ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher В КАЧЕСТВЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ МОДЕЛИ ВАСКУЛОГЕННОЙ МИМИКРИИ Российский патент 2010 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно к созданию опухолевых моделей для изучения механизмов канцерогенеза и скрининга противоопухолевых препаратов уникального механизма действия.

Злокачественные заболевания кожи составляют около 25% всех злокачественных опухолей. Удельный вес меланомы составляет до 3%. Традиционно меланома кожи считается злокачественной опухолью с вариабельным и зачастую непредсказуемым клиническим течением. Так, составляя структурно не более 10% от всех форм рака кожи, она ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи. Поиск новых методов лечения злокачественной меланомы кожи является актуальным.

В настоящее время идут активные исследования в области создания новых противоопухолевых средств с направленным механизмом действия, так называемых «таргетных» препаратов. Отличительной особенностью таких лекарств является воздействие на определенный механизм прогрессии злокачественной опухоли через блокирование белка-мишени внутри опухоли. Однако существует проблема поиска опухолевых моделей in vitro и in vivo для эффективной оценки действия препаратов с направленным механизмом действия.

Проводятся исследования по поиску новых антиангиогенных противоопухолевых препаратов. Данный класс препаратов блокирует образование новых сосудов в опухоли и «нормализует» уже сформированную кровеносную сеть внутри опухолевой ткани. В настоящее время в клинической практике используется Авастин (моноклональное антитело против VEGF). Антиангиогенная терапия в сочетании с химиотерапией увеличивает эффективность лечения на 15-25% [1].

Резистентность к антиангиогенной терапии может быть объяснена появлением в опухоли альтернативных путей кровоснабжения. Наиболее вероятным механизмом резистентности к антиангиогенной терапии является появление компонента васкулогенной мимикрии (ВМ) и мозаичных сосудов. ВМ - это способность высокоагрессивных опухолевых клеток, таких, например, как клетки меланомы кожи, образовывать в отсутствие эндотелиальных клеток (ЭК) и фибробластов высокоструктурированные васкулярные каналы, ограниченные базальной мембраной [2]. Этот новый тип васкуляризации опухоли был открыт сравнительно недавно - в 1999 году [3]. В экспериментах in vivo было показано, что при длительном введении ангиостатина, природного ингибитора ангиогенеза, у некоторых мышей возникала резистентность к проводимому лечению. Гистологический анализ образцов опухолей, нечувствительных к действию препарата, показал, что в этих опухолях в отличие от чувствительных присутствует компонент ВМ. Также была выявлена высокая корреляция между способностью к ВМ и частотой метастазирования первичных меланом кожи и глаз [4]. В связи с этим необходимость в изучении механизмов данного процесса и создание нового направления лечения, влияющего на процесс васкулогенной мимикрии при злокачественных новообразованиях, можно считать актуальными.

Для изучения ВМ и оценки возможности использования противоопухолевых веществ в качестве потенциальных ингибиторов необходимо создание моделей клеточных линий опухолей человека, способных к воспроизведению процесса ВМ в экспериментальных условиях. Данная опухолевая модель ВМ должна обладать следующими характеристиками: стабильно воспроизводить сосудистоподобные структуры (СПС) in vitro и in vivo при имплантации иммунодефицитным мышам, давать воспроизводимые результаты тестирования новых противоопухолевых веществ в краткосрочных тестах in vitro (до 24 часов), давать воспроизводимые результаты при тестировании противоопухолевых веществ in vivo. При этом предполагается, что для различных типов опухолей должны быть разработаны отдельные модели, так как механизмы формирования ВМ могут различаться в различных типах опухолей.

Проводится большое количество исследований, посвященных поиску адекватной модели ВМ для опухолей человека в экспериментальных условиях. Показано, что имеющиеся клеточные линии опухолей человека либо не формируют СПС in vitro, либо формируют СПС in vitro в долгосрочных тестах (до 3 недель). На сегодняшний день основной клеточной линией для изучения ВМ является клеточная линия увеальной меланомы человека MUM2B (прототип). Прототип имеет следующие недостатки: получен из опухолевых клеток увеальной меланомы (редко встречаемой формы меланомы), формирует СПС in vitro в долгосрочных тестах (до 3 недель), формирование ВМ in vivo происходит при определенных условиях (имплантации сфероидов клеток) [5, 6]. Взятая в качестве прототипа клеточной линия увеальной меланомы MUM2B не удовлетворяет всем требованиям, необходимым для положительной модели васкулогенной мимикрии метастатической меланомы кожи.

Задачей настоящего изобретения является разработка положительной модели ВМ клеточной линии метастатической меланомы кожи человека, стабильно воспроизводящей сосудистоподобные структуры (СПС) in vitro и in vivo при имплантации иммунодефицитным мышам, дающей воспроизводимые результаты тестирования новых противоопухолевых веществ в краткосрочных тестах in vitro (до 24 часов), пригодной для скрининга противоопухолевых веществ и последующего изучения механизмов формирования ВМ.

Проведено изучение более 10 клеточных линий метастатической меланомы кожи человека для создания модели ВМ in vitro и in vivo. Оценивалась способность клеточных линий образовывать и сохранять не менее 24 часов СПС на Матригеле, формировать тубулярные структуры в долгосрочных тестах (до 3 недель), формировать опухоли при имплантации иммунодефицитным мышам, при морфологическом исследовании сформированных опухолей должны определяться признаки ВМ. Проведенные исследования показали, что только клеточная линия Mel Cher может быть использована в качестве положительной модели ВМ.

Данная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 704Д.

Клеточная линия метастатической меланомы кожи Mel Cher стабильно воспроизводит СПС in vitro при инкубации на матриксе базальных мембран (Матригель) в краткосрочных тестах. СПС формируются в течение 8 часов после нанесения клеток и сохраняются до 24 часов. Образованные структуры имеют вид упорядоченной сети, где клетки образуют соединенные между собой трубочки, повторяя поведение эндотелиальных клеток (Пример 2, Фиг.1а).

Инкубация клеток линии Mel Cher с противоопухолевыми веществами в разработанном краткосрочном тесте in vitro позволяет выявить вещества, блокирующие образование ВМ. В этом случае клетки, посаженные на Матригель, формируют либо короткие, незамкнутые трубочки, неограниченные контактами с другими трубочками, либо собираются в отдельные, не связанные друг с другом кластеры клеток (Пример 3, Фиг.1б).

Также клеточная линия меланомы кожи Mel Cher способна к формированию тубулярных структур в долгосрочных тестах (до 3 недель). Клетки инкубируются на матриксе базальных мембран (Матригель) или белках экстрацеллюлярного матрикса (коллаген, фибронектин) в высокой плотности в течение 3 недель. Формирование тубулярных структур начинается спустя три дня после посадки клеток и завершается к концу 3 недели (Пример 4, Фиг.2).

Проведен анализ экспрессии некоторых белков на клетках линии Mel Cher иммуноцитохимическим методом. Показано, что данная линия экспрессирует маркеры эндотелиальных клеток, что позволяет использовать ее для изучения механизмов ВМ (пример 5).

Показано, что при имплантации мышам 1-5 млн клеток Mel Cher наблюдается формирование опухолей в течение 20 дней (Пример 6, Фиг.3). При гистологическом исследовании срезов с парафиновых блоков удаленной опухоли показано, что в опухоли образуются PAS-положительные структуры (параллельные, параллельные с пересечением, арки и т.д.) (Фиг.4), характерные для опухолей человека [6]. Окрашивание реактивом Шиффа (PAS окрашивание) позволяет выделить базальные мембраны в ткани опухоли, характерные для кровеносных сосудов и каналов, ограниченных опухолевыми клетками (ВМ). Дополнительное двойное окрашивание антителами против CD34+ показало, что PAS-положительные структуры не ограничиваются только CD34- положительными кровеносными сосудами, что также свидетельствует о наличии ВМ внутри имплантированных опухолей. Характеристики роста опухолей и гистологические особенности опухоли сохранялись в 3 независимых экспериментах.

Родословная клеточной линии mel Cher

Линия клеток получена из опухолевого образца пациентки Ч.Н.О., и/б 98/10437, находившейся на лечении в 2003 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи спины. Материал получен из метастатического лимфатического узла. Предыдущее лечение: хирургическое, химиотерапия, иммунотерапия.

Получение клеточной линии mel Cher

Опухолевая ткань получена хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки mel Cher

Культура меланомы mel Cher имеет полиморфный клеточный состав и представлена клетками разных размеров и формы: вытянутой, удлиненной, отросчатой, веретеноообразной с тонкими длинными отростками разной длины, округлой, овальной и неправильной формы.

Цитоплазма клеток относительно обильная, негомогенная, окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности, иногда с розоватым оттенком и часто содержит значительное количество мелкозернистого пигмента меланина.

Ядра опухолевых клеток полиморфные, нормо- и гиперхромные с 1-3 ядрышками. Строение хроматина мелкозернистое или мелкоглыбчатое. В части клеток отмечаются почкование и фрагментация ядер.

Много уродливых гигантских многоядерных клеток округлой, вытянутой удлиненной, отросчатой и неправильной формы с центральным или периферическим расположением ядер. Встречаются также гигантские одноядерные и 2-х ядерные клетки. Часто выявляются митозы.

Кариологическая характеристика mel Cher

Культура характеризуется различающимися диаметрами ядер при одной и той же плотности окраски и состоянии хроматина, характерного для интерфазных ядер. Проанализировано 54 метафазы. Число хромосом в 39 клетках колеблется от 40 до 47 хромосом, что отражает диплоидный набор (2n). Наблюдаются множественные сложные перестройки; идентифицировать точки разрывов хромосом невозможно. 15 метафаз содержат от 64 до 80 хромосом. Модальное число хромосом в этих метафазах соответствует триплоидному набору (3n). В 13 клетках отмечаются хромосомные аберрации, преимущественно дицентрические хромосомы, хроматидные обмены, множественные аберрации. Следовательно, данная культура состоит по меньшей мере из двух линий клеток (диплоидных и триплоидных) и характеризуется высокой хромосомной изменчивостью.

Примеры использования клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel Cher

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 15 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Формирование СПС клеточной линией mel Cher в краткосрочных тестах in vitro

Клетки снимались раствором Версена, откручивались в течение 5 минут в чистой среде RPMI, подсчитывалось количество клеток в 1 мл в камере Горяева. Матригель (+4°С) был нанесен на дно лунок 24-луночной плоскодонной плашки в количестве 100 мкл на льду (для исключения кристаллизации геля), в последующем 24-луночная плашка помещалась в инкубатор с температурой 37°С на 20 минут. Клетки добавляли в количестве 200 тысяч на одну лунку в 10% среде RPMI. Результат оценивали через 16 и 24 часа. Клеточная линия mel Cher формировала сеть, состоящую из вытянутых в форме трубочек клеток, занимающую всю поверхность матригеля в лунке. Сеть сохранялась более 24 часов (Фиг.1а).

Пример 3. Использование клеточной линии mel Cher для скрининга лекарственных препаратов, направленных на ингибирование ВМ in vitro и механизмов процесса ВМ

Клетки снимались раствором Версена, откручивались в течение 5 минут в чистой среде RPMI, подсчитывалось количество клеток в 1 мл в камере Горяева. Клеточная линия Mel Cher рассеивалась на 12-луночную плашку в количестве 100 тысяч на 1 лунку в 1 мл 10% среды RPMI, плашка помещалась в инкубатор на 24 часа. Через 24 часа исходная среда осторожно убиралась, а среда с тестируемыми веществами в наибольшей нецитотоксической концентрации добавлялась во все лунки, кроме контрольных. Плашка снова помещалась в инкубатор на 1 час или на 24 часа. Далее среда с тестируемыми веществами осторожно убиралась пипетированием, к клеткам в каждую лунку добавлялся раствор Версена на несколько минут для открепления от пластика, клетки откручивались. Матригель (+4°С) был нанесен на дно лунок 24-луночной плоскодонной плашки в количестве 100 мкл на льду (для исключения кристаллизации геля), в последующем 24-луночная плашка помещалась в инкубатор с температурой 37°С на 20 минут. Далее клетки вместе со средой, содержащей тестируемое вещество, наносились на 24-луночную плашку с готовым заполимеризованным матригелем. Плашка помещалась в инкубатор. Результат по сравнению с положительным контролем оценивался через 16 и 24 часа.

В качестве тестируемого вещества могут быть использованы лекарственные противоопухолевые препараты или блокаторы белков и генов в опухолевых клетках, которые могут участвовать в молекулярных механизмах формирования ВМ.

Вещество оценивалось как блокирующее ВМ, если через 24 часа не наблюдалось формирование СПС. Клетки могут формировать либо короткие, незамкнутые трубочки, неограниченные контактами с другими трубочками, либо собираются в отдельные, не связанные друг с другом кластеры клеток (Фиг.1б).

Пример 4. Формирование СПС клеточной линией mel Cher в долгосрочных тестах in vitro

Инкубация клеток на Матригеле. Клетки снимались раствором Версена, откручивались в течение 5 минут в чистой среде RPMI, подсчитывалось количество клеток в 1 мл в камере Горяева. Матригель (+4°С) наносился на покровное стекло размером 24×24 мм в количестве 150 мкл на льду (для исключения кристаллизации геля), в последующем покровное стекло в чашке Петри помещалось в инкубатор с температурой 37°С на 20 минут. Клетки культуры подготавливались и подсчитывались известным способом, наносились в количестве 500 тысяч на покровное стекло. После добавления клеток ждали 20 минут до их прикрепления к матриксу, потом в чашку Петри добавляли 10% среду RPMI в количестве 12 мл, и она помещалась в инкубатор. Результат оценивался на 3, 7, 14 и 21 дни. Клеточная линия melCher образовывала тубулярные структуры, представляющие собой упорядоченные структуры из клеток трехмерной конфигурации (Фиг.2).

Инкубация клеток на фибронектине. Фибронектин разводился в 10 мл стерильного PBS. Для приготовления рабочей концентрации первоначально исходный раствор фибронектина разводился еще в 10 раз и наносился в количестве 2 мл на покровное стекло, чашку Петри с покровным стеклом помещали в инкубатор на 30-40 минут. Затем по истечении этого времени незаполимеризовавшийся фибронектин осторожно убирался пипеткой. Клетки меланомы кожи в количестве 500 тысяч помещались на подготовленный матрикс, ждали 20 минут до прикрепления и добавляли 12 мл 10% среды RPMI. Результат оценивался на 3, 7, 14 и 21 дни. Клеточная линия melCher образовывала тубулярные структуры, представляющие собой упорядоченные структуры из клеток трехмерной конфигурации.

Пример 5. Молекулярно-биологическая характеристика клеточной линии Mel Cher.

Клеточная линия mel Cher с помощью методов иммуноцитохимии была исследована на различные антигены.

Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител к CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinase, HMW (табл.1).

Таблица 1 Экспрессия дифференцировочных антигенов на клеточной линии mel Cher. Дифференцировочные антигены CD63 Экспрессируется НМВ45 Экспрессируется MelanA Не экспрессируется Tyros Экспрессируется HMW Экспрессируется

Проведено исследование экспрессии молекулярно-биологических маркеров, участвующих в ангиогенезе, с помощью моноклональных антител к VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, VIII as ag и Laminin 5 gamma 2 (Табл.2 и 3).

Таблица 2 Определение экспрессии основного сосудистого фактора VEGF и рецепторов к нему на клеточной линии mel Cher. VEGF и его рецепторы VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) Экспрессируется VEGFR1 (рецептор I типа) Экспрессируется VEGFR2 (рецептор II типа) Экспрессируется

Таблица 3 Экспрессия маркеров эндотелиальных клеток на клеточной линии mel Cher. Маркеры эндотелиальных клеток VIII as.ag Экспрессируется Laminin 5 gamma 2 Экспрессируется CD34 Не экспрессируется CD31 Не экспрессируется

Таким образом, клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов (CD63, HMW, HMB45, Tyrosinase). Эта клеточная линия экспрессирует ростовые факторы, такие как VEGF, VEGF рецепторы I, II типов, маркеры ЭК, такие как VIII as.ag., Laminin 5 gamma 2.

Пример 6. Формирование структур ВМ in vivo при имплантации клеточной линии mel Cher иммунодефицитным мышам

Для проведения эксперимента клетки метастатической меланомы кожи mel Cher перевивались иммунодефицитным мышам в количестве 1-5 млн клеток подкожно. Динамика роста перевиваемых опухолей оценивалась каждые 3 дня, начиная с 7 дня после перевивки. Размеры опухоли, а именно объем опухоли, определяли как отношение ширины к длине и на половину ширины. Эксперимент завершали на 21 день, все опухоли были заключены в парафиновые блоки для дальнейшего проведения иммуногистохимического исследования.

PAS-окрашивание на базальные мембраны выявило наличие параллельных, параллельных с пересечением каналов и арок в ткани опухоли (Фиг.4). В имплантированных опухолях при проведении комбинированного окрашивания на сосуды CD34+ (разведение 1:50) с последующим PAS-окрашиванием на базальные мембраны были определены структуры ВМ.

Технический результат состоит в том, что клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher может быть использована в качестве положительной модели васкулогенной мимикрии.

Список литературы

1. Miller KD, Sweeney SJ, Sledge GW. The Snark is a Boojum: the continuing problem of drug resistance in the antiangiogenic era. // Annals of Oncology. - 2003. V.14 - P.20-28.

2. Степанова Е.В., Вартанян А.А., Личиницер М.Р. // Васкулярная мимикрия при злокачественных образованиях. // Молекулярная медицина. - 2006. - №1.

3. Maniotis A., Folberg R., Hess A. et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. // Am. J.Pathol. - 1999. - Vol.55 - P.739-752.

4. Warso M.A., Maniotis A.J., Chen X. et al. Prognostic significance of periodic acid-schiff-positive patterns in primary cutaneous melanoma. // Clin. Cancer Res. - 2001. - Vol.7 - P.473-477.

5. Folberg, R., Hendrix, М.J., and Maniotis, A.J. Vasculogenic mimicry and tumor angiogenesis. // Am. J. Pathol. - 2000. - Vol.156. - P.361-381.

6. Donovan D., Brown N.J., Bishop E.T., et al. Comparison of three in vivo human angiogenesis assays with capillaries formed in vivo. // Angiogenenesis. - 2001. - Vol.4. - P.113-121.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию опухолевых моделей, и может быть использовано для изучения механизмов канцерогенеза и скрининга противоопухолевых препаратов. Клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции клеточных культур института Цитологии РАН под номером РККК (П) 704Д. Клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher экспрессирует ростовые факторы, такие как VEGF, VEGF рецепторов I и II типов, маркеры эндотелиальных клеток, такие как VIII as.ag., Laminin 5 gamma 2. Полученная клеточная линия способна стабильно воспроизводить процесс васкулогенной мимикрии in vitro и in vivo. 4 ил., 3 табл.

Применение клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher в качестве положительной модели васкулогенной мимикрии.