личинок (табл.5).

Таблица 5 Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц минтая (M±m; n=10) Органические летучие вещества, мг/кг Количество личинок Anisakis на висцеро минтая 1-2 7-8 Уксусная 35,44±0,35 41,25±0,48*** Пропионовая - 0,17±0,01*** Изовалериановая - 0,77±0,03*** Валериановая - 0,50±0,02*** Этанол об.% 0,01±0,00 - Изоамиловый - 2,17±0,02*** 1-амилол 2,29±0,02 1,69±0,01*** 1-гексанол 1,39±0,01 - 2,3-бутиленгликоль - 5,45±0,22*** Метанол - 1,73±0,03*** Ацетальдегид 2,78±0,03 3,78±0,12*** Фурфурол 3,88±0,13 5,03±0,19*** Ацетоин 10,20±0,31 11,03±0,27* Этилацетат - 2,02±0,04*** Метилкаприлат 2,09±0,01 1,51±0,05*** Этиллактат 0,06±0,01 0,32±0,03*** Этилбутират - 2,16±0,01*** Метилацеталь 0,54±0,02 1,55±0,04*** ***Р>0,001

В рыбе (минтай), пораженной от одной до двух личинок Anisakis, на хроматографе не были зарегистрированы этилбутират и этилацетат, тогда как при возрастании инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis их концентрация составила 2,16±0,01 и 2,02±0,04 (мг/кг фарша рыбы) соответственно. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц минтая при инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis и составила 5,03±0,19 (мг/кг фарша рыбы) и 11,03±0,27 (мг/кг фарша рыбы) соответственно. Среди зарегистрированных сложных эфиров концентрация метилкаприлата снижалась в 1,4 раза и, напротив, повышалась этиллактата - в 5,3 раза, метилацеталя - в 2,9 раза по сравнению с рыбой, инвазированной от одной до двух личинок (табл.5).

Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц минтая при максимальной зараженности (7-8 личинок Anisakis) была ниже альдегидов - в 16 раз, эфиров - в 1,5 раза и, напротив, выше карбоновых кислот в 1,1 раза, чем при минимальной инвазии (1-2 личинок Anisakis).

При изучении накопления летучих органических веществ в организме сельди, пораженной личинками Anisakis, на газовом хроматографе из карбоновый кислот нами была зарегистрирована высокая концентрация уксусной кислоты. Так, при инвазии сельди в количестве от 10 до 14 личинок Anisakis концентрация уксусной кислоты была выше в 1,6 раза, чем при инвазии от 15 до 20 и от 21 до 27 личинками. Концентрация пировиноградной кислоты при инвазии сельди от 21 до 27 личинок Anisakis была выше в 4 раза в сравнении с менее инвазированной рыбой.

В процессе жизнедеятельности личинок Anisakis происходило спиртовое брожение, что способствовало образованию метанола (продукт распада метилового альдегида) и накоплению его в вытяжке мышц сельди. При инвазии от 15 до 20 личинок концентрация метанола составила 15,16±0,98 мг/кг фарша рыбы. В зависимости от степени инвазии наблюдалось повышение концентрации 1-пропанола в 2 раза, изоамилового - в 1,9 раза, 1-амилового - в 25 раз, 1,3-бутиленгликоля - в 3 раза по сравнению с инвазированной рыбой от 10 до 14 личинок (табл.6).

В вытяжке мышц сельди не были зарегистрированы метилацеталь и этилацеталь в отличие от экстракта мышц хамсы, пораженной личинками Anisakis. С увеличением степени инвазии личинками Anisakis в вытяжке мышц сельди наблюдалось повышение концентрации ацетальдегида в 2 раза и, в то же время, снижение ацетоина в 1,8 раза по сравнению с инвазированной сельдью от 10 до 14 личинок (табл.6).

Таблица 6 Концентрация летучих органических кислот в вытяжке мышц сельди (M±m; n=10) Органические летучие вещества, мг/кг Количество личинок Anisakis на висцеро сельди 10-14 15-20 31-42 Уксусная 128,98±1,11 78,34±1,39*** 71,76±0,56 Пропионовая 2,82±0,10 2,63±0,16 11,62±0,34*** Изомасляная 0,77±0,04 2,90±0,05*** - Масляная 15,11±0,52 17,38±0,62** 13,83±0,30* Валериановая - 8,09±0,08 16,16±0,33 Изовалериановая 13,32±0,40 2,15±0,08 15,27±0,19*** Метанол 5,04±0,04 15,16±0,98*** - Этанол об.% 0,05±0,01 0,02±0,01* 0,02±0,01* Фенилэтанол 5,36±0,27 5,53±0,37 4,79±0,20 1-пропанол 26,77±0,98 48,04±2,06*** 54,91±0,50*** Изоамиловый 5,04±5,04 5,64±0,38 9,49±0,22*** 1-амилол 0,67±0,04 2,85±0,23*** 16,87±12,53*** 1-гексанол 11,64±0,29 3,92±0,17*** - 2-бутанол - 10,93±0,20*** - 2,3-бутиленгликоль 46,33±0,92 9,32±0,62***   1,3-бутиленгликоль 5,78±0,16 17,08±0,26***   Метилацеталь - - - Этилацеталь - - - Ацетальдегид 8,72±0,53 17,99±0,52*** 18,35±0,58*** Фурфурол 10,69±0,68 9,88±0,48 - Ацетоин 10,48±0,5б 7,18±0,63*** 5,93±0,19*** Каприновый 18,65±0,34 - - Лимонен 3,49±0,13 3,14±0,05* - Этилацетат 0,70±0,03 2,79±0,17*** - Метилкаприлат 5,02±0,02 7,04±0,79* 4,37±0,06* Метилацетат 4,94±0,05 5,55±0,38 47,95±0,89*** Этилформиат 6,01±0,04 5,97±0,06 - Этилбутират 6,44±0,04 6,25±0,10 - Этилкаприлат 1,88±0,04 2,62±0,06*** - Этиллактат 2,12±0,02 2,85±0,23** 10,53±0,34*** Диацетил 2,99±0,03 4,46±0,11*** - *Р<0,05; **Р>0,01; ***Р>0,001

Среди зарегистрированных сложных эфиров их концентрация возрастала в вытяжке мышц сельди в зависимости от степени инвазии личинками Anisakis. Так, при инвазии сельди от 15 до 20 личинок Anisakis концетрация этилацетата была выше в 4 раза, концентрация метилкаприлата и этилкаприлата - в 1,4 раза, чем при инвазии от 10 до 14 личинок. При инвазии сельди от 31 до 42 от 10 до 14 личинок Anisakis концентрация метилацетата была выше в 10 раз, концентрация этиллактата - в 5 раз, чем при инвазии от 10 до 14 личинок.

Концентрация диацетила (кетон) при инвазии сельди от 15 до 20 личинок Anisakis была выше в 1,4 раза, чем при инвазии от 10 до 14 личинок (табл.6).

Общая концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц сельди при инвазии от 10 до 14 личинок Anisakis составила: карбоновых кислот - 161,00 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 52,03 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 27,11 мг/кг фарша рыбы, кетонов (диацетил) - 2,99 мг/кг фарша рыбы.

При инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis концентрация карбоновых кислот составила 111,49 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 38,19 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 33,07 мг/кг фарша рыбы, кетонов (диацетил) - 4,46 мг/кг фарша рыбы. При инвазии сельди от 31 до 42 личинок концентрация карбоновых кислот составила 128,64 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 24,28 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 62,85 мг/кг фарша рыбы (табл.6).

В вытяжке мышц хамсы на газовом хроматографе были зарегистрированы карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты у инвазированной хамсы от одной до четырех личинок Anisakis была выше в 4,2 раза, при инвазии от 15-20 личинок - в 2 раза и, напротив, при инвазии от 21 до 27 личинок была ниже в 1,6 раза, чем в рыбе, не пораженной личинками.

Накопление концентрации метанола в вытяжке мышц хамсы при инвазии от одной до четырех личинок Anisakis составила 7,96±0,21 мг/кг фарша рыбы. При инвазии от 15 до 20 личинок объемный процент этанола превышал в 1,6 раза, а при инвазии от 21 до 27 личинок - в 7,2 раза. Концентрация фенилэтанола при инвазии от 15 до 20 личинок была выше в 3,3 раза, при инвазии от 21 до 27 личинок - в 4 раза, чем в рыбе, не пораженной личинками. При инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis концентрация 1-бутанола составила 3,02 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 15 до 20 личинок концентрация 1-бутанола - 3,79 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 21 до 27 личинок - 3,13 мг/кг фарша рыбы. В рыбе, не пораженной личинками, на газовом хроматографе 1-бутанол не был зарегистрирован (табл.7).

В рыбе (хамсе), не пораженной личинками Anisakis, на хроматографе не были зарегистрированы альдегиды, кроме ацетоина. При инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis концентрация метилацеталя составила 2,56±0,07 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis - 5,91±0,22 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 31 до 42 личинок Anisakis - 1,51±0,03 мг/кг фарша рыбы. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц хамсы при инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis 23,88±0,52 мг/кг фарша рыбы и 33,12±0,76 мг/кг фарша рыбы соответственно (табл.7).

Среди зарегистрированных сложных эфиров концентрация метилацетата возрастала в зависимости от повышения степени инвазии. Так, при инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis она была выше в 1,4 раза, при инвазии от 15 до 20 личинок - в 1,6 раза, при инвазии от 21-27 личинок - в 2 раза, чем в рыбе, не пораженной личинками. У рыб, пораженных личинками Anisakis, были выявлены этилкаприлат и этиллактат, концентрация которых возрастала в зависимости от степени инвазии. В то же время этилбутират регистрировали лишь при инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis 10,55±0,27 мг/кг фарша рыбы и при инвазии от 15 до 20 личинок 12,78±0,51 мг/кг фарша рыбы.

Диацетил (кетон) был зарегистрирован только при инвазии одной до четырех личинок Anisakis 2,17±0,07 мг/кг фарша рыбы.

Общая концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц хамсы, не пораженной анизакидами, составила: карбоновых кислот - 55,52 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 32,26 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 27,14 мг/кг фарша рыбы. При инвазии от одной до четырех личинок Anisakis концентрация карбоновых кислот составила 136,78 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 59,18 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 62,27 мг/кг фарша рыбы, кетонов (диацетил) - 2,17 мг/кг фарша рыбы. При инвазии хамсы от 15 до 20 личинок концентрация карбоновых кислот составила 74,05 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 78,60 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 60,39 мг/кг фарша рыбы. При инвазии хамсы от 21 до 27 личинок концентрация карбоновых кислот составила 21,40 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 43,23 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 88,41 мг/кг фарша рыбы (табл.7).

В вытяжке мышц мойвы на газовом хроматографе были зарегистрированы карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты была ниже на 40% у инвазированной мойвы от 4 до 8 личинок Anisakis, пировиноградной кислоты - на 53% и, напротив, отмечено повышение валериановой кислоты в 4 раза, относительно неинвазированной рыбы. При инвазии мойвы от 4 до 8 личинок Anisakis масляная кислота составила 6,38±0,10 мг/кг фарша рыбы, в то время как у неинвазированной рыбы она не была зарегистрирована.

В вытяжке мышц мойвы при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis содержание метанола составило 8,80±0,19 мг/кг фарша рыбы, 1-пропанола - 2,41±0,02 мг/кг фарша рыбы, изоамилового спирта - 3,31±0,04 мг/кг фарша рыбы, 1-бутанола - 2,36±0,03 мг/кг фарша рыбы, в то время как у неинвазированной рыбы они не были зарегистрированы. Концентрация фенилэтанола при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis была выше в 3,8 раза, 1-амилола - в 1,2 раза и, напротив, отмечено снижение 2,3-бутиленгликоля 8 в 1,9 раза, относительно неинвазированной рыбы. Изобутанол у пораженной мойвы не был зарегистрирован, когда как у неинвазированной рыбы изобутанол составил 1,62±0,02 мг/кг фарша рыбы (табл.8).

В рыбе (мойва), не инвазированной личинками Anisakis, на хроматографе не были зарегистрированы этилбутират и метилацеталь, тогда как при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis концентрация их составила 2,04±0,02 и 1,49±0,10 (мг/кг фарша рыбы) соответственно. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц мойвы при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis 8,72±0,23 мг/кг фарша рыбы и 3,27±0,04 мг/кг фарша рыбы соответственно, в то время как у неинвазированной рыбы они не были зарегистрированы. У инвазированной мойвы наблюдалось снижение этилацетата в 14 раз и, напротив, повышение этилкаприлата - в 1,5 раза, этиллактата - в 3 раза, этилацеталя - в 1,6 раза, относительно неинвазированной рыбы (табл.8).

Таблица 8 Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц мойвы, мг/кг ((M±m; n=10) Наименование Количество личинок Anisakis на висцеро мойвы 0 4-8 Уксусная 83,67±0,52 50,39±0,64*** Пропионовая 0,60±0,01 0,28±0,02*** Маслянная - 6,38±0,10*** Валериановая 0,58±0,02 2,37±0,06*** Метанол - 8,80±0,19*** Этанол об.% 0,01±0,00 0,02±0,01* Фенилэтанол 1,79±0,03 6,88±0,14*** 1-пропанол - 2,41±0,02*** Изоамиловый - 3,31±0,04*** 1-амилол 1,73±0,04 1,99±0,04*** 1-бутанол - 2,36±0,03*** 2-бутанол 0,50±0,02 - 2,3-бутиленгликоль 16,92±0,48 9,04±0,20*** 1,3-бутиленгликоль 6,10+0,29 - Изобутанол 1,б2±0,02 - Ацетальдегид 5,79±0,06 4,30±0,04*** Фурфурол - 8,72±0,23*** Ацетоин - 3,27±0,04*** Этилацетат 7,02±0,10 0,50±0,02*** Метилкаприлат - 1,41+0,03*** Этилкаприлат 0,47±0,03 0,71±0,04*** Этиллактат 0,44±0,04 1,33±0,02*** Этилбутират - 2,04+0,02*** Этилформиат 1,09±0,01 - Изобутилацетат 1,11±0,01 - Изоамилацетат 0,58±0,02 - Метилацетат 8,90±0,10 - Метильацеталь - 1,49±0,01*** Этильацеталь 0,34±0,02 0,54±0,03*** *Р<0,05; ***Р>0,001    

У неинвазированной мойвы были зарегистрированы этилформиат (1,09±0,01 мг/кг фарша рыбы), изобутилацетат (1,11±0,01 мг/кг фарша рыбы), изоамилацетат (0,58±0,02 мг/кг фарша рыбы) и метилацетат (8,90±0,10 мг/кг фарша рыбы), в то время как у инвазированной рыбы они не были зарегистрированы (табл.8).

Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц мойвы при максимальной инвазии (от 4 до 8 личинок Anisakis) была выше альдегидов - в 2,2 раза и, напротив, ниже карбоновых кислот в 1,4 раза, сложных эфиров - в 2,5 раза, чем у не пораженной личинками Anisakis.

У исследуемых рыб установлено разное количество летучих органических кислот. Так, из карбоновых кислот отсутствовала: валериановая кислота - у путассу; изовалериановая - у мойвы; масляная - у минтая; изомасляная - у минтая и мойвы. Каприловая кислота выявлена только в вытяжке мышечной ткани у сельди и путассу. Лимонен был выявлен в вытяжке сельди.

Среди спиртов наличие метанола было выше у сельди, чем у хамсы в 1,3 раза, минтая - в 5,8 раза и мойвы - в 1,1 раза. Кетонов (диацетил) у сельди выше, чем у путассу в 1,6 раза и хамсы - в 1,7 раза. Из сложных эфиров изобутилацетат и изоамилацетат выявлены у мойвы (табл.8).

Концентрация фурфурола в вытяжке мышц сельди была выше, чем у мойвы и минтая (в 1,2 раза) и, напротив, ниже, чем у путассу (в 1,2 раза), хамсы (в 1,3 раза). Концентрация ацетоина в вытяжке мышц сельди была ниже, чем у хамсы (в 3,6 раза), путассу (в 1,9 раза), минтая (в 1,4 раза) и, напротив, выше, чем у мойвы (в 2,4 раза).

Концентрация уксусной кислоты в вытяжке мышц сельди была выше, чем у минтая (в 2,4 раза), хамсы (в 1,7 раза), мойвы (в 1,4 раза) и путассу (в 1,3 раза). Концентрация масляной кислоты в вытяжке мышц сельди была выше, чем у путассу (в 7 раз), мойвы (в 2,4 раза) и хамсы (в 1,4 раза).

В результате проведенных исследований на газожидкостном хроматографе среди карбоновых кислот в вытяжке мышц у клинически здоровой рыбы (белый амур) были зарегистрированы: уксусная кислота (продукт распада пировиноградной кислоты), которая составила 24,91=1=0,10 мг/кг фарша рыбы, изовалериановая 0,62±0,02 мг/кг фарша рыбы, валериановая - 0,35=1=0,03 мг/кг фарша рыбы. Концентрация уксусной кислоты была выше в 71 раз, чем валериановой, в 41 раз - изовалериановой кислоты.

В вытяжке мышц у инвазированного белого амура плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация уксусной кислоты была выше в 2,4 раза, изовалериановой - в 2 раза, чем у клинически здоровой рыбы. Необходимо отметить, что валериановая кислота у инвазированной рыбы не была зарегистрирована в отличие от контрольной группы. В то же время в контрольной группе рыб не выявлены пропионовая, изомасляная и масляная карбоновые кислоты. У инвазированного амура плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinali пропионовая кислота составила 5,54 мг/кг фарша рыбы, изомасляная - 0,40 мг/кг фарша рыбы и масляная - 0,83 мг/кг фарша рыбы.

У инвазированной рыбы плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация уксусной кислоты была выше в 148 раз, чем изомасляной кислоты, в 71 раз - масляной, в 49 раз - изовалериановой, в 11 раз - пропионовой кислоты.

В процессе жизнедеятельности плероцеркоидов ремнецов Ligula intestinali происходило спиртовое брожение. Так в вытяжке мышц у инвазированной рыбы концентрация метанола была выше в 2,5 раза, фенилэтанола - в 3,8 раза, 1-гексанола - в 1,8 раза относительно клинически здоровой рыбы. Необходимо отметить, что у инвазированной рыбы зарегистрированы этанол в концентрации 0,02±0,01 об.%, изоамиловый спирт - 0,57±0,02 мг/кг фарша рыбы, 1-бутанол - 3,44±0,06 мг/кг фарша рыбы, 2,3-бутиленгликоль - 9,01=1=0,04 мг/кг фарша рыбы, изобутанол - 1,86±0,03 мг/кг фарша рыбы.

У инвазированной рыбы плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация ацетальдегида была выше в 3,9 раза, фурфурола - в 2,1 раза, ацетоина - в 1,4 раза, каприлового альдегида - в 1,9 раза относительно клинически здоровой рыбы. Концентрация метилкаприлата была выше в 2 раза и, напротив, ниже в 1,4 раза метилацетата, в 1,1 раза - этилкаприлата и метилкаприната относительно клинически здоровой рыбы.

В вытяжке мышц у инвазированного белого амура плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация летучих органических веществ была выше: карбоновых кислот в 2,6 раза, альдегидов - в 2,4 раза, эфиров - в 1,1 раза, чем у клинически здоровой рыбы.

Таким образом, при метаболизме личинок Anisakis и плероцеркоидов ремнеца Ligula intestinalis в тканях рыб накапливается значительное количество уксусного альдегида и продуктов его реакции со спиртами - ацеталей. Уксусный альдегид является не только побочным продуктом спиртового брожения, но и продуктом окисления спирта, который образуется в процессе жизнедеятельности гельминтов. Содержание уксусного альдегида может служить критерием степени окисленности продукта, который позволяет достоверно определить качество рыбной продукции. Последнее объясняется тем, что при поражении рыб личинками Anisakis и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis мышечная ткань рыб характеризуется различной степенью окисленности, обусловленной инвазивностью и технологическим режимом их обработки.

Уксусный альдегид, образовавшийся в процессе жизнедеятельности гельминтов, взаимодействует, в первую очередь, с этиловым спиртом, образуя ацеталь. Продуктом реакции ацетальдегида является диацетил, относящийся к классу кетонов, представлен жидкостью желтого цвета, его наличие характеризует окисленность мышечной ткани рыб, особенно ухудшает органолептические показатели продукта. При окислении мышечной ткани рыб образуется избыточное количество ацетоина. Образовавшийся в больших концентрациях фурфурол придает запах перегретых отрубей, ухудшающий качество продукта.

При установлении летучих компонентов в вытяжке мышечной ткани рыб, инвазированных гельминтами, выявлены процессы окисления в связи с образованием альдегидов, эфиров, кетонов, карбоновых кислот, в частности масляной кислоты, придающей продукту запах прогорклого масла.

В процессе жизнедеятельности гельминтов в их организме происходит спиртовое брожение, что приводит к образованию метанола (продукт распада метилового альдегида) и накоплению его в мышечной ткани рыб.

По полученным результатам общей концентрации альдегидов 40-60 мг/кг и сложных эфиров 45-70 мг/кг и по образованию 1-бутанола, 1-амилола, метанола и накоплению спиртов в количестве 0,02-0,2 об.% в процессе жизнедеятельности гельминтов, ухудшающих физико-химические показатели рыбы, определяют их доброкачественность, при превышении общей концентрации альдегидов 40 мг/кг и сложных эфиров 45 мг/кг при интенсивной инвазии личинками Anisakis simplex и плероцеркоидами ремнеца Ligula inteestinalis рыбы, например путассу, сельдь и хамса - более 20; минтай и мойва - более 7 относительно контрольного результата, относят к недоброкачественной и отправляют на техническую утилизацию для изготовления рыбной муки.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной экспертизе. Способ предусматривает определение концентрации компонентов летучих органических веществ в вытяжке, полученной путем паровой дистилляции из органов и мышечной ткани рыбы. При превышении общей концентрации альдегидов 40 мг/кг, сложных эфиров 45 мг/кг и спиртов в количестве 0,02-0,2 об.% рыбу относят к недоброкачественной и отправляют на техническую утилизацию для изготовления рыбной муки. Изобретение позволяет оценить степень зараженности рыб гельминтами. 8 табл.

Способ оценки качества рыб, зараженных гельминтами, включающий определение концентрации компонента летучих органических веществ в вытяжке, полученной путем паровой дистилляции из пробы с помощью газового хроматографа, отличающийся тем, что для пробы используют органы и мышечную ткань рыбы, которую измельчают, получают вытяжку и помещают в газовый хроматограф, и по полученным результатам общей концентрации альдегидов 40-60 мг/кг и сложных эфиров 45-70 мг/кг и по образованию 1-бутанола, 1-амилола, метанола и накоплению спиртов в количестве 0,02-0,2 об.% в процессе жизнедеятельности гельминтов, ухудшающих физико-химические показатели рыбы, определяют их доброкачественность, при превышении общей концентрации альдегидов 40 мг/кг и сложных эфиров 45 мг/кг при интенсивной инвазии личинками Anisakis simplex и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis рыбы, например путассу, сельдь и хамса - более 20; минтай и мойва - более 7 относительно контрольного результата, относят к недоброкачественной и отправляют на техническую утилизацию для изготовления рыбной муки.