Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr EEMC, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы Российский патент 2017 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы.

Иммунотерапия является одним из способов лечения онкологических заболеваний. Принцип данного способа основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для разработки иммунологических подходов в лечении опухолевых заболеваний.

Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково-тестикулярные антигены (MAGE и др.), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1 и др.), мутированные антигены. С иммунологической точки зрения мишенями для иммунотерапии опухолей могут быть раково-тестикулярные антигены, так как в нормальных тканях эта группа антигенов не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы. В отличие от раково-тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности иммунной системы к этим «своим» антигенам. Однако некоторые дифференцировочные антигены содержат эпитопы для узнавания цитотоксическими лимфоцитами и способны индуцировать генерацию меланомаспецифических цитотоксических лимфоцитов.

Задачей настоящего изобретения является получение новой клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr EEMC с определенным набором антигенов для разработки иммунологических подходов в лечении злокачественных опухолей.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий для разработки иммунологических подходов в лечении злокачественных опухолей.

Поставленная задача решается тем, что получена клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС из клеточной линии mel Ibr меланомы кожи человека (патент РФ №2287576).

Заявляемая клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157.

Родословная клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получена из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров - CD63, HMW, а также раково-тестикулярного маркера MAGE-3, наличием антигенов гистосовместимости I и II класса (патент РФ №2287576).

Получение клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Для получения клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС клетки родительской линии меланомы кожи человека mel Ibr культивировали в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки в течение трех пассажей, затем рассеивали на чашки Петри диаметром 60 мм в количестве 200-400 клеток на чашку (в дубликатах) и культивировали в такой же ростовой среде с однократным добавлением 2% эмбрионального экстракта. Смену ростовой среды проводили 1 раз в 3 дня. Через 7-10 дней наблюдали образование единичных колоний из клеток веретенообразной формы. Спустя 14 дней колонии снимали раствором Версена и переносили в культуральный флакон 25 см³ с ростовой средой для дальнейшего культивирования и наращивания. Культуру, прошедшую 20 пассажей, помещали в среду Methocult-GI Н4434 в чашках Петри диаметром 230 мм. Клетки рассеивали в количестве 200 тыс. на чашку и оставляли на рост в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 10-14 дней. Далее клетки культивировали для наращивания в культуральных флаконах 25 см³ с ростовой средой. Культура клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС росла в виде колоний, состоящих из клеток веретенообразной формы.

Морфологические признаки клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Культура клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС мономорфная, представлена клетками разных форм: вытянутой, веретенообразной с двумя тонкими отростками разной длины. Цитоплазма клеток необильна, окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности. Ядра опухолевых клеток крупных размеров, гиперхромные с 1-3 ядрышками. Клетки соединяются в монослой с образованием сфероидов на его поверхности. По морфологическим признакам клеточная линия низкодифференцированная.

Кариологическая характеристика клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Проанализировано 20 метафаз. Число хромосом колеблется от 77 до 84. Модальное число хромосом соответствует гипотетраплоидному набору (4n-). Обнаружены следующие структурные перестройки: дериватная хромосома 9, образованная транслокацией 1 и 9 хромосом; делеция короткого плеча хромосомы 6 (p21-pter), а также дериватная хромосома 6, образовавшаяся в результате терминальной делеции короткого плеча хромосомы 6 (p12-pter) и дупликацией части длинного плеча хромосомы 6.

Кариотип - 77~84<4n->,XXX,-X,del(6)(p21),?der(6)del(6)(pl2)dup(6)(q?q?),

der(9)t(1;9)(q12;p21),inc.

Постоянные маркеры от m1 до m9.

Культуральные свойства клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС культивируется в питательной среде RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамина, 5% ТЭС (телячья эмбриональная сыворотка HyClone, США), 1% HEPES, антибиотиков - пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab). Для выращивания культуры используют пластиковые культуральные флаконы (Costar). Во флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°C и 5% CO₂. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Метод снятия: 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1.

Условия криоконсервации клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из 80% питательной среды RPMI-1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°C в минуту до минус 25°C, затем быстрое замораживание до минус 70°C. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°C. Размораживание быстрое, при температуре 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см³. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Полученная клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлуоресценции, иммуногистохимии, полимеразной цепной реакции (ПЦР) была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости).

Дифференцировочные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD133, CD105, CD44. Раково-тестикулярный маркет-MAGE-3, который может быть экспрессирован на опухолях различного гистогенеза, исследован с помощью ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлуоресценции.

Изобретение иллюстрируется таблицей.

В таблице представлена экспрессия антигенов на клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС. Заявляемая клеточная линия характеризуется наличием антигенов гистосовместимости I класса (HLA-ABC - положит.) и отсутствием антигенов II класса (HLA-DR - отр.) и экспрессией дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44, указывающих на специфичность данной клеточной линии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, и может быть использовано в медицине. Клеточную линию меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получают из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157. Изобретение позволяет получить клеточную линию меланомы кожи человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и характеризуется экспрессией антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса. 1 табл.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr EEMC, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, характеризуется наличием антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса; хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157.