СПОСОБ ПОДБОРА ВЫСОКОАКТИВНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ПАТОГЕННЫМИ БУРКХОЛЬДЕРИЯМИ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается подбора высокоактивных антибактериальных средств для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями.

Известно, что использование антибактериальных препаратов, достаточно активных in vitro в отношении патогенных микроорганизмов, в том числе и буркхольдерий (В. mallei, В. pseudomallei), в ряде случаев оказывается неэффективным при лечении вызываемых ими заболеваний. Этот феномен связывают с различными факторами, проявляющимися в процессе взаимодействия микроорганизма с антибиотиками в условиях in vivo: постантибиотическим эффектом, повышением антибиотикоустойчивости бактерий при формировании биопленки, наконец, прямым воздействием физико-химических факторов внутренней среды макроорганизма, существенно влияющих на характер взаимодействия антибиотиков с патогенным микроорганизмом.

В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферментирующих бактерий, подавляющее большинство которых является свободноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеют значение 2 вида патогенных буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei. Они являются возбудителями особо опасных инфекционных заболеваний - сапа и мелиоидоза. Заболевания, вызванные патогенными буркхольдериями, требуют длительной интенсивной химиотерапии, так как эти микробы устойчивы к широкому спектру химиопрепаратов, а в процессе многодневного введения антибиотиков часто селекционируются устойчивые культуры возбудителей, чем и объясняются проблемы подбора препаратов для эффективной химиотерапии. В работе Corkill J.E., Deveney J., Pratt J. Effect of pH and СО₂ on in vitro susceptibility of Pseudomonas cepacia to beta-lactams // Pediatr. Res. - 1994. - Vol.35. - N.3. - P.299-302 изучалось влияние рН среды и углекислого газа на чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам.

Наиболее близким аналогом подбору высокоактивного антибактериального средства для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями, является работа по изучению влияния физико-химических факторов (температуры, рН среды) на чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам (Илюхин В.И., Батманов В.П. Влияние температуры и рН среды на чувствительность патогенных псевдомонад к химиопрепаратам. - Антибиотики. - 1997. - №4 - С.21-23). Однако в вышеуказанных работах изучалось только влияние физико-химических факторов на чувствительность микроорганизмов к различным химиопрепаратам, вне какой-либо связи с эффективностью антибактериальных препаратов in vivo. Наша модификация постановки опытов по оценке антибактериальной чувствительности позволяет по уровню снижения чувствительности буркхольдерий к антибактериальным препаратам высказать предположение об эффективности тех или иных химиопрепаратов при лечении заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями.

Целью изобретения является подбор эффективного антибактериального средства для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями. Поставленная цель достигается за счет установления влияния на МПК условий постановки опытов, моделирующих характер взаимодействия препаратов с микробами in vivo. Для этого исследуемую культуру В. pseudomallei или В. mallei в дозе 10⁴ м.к. засевают на среду Muller Hinton, добавляют диски с антибактериальными средствами, обычно применяемые для лечения острых форм сапа и мелиоидоза (цефтазидим, меропенем, ципрофлоксацин, доксициклин, рифампицин, хлорамфеникол, ко-тримоксазол) и культивируют при 37°С в течении 24 ч в обычных условиях и параллельно эти же концентрации исследуемых культур засевают на среду Muller Hinton с добавлением 10% свежей гепаринизированной крови лабораторных животных (высокочувствительных к сапу и мелиоидозу золотистых хомячков), наносят стандартные бумажные диски, пропитанные вышеуказанными антибактериальными средствами, и культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂, в течение 24 ч, после чего проводят учет чувствительности исследуемой культуры микроорганизма к антибактериальному средству согласно прилагаемой инструкции путем измерения зон задержки роста микроба вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска говорит о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибактериальному средству. Если диаметр зоны задержки роста бактерий превышает величину, указанную в проспектах к фирменным дискам, то штамм оценивается как чувствительный к данному антибактериальному средству. При этом показателем падения активности (неэффективности) антибактериального средства является существенное, достоверное уменьшение зоны задержки роста на среде Muller Hinton, содержащей 10% крови лабораторных животных и культивируемой в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, по сравнению с опытом, проводимом в обычных условиях, и одновременно определяют сравнительную эффективность препаратов в опытах по лечению экспериментальных животных.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Чувствительность культур к химиопрепаратам определяли на среде Muller Hinton («Himedia») - диско-диффузионным методом со стандартными бумажными дисками диаметром 6 мм («Himedia»). Постановка опытов и учет результатов соответствовали общепринятым стандартам. Параллельно чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам определяли на среде Muller Hinton с добавлением свежей гепаринизированной (гепарин «Richter», 5 МЕ/мл) крови (10%) золотистых хомячков в атмосфере, содержащей 5% CO₂ (CO₂ инкубатор Forma scientific). В таблице 1 показано, что практически во всех случаях резистентность буркхольдерий к препаратам в модифицированных условиях повышалась, особенно заметное снижение чувствительности буркхольдерий в этих условиях отмечается в постановке опытов с рифампицином. Зона задержки роста упала до 8 мм, превысив уровень показателя резистентности штаммов (<14 мм). В то же время размер зоны задержки роста штаммов ко-тримоксазолом и при модификации постановки опыта существенно превышал стандарт показателя чувствительности к данному препарату, составляя величину в пределах 28-33 мм при показателе чувствительности >16 мм. Объяснение этому явлению двоякое - с одной стороны в условиях повышенного содержания СО₂ падает рН среды и снижается эффективность действия некоторых групп антибактериальных препаратов, с другой - добавление крови (10%) лабораторных животных к среде Muller Hinton повышает ее ростовые свойства. В опытах показано, что при высеве на модифицированную среду взвеси 10⁴ м.к. буркхольдерий в среднем на 20% повысилось количество колоний и их размер при учете на 2-3 сут после высева.

Пример 2. Для заражения лабораторных животных была избрана равноэффективная доза, соответствующая 10³ ЛД₅₀. Лечение химиопрепаратами начинали через 24 ч после инфицирования. Лечебные дозы, учитывая более интенсивный уровень метаболизма и высокий коэффициент соотношения площади поверхности к массе тела у лабораторных животных по сравнению с человеком, были несколько выше рекомендуемых для лечения людей. Из отобранных препаратов для лечения высокочувствительных к сапу и мелиоидозу золотистых хомячков наиболее эффективным оказался ко-тримоксазол, достоверно снизивший уровень летальности при заражении В. mallei 10230 и существенно увеличивший продолжительность жизни павших животных при обеих инфекциях (таблица 2). Наименее эффективным оказался рифампицин. Эффективность препаратов коррелирует с уровнем снижения их чувствительности в опытах по определению МПК с добавлением к среде Muller Hinton 10% крови золотистых хомячков в атмосфере 5% СО₂ (таблица 1). Вполне перспективными препаратами при лечении сапа оказались ципрофлоксацин и доксициклин, которые, однако, при мелиоидозной инфекции не предотвращали летальность животных, но достоверно увеличивали их продолжительность жизни.

На основании полученных данных видно, что оценка чувствительности патогенных культур к набору антибиотиков в стандартных условиях не может служить единственным определяющим фактором при назначении набора препаратов для лечения инфекций, вызванных патогенными буркхольдериями. Во многом на эффективность терапии влияет характер инфекционного процесса у конкретного макроорганизма, скорость и форма сформировавшегося патологического процесса. Таким образом, благодаря предлагаемому способу путем создания условий, максимально приближенных к процессу, происходящему в конкретном макроорганизме, можно более точно определить, какое антибактериальное средство эффективно для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями. В условиях in vitro для оценки эффективности химиопрепаратов против буркхольдерий желательно воспроизвести условия, моделирующие характер взаимоотношений in vivo, a именно добавив к среде Muller Hinton 10% крови золотистых хомячков в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Таблица 1 Изменения чувствительности буркхольдерий на среде Muller Hinton после добавления 10% крови золотистых хомячков в атмосфере 5% СО₂ Антибиотики С <R->S Штаммы В. mallei 10230 B. pseudomallei C 141 K з.х K з.х. Цефтазидим 30 14-18 27 20* 25 20* Меропенем 10 13-16 33 22* 30 20* Ципрофлоксацин 5 16-24 30 22* 30 25* Доксициклин 10 12-16 30 25 25 20* Рифампицин 30 14-19 20 8* 12 8* Хлорамфеникол 30 12-18 30 30 28 25 Ко-тримоксазол 25 10-16 35 33 30 28 Примечания: С - содержание препарата в диске (мкг); <R->S - зона оценки резистентности (R), чувствительности (S) буркхольдерий к данному препарату; цифровой материал зон задержки роста выражен в мм; K - контроль - зона задержки роста на среде Muller Hinton; з.х. - зоны задержки роста на среде Muller Hinton с добавлением 10% крови золотистых хомячков в атмосфере 5% СО₂; цифры - медиана 5 опытов; * - достоверность различия показателя с контролем превышает 95% (р<0,05).

Таблица 2 Эффективность химиотерапии экспериментального сапа и мелиоидоза у золотистых хомячков Препараты Доза, мг/кг/сут Штамм заражения Л Т Штамм заражения Л Т Цефтазидим 120 B. mallei 10230 10⁴ м.к 10/10 7,5 B. pseudomallei C 141 10⁴ м.к. 10/10 7,0 Меропенем 50 10/10 6,5 10/10 6,2 Ципрофлоксацин 50 4/10* 14,2* 8/10 15,5* Доксициклин 50 5/10* 16,5* 10/10 18* Рифампицин 50 10/10 15,5* 10/10 5 Хлорамфеникол 80 10/10 6,2 10/10 5 Ко-тримоксазол 100 2/10* 8,5 7/10 30* Контроль - 10/10 5,2 10/10 4,0 Примечания: Л - летальность среди зараженных животных, где числитель - количество павших, знаменатель - общее число зараженных; Т - средняя продолжительность жизни павших животных в сутках; * - достоверность различия показателя с контролем превышают 95% (р<0,05).

Изобретение касается подбора эффективного антибактериального средства для лечения сапа и мелиоидоза. Сущность способа сводится к тому, что исследуемую культуру В. pseudomallei или В. mallei в дозе 10⁴ м.к. засевают на среду Muller Hinton, добавляют диски, обычно применяемые для лечения острых форм мелиоидоза и сапа (цефтазидим, меропенем, ципрофлоксацин, доксициклин, рифампицин, хлорамфеникол, ко-тримоксазол) и культивируют при 37°С в течение 24 ч. Параллельно эти же концентрации исследуемых культур засевают на ту же среду с добавлением 10% крови лабораторных животных - золотистых хомячков, наносят диски и культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂, в течение 24 ч, после чего проводят учет результатов. Показателем эффективности антибактериального средства является сохранение активности в условиях, приближенных к in vivo, на уровне показателей роста бактерий в стандартных условиях, при этом зона задержки роста существенно превышает показатель чувствительности бактерий к данному антибактериальному средству. Одновременно определяют сравнительную эффективность препаратов в опытах по лечению экспериментальных животных. Изобретение позволяет более точно определить, какое антибактериальное средство эффективно для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ подбора высокоактивного антибактериального средства для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями, включающий посев исследуемой культуры микроорганизма и последующее определение чувствительности по зонам задержки роста, отличающийся тем, что исследуемую культуру B. pseudomallei или В. mallei в дозе 10⁴ м.к. засевают на среду Muller Hinton, добавляют диски с антибактериальными средствами и культивируют при 37°С в течение 24 ч в обычных условиях и параллельно эти же концентрации исследуемых культур засевают на среду Muller Hinton с добавлением 10% свежей гепаринизированной крови лабораторных животных, наносят диски с антибактериальным средством и культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂, в течение 24 ч, при учете чувствительности исследуемых культур микроорганизма к антибактериальному средству, наиболее эффективными препаратами являются те, что в условиях, приближенных к in vivo, сохраняют свою активность на уровне показателей в стандартных условиях постановки, при этом зона задержки роста существенно превышает показатель чувствительности бактерий к данному антибиотику, и для контроля правильности подбора препаратов одновременно определяют их сравнительную эффективность в опытах по лечению зараженных животных.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что контроль активности исследуемых антибактериальных средств осуществляют на лабораторных животных, зараженных бактериальной суспензией в дозе 10³ ЛД₅₀ и через 24 ч после инфицирования проводят лечение теми же антибактериальными средствами, которые одновременно исследуют диско-диффузионным методом, показатель эффективности препаратов (летальность и продолжительность жизни экспериментальных животных) коррелирует с эффективностью препаратов в модифицированных условиях, приближенных к in vivo.